Жидкая композиция полипептидов фактора vii

Жидкая композиция полипептидов фактора vii

Реферат

Настоящее изобретение относится к жидким композициям, содержащим полипептиды фактора VII, и к способам получения таких композиций. Конкретнее, данное изобретение относится к жидким композициям, стабилизированным против химического и/или физического разрушения.

Идентифицирован ряд факторов, участвующих в процессе свертывания крови, в том числе, фактор VII (FVII) - гликопротеин плазмы. Гемостаз инициируется образованием комплекса между тканевым фактором (TF), появляющимся в кровотоке после повреждения стенки сосуда, и FVIIa, который присутствует в кровотоке в количестве, соответствующем примерно 1% от общей массы белка FVII. FVII существует в плазме, главным образом, в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется FXa до двухцепочечной активированной формы FVIIa. В качестве прогемостатического агента разработан рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa). Введение rFVIIa вызывает быструю и высокоэффективную прогемостатическую реакцию у субъектов с гемофилией с кровотечениями, которых нельзя лечить другими продуктами факторов свертывания из-за образования антител. Также FVIIa можно успешно лечить кровотечения у субъектов с дефицитом фактора VII или субъектов с нормальной системой свертывания, но испытывающих избыточное кровотечение.

Желательно иметь формы для введения фактора VIIa, подходящие как для хранения, так и для доставки. В идеале, лекарственное средство хранят и вводят в виде жидкости. С другой стороны, лекарственное средство лиофилизуют, т.е. сушат вымораживанием, и затем восстанавливают путем добавления подходящего разбавителя непосредственно перед применением к пациенту. В идеале, лекарственное средство имеет достаточную устойчивость для того, чтобы сохраняться при длительном хранении, т.е. свыше шести месяцев.

Решение, хранить ли готовое лекарственное средство в виде жидкости или высушивать его вымораживанием, как правило, основывается на устойчивости белкового лекарственного средства в таких формах. На устойчивость белка, среди прочего, могут влиять такие факторы, как ионная сила, рН, температура, повторяющиеся циклы замораживание/оттаивание и воздействие усилий сдвига. Активный белок можно утратить в результате физических видов неустойчивости, в том числе денатурации и агрегации (образования как растворимых, так и нерастворимых агрегатов), а также химических видов неустойчивости, в том числе, например, гидролиза, деамидирования и окисления, как нескольких факторов. Для общего представления об устойчивости фармацевтических препаратов см., например, Manning et al., Pharmaceutical Research, 6:903-918 (1989).

Хотя возможные случаи неустойчивости белков хорошо известны, невозможно предсказать частные проблемы неустойчивости конкретного белка. Любой тип неустойчивости может привести к образованию побочного белкового продукта или производного с пониженной активностью, повышенной токсичностью и/или повышенной иммуногенностью. Действительно, осаждение белка может привести к тромбозу, неоднородности лекарственной формы и количества, а также к засорению шприцов. Кроме того, посттрансляционные модификации, такие как, например, гамма-карбоксилирование некоторых остатков глутаминовой кислоты в N-конце и добавление углеводных боковых цепей, создают возможные сайты, которые могут быть чувствительны к модификации после хранения. Также, специфично для фактора VIIa, являющегося серинпротеазой, может происходить фрагментация из-за автокатализа (ферментативное расщепление). Таким образом, безопасность и эффективность любой белковой композиции непосредственно связана с его устойчивостью. Поддержание устойчивости в жидкой форме, как правило, отличается от лиофилизованной формы из-за существенно повышенной возможности движения молекул и, следовательно, повышенной вероятности молекулярных взаимодействий. Поддержание устойчивости в концентрированной форме также отличается из-за склонности к образованию агрегатов при повышенных концентрациях белка.

При разработке жидкой композиции в расчет принимают многие факторы. Кратковременная, т.е. менее шести месяцев, устойчивость жидкости, как правило, зависит от того, насколько удается избежать явных структурных изменений, таких как денатурация и агрегация. Такие способы описаны в литературе для многих белков, и существует множество примеров стабилизаторов. Хорошо известно, что агент, эффективный в качестве стабилизатора для одного белка, фактически действует как дестабилизатор для другого. Как только белок стабилизирован против явных структурных изменений, разработка жидкой композиции с длительной устойчивостью (т.е. свыше шести месяцев) зависит от дальнейшей стабилизации белка от типов разрушения, специфических для данного белка. Более специфическими типами разрушения могут являться, например, выравнивание дисульфидной связи, окисление некоторых остатков, циклизация. Хотя отдельные виды разрушения не всегда можно точно указать, разработаны анализы для контроля за едва различимыми изменениями с тем, чтобы контролировать возможность конкретных эксципиентов стабилизировать исключительно белок, представляющий интерес.

Кроме соображений устойчивости, как правило, выбирают эксципиенты, одобренные различными всемирными медицинскими контролирующими учреждениями. Желательно, чтобы рН композиции после инъекции/инфузии находился в физиологически подходящем интервале, иначе результатом для пациента может являться боль и дискомфорт.

Для общего представления о белковых композициях см., например, Cleland et al., The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1993, 10(4):307-377; и Wang et al., Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, 1988 (Supplement), 42(25).

Другие публикации, рассматривающие представляющую интерес стабилизацию белков, перечислены далее.

В патенте США 20010031721 А1 (American Home Products) относится к высококонцентрированным, лиофилизованным и жидким композициям фактора IX.

В патенте США 5770700 (Genetics Institute) относится к жидким композициям фактора IX.

WO 97/19687 (American Red Cross) относится к жидким композициям белков плазмы, в частности фактора VIII и фактора IX.

В патенте США 4297344 описывется стабилизация факторов свертывания II и VIII, антитромбина III и плазминогена против действия тепла путем добавления выбранных аминокислот, таких как глицин, аланин, гидроксипролин, глутамин и аминомасляная кислота, и углевода, такого как моносахарид, олигосахарид или сахарный спирт.

Фактор VIIa претерпевает каскад некоторых реакций разрушения, в особенности агрегацию (димеризацию), окисление и автокаталитическое расщепление (разрезание главной цепи пептида). Кроме того, может происходить осаждение. Многие из таких реакций могут существенно замедляться удалением воды из белка. Однако разработка водной композиции для фактора VIIa имеет преимущества устранения ошибок восстановления, причем за счет этого возрастает точность дозировки, а также простота клинического применения продукта, за счет чего повышается податливость пациента лечению. В идеале композиции фактора VIIa должны быть устойчивы на протяжении более 6 месяцев в широком интервале концентраций белка. Это создает гибкость в отношении способов введения. Как правило, более концентрированные формы позволяют вводить меньшие объемы, что весьма желательно с точки зрения пациентов. Жидкие композиции могут иметь ряд преимуществ перед продуктами, высушенными вымораживанием, с точки зрения легкости введения и применения.

В настоящее время единственной коммерчески доступной композицией с полученным рекомбинантным способом полипептидом FVII является высушенный вымораживанием продукт с фактором FVIIa, который восстанавливают перед применением; он содержит относительно низкую концентрацию фактора VIIa, например, примерно 0,6 мг/мл. Флакон (1,2 мг) NovoSeven^â (Novo Nordisk, A/S, Дания) содержит 1,2 мг реакомбинантного человеческого фактора VIIa, 5,84 мг NaCl, 2,94 мг CaCl₂ ^.2Н₂О, 2,64 мг GlyGly, 0,14 мг полисорбата 80 и 60,0 мг маннита; его восстанавливают до рН 5,5 2,0 мл воды для инъекций (WFI). При восстановлении раствор белка устойчив для применения в течение 24 часов. Таким образом, на сегодняшний день не имеется коммерчески доступных готовых для применения жидких или концентрированных продуктов с фактором VII.

Соответственно, в данной области существует потребность в улучшении устойчивости полипептидов фактора VII, в том числе, человеческого фактора VIIa (химической и/или физической устойчивости), повышении концентрации, сохранении уровней активности и обеспечении жидкими композициями, подходящими для хранения. Таким образом, целью данного изобретения является водная композиция полипептида фактора VIIa, которая предусматривает приемлемое регулирование продуктов химического и/или физического разрушения, таких как продукты ферментативного расщепления или автокатализа.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение показывает, что фактор VII или его аналоги (“полипептиды фактора VII”), введенные в композицию вместе с буферным агентом и солью кальция или магния или их смесью в концентрации по меньшей мере 15 мМ, устойчивы в интервале рН от примерно 4 до примерно 8.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к жидкой водной композиции, содержащей (i) полипептид фактора VII, (ii) вещество, подходящее для поддержания рН в интервале от примерно 4 до примерно 8, и (iii) вещество, выбранное из перечня, в который входят кальциевая соль, магниевая соль или их смесь, где концентрация (iii) составляет по меньшей мере 15 мМ.

В разных воплощениях вещество (iii) присутствует в концентрации по меньшей мере примерно 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ, 400 мМ, 800 мМ, 900 мМ или по меньшей мере 1000 мМ.

В другом воплощении композиция также содержит (iv) модификатор ионной силы.

В разных воплощениях модификатор ионной силы (модификатор), выбирают из нейтральной соли, например, хлорида натрия, аминокислоты или короткого пептида, или смеси по меньшей мере двух из указанных модификаторов. В предпочтительном воплощении модификатором ионной силы является хлорид натрия.

В разных воплощениях вещество (iv) присутствует в концентрации по меньшей мере примерно 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ, 400 мМ, 800 мМ, 1000 мМ, 1200 мМ, 1500 мМ, 1800 мМ, 2000 мМ или по меньшей мере 2200 мМ.

В одном ряду воплощений вещество (iii) (кальциевая и/или магниевая соль) присутствует в концентрации от примерно 15 мМ до примерно 1000 мМ, например от примерно 25 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 300 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 500 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 1000 мМ, от примерно 700 мМ до примерно 1000 мМ; от примерно 15 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 300 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 800 мМ, от примерно 500 мМ до примерно 800 мМ; от примерно 15 мМ до примерно 600 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 600 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 600 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 600 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 600 мМ, от примерно 300 мМ до примерно 600 мМ; от примерно 15 мМ до примерно 400 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 400 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 400 мМ или от примерно 100 мМ до примерно 400 мМ.

В одном ряду воплощений вещество (iv) (модификатор ионной силы) присутствует в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 2200 мМ, например от примерно 25 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 1200 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 1400 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 1600 мМ до примерно 2200 мМ, от примерно 1800 мМ до примерно 2200 мМ или от примерно 2000 мМ до примерно 2200 мМ; от примерно 5 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 1200 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 1400 мМ до примерно 1800 мМ, от примерно 1600 мМ до примерно 1800 мМ; от примерно 5 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 1400 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 1500 мМ, от примерно 1200 мМ до примерно 1500 мМ; от примерно 5 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 25 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 1200 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 1200 мМ или от примерно 800 мМ до примерно 1200 мМ.

В одном предпочтительном воплощении общая концентрация веществ (iii) и (iv) составляет от примерно 50 мМ до примерно 2500 мМ, например от примерно 100 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 1200 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 1400 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 1600 мМ до примерно 2500 мМ, от примерно 1800 мМ до примерно 2500 мМ или от примерно 2000 мМ до примерно 2500 мМ; от примерно 50 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 1200 мМ до примерно 2000 мМ, от примерно 1400 мМ до примерно 2000 мМ или от примерно 1600 мМ до примерно 2000 мМ; от примерно 50 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 200 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 400 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 600 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 800 мМ до примерно 1600 мМ, от примерно 1000 мМ до примерно 1600 мМ или от примерно 1200 мМ до примерно 1600 мМ.

В одном воплощении вещества (iii) и (iv) присутствуют в концентрациях от примерно 600 мМ до примерно 800 мМ (iii) и от примерно 0 мМ до примерно 5 мМ (iv); в другом воплощении вещества (iii) и (iv) присутствуют в концентрациях от примерно 300 мМ до примерно 500 мМ (iii) и от примерно 1100 мМ до примерно 1300 мМ (iv); в другом воплощении вещества (iii) и (iv) присутствуют в концентрациях от примерно 100 мМ до примерно 300 мМ (iii) и от примерно 1500 мМ до примерно 1900 мМ (iv); и в еще одном воплощении вещества (iii) и (iv) присутствуют в концентрациях от примерно 50 мМ до примерно 150 мМ (iii) и от примерно 1800 мМ до примерно 2300 мМ (iv).

В разных воплощениях ионная сила композиции составляет по меньшей мере примерно 50, например, по меньшей мере 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000, 1200, 1600, 2000, 2400, 2800 или по меньшей мере 3200.

В разных воплощениях кальциевую соль выбирают из хлорида кальция, ацетата кальция, глюконата кальция и левулята кальция. В разных воплощениях магниевую соль выбирают из хлорида магния, ацетата магния, сульфата магния, глюконата магния, левулята магния и солей сильных кислот.

В предпочтительных воплощениях вещество (iii) выбирают из перечня, в который входят хлорид кальция, ацетат кальция, хлорид магния, ацетат магния, сульфат магния или их смесь; и модификатором ионной силы (iv) является хлорид натрия.

В другом воплощении композиция также содержит (v) модификатор тоничности.

В разных воплощениях модификатор тоничности (v) выбирают из нейтральной соли, моно-, ди- или полисахарида, сахарного спирта, аминокислоты или короткого пептида или смеси по меньшей мере двух из указанных модификаторов.

В одном воплощении модификатор тоничности (v) присутствует в концентрации от примерно 1 до примерно 500 мМ, от примерно 1 до примерно 300 мМ, от примерно 10 до примерно 200 мМ или от примерно 20 до примерно 150 мМ.

В другом воплощении композиция также содержит (vi) неионное поверхностно-активное вещество.

В одном воплощении неионное поверхностно-активное вещество присутствует в количестве от примерно 0,005 до примерно 2,0 мас.%.

В разных воплощениях неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат или полоксамер или простой алкилэфир полиоксиэтилена, предпочтительно - полоксамер 188 или полоксамер 407, или полисорбат 20 или полисорбат 80, или полиоксилауриловый эфир 23.

В другом воплощении композиция также содержит (vii) антиоксидант. В разных воплощениях антиоксидант представляет собой D- или L-метионин; аналог метионина; метионинсодержащий пептид; аскорбиновую кислоту; цистеин; гомолог метионина, например гомоцистеин; глутатион. В предпочтительном воплощении антиоксидант представляет собой L-метионин. В одном воплощении антиоксидант присутствует в концентрации от примерно 0,1 до примерно 5,0 мг/мл.

В одном воплощении рН композиции поддерживают на уровне от примерно 4,0 до примерно 7,0, например от примерно 4,5 до примерно 7,0, от примерно 5,0 до примерно 7,0, от примерно 5,5 до примерно 7,0 или от примерно 6,0 до примерно 7,0.

В одном воплощении веществом, подходящим для поддержания рН в интервале от примерно 4,0 до примерно 8,0, является буферный агент, выбранный из перечня, в который входят кислоты и соли: цитраты, ацетаты, гистидин, малаты, фосфаты, винная кислота, янтарная кислота, MES, HEPES, имидазол, трис, лактаты, глицилглицин, PIPES, глицин или смеси по меньшей мере двух из указанных буферных агентов.

В одном воплощении концентрация буферного агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 25 мМ, от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ или примерно 10 мМ.

В другом воплощении композиция также содержит (viii) консервант. В одном воплощении консервант выбирают из перечня, в который входят фенол, бензиловый спирт, ортокрезол, метакрезол, паракрезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид бензалкония и хлорид бензатония.

В одном воплощении композиция является изотонической, в другом она является гипертонической. В одном воплощении композицию составляют для фармацевтического введения. В одном воплощении композиция является устойчивой и/или стабилизированной в течение по меньшей мере 6 месяцев при 2-8^оС.

В разных воплощениях полипептид фактора VII представляет собой человеческий фактор VIIa; рекомбинантный человеческий фактор VIIa; полипептид, родственный фактору VII; вариант последовательности фактора VII или полипептид фактора VII, где активность полипептида фактора VII и активность нативного человеческого фактора VIIa (FVIIa дикого типа) составляет по меньшей мере 1,25, предпочтительно - по меньшей мере примерно 2,0 или 4,0, наиболее предпочтительно - по меньшей мере примерно 8,0, при испытании “Анализ in vitro на протеолиз”, описанном в настоящем описании. В одном воплощении полипептид фактора VII имеет гликозилирование, отличающееся от человеческого фактора VII дикого типа.

В разных воплощениях полипептид фактора VII присутствует в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 0,6 мг/мл до примерно 4,0 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 4,0 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 4,0 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 2 мг/мл или от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1,5 мг/мл.

В другом аспекте изобретение также относится к способу получения жидкой водной композиции полипептида фактора VII, включающему стадию предоставления полипептида фактора VII в растворе, содержащем (i) полипептид фактора VII; (ii) вещество, подходящее для поддержания рН в интервале от примерно 4,0 до примерно 8,0; (iii) вещество, выбранное из перечня, в который входят кальциевая соль, магниевая соль или их смесь; где концентрация (iii) составляет по меньшей мере 15 мМ.

Еще в одном аспекте изобретение также относится к применению композиции для получения лечебного средства для лечения синдрома, чувствительного к фактору VII.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения синдрома, чувствительного к фактору VII, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, в условиях, которые приводят к ослаблению кровотечения и/или усилению свертывания крови, эффективного количества водной жидкой композиции, содержащей (i) полипептид фактора VII, (ii) вещество, подходящее для поддержания рН в интервале от примерно 4,0 до примерно 8,0, (iii) вещество, выбранное из перечня, в который входят кальциевая соль, магниевая соль или их смесь; где концентрация (iii) составляет по меньшей мере 15 мМ.

В разных воплощениях синдром выбирают из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, дефицита фактора XI, дефицита фактора VII, тромбоцитопении, болезни Виллебранда, присутствия ингибитора факторов свертывания, операции, внутримозгового кровоизлияния, травмы и антикоагулянтной терапии.

Композиции по настоящему изобретению пригодны в качестве устойчивых и, предпочтительно, готовых к применению композиций полипептидов фактора VII. Композиции устойчивы в течение по меньшей мере шести месяцев, а предпочтительно - 36 месяцев, при хранении при температуре, колеблющейся от 2 до 8°С. Композиции устойчивы химически и/или физически, при хранении в течение по меньшей мере шести месяцев при температуре 2-8°С.

Подразумевается, что “устойчивая” означает, что композиция после хранения в течение 6 месяцев при 2-8°С сохраняет по меньшей мере 50% своей первоначальной биологической активности при измерении в одностадийном анализе на свертывание, по существу, таком, какой описывается в WO 92/15686 (пример II). Коротко, испытываемый образец разбавляют в 50 мМ трис (рН 7,5), 0,1% BSA, и 100 мкл инкубируют со 100 мкл плазмы с дефицитом фактора VII и 200 мкл тромбопластина С, содержащего 10 мМ Са²⁺. Измеряют время свертывания и сравнивают со стандартной кривой с использованием внутреннего стандарта или пула нормальной человеческой плазмы с добавлением цитрата при серийном разведении.

Предпочтительно, устойчивая композиция сохраняет по меньшей мере 80% своей первоначальной активности после хранения в течение 6 месяцев при 2-8°С.

Подразумевается, что термин “стабилизированная”, который можно использовать как взаимозаменяемый с термином “относительно устойчивая”, означает, что композиция после хранения в течение по меньшей мере 6 месяцев при 2-8°С содержит меньшее количество по меньшей мере одного из следующих продуктов разрушения: (i) продуктов ферментативного расщепления, (ii) агрегатов (димеров, олигомеров, полимеров), (iii) окисленных форм, (iv) деамидированных форм, относительно количества соответствующего(их) продукта(ов) разрушения, содержащихся в растворе восстановленного продукта NovoSeven^®, который хранился в подобных условиях в течение такого же периода времени.

Термин “физически устойчивая” предполагается для обозначения композиции, которая остается визуально прозрачной. Физическую устойчивость композиций оценивают посредством визуальной проверки после хранения композиций при разных температурах в течение разных периодов времени. Визуальную проверку композиций осуществляют в остро сфокусированном световом луче с темным фоном. Композицию классифицируют как физически неустойчивую, когда она показывает видимое помутнение.

Термин “физическая устойчивость” полипептидов фактора VII относится к образованию нерастворимых и/или растворимых агрегатов в виде димерных, олигомерных и полимерных форм полипептидов фактора VII, а также к любой структурной деформации и денатурации молекулы.

Термин “клинически устойчивая” предполагается для обозначения композиции, которая сохраняет по меньшей мере 50% своей первоначальной биологической активности после хранения в течение 6 месяцев при 2-8^оС при измерении в одностадийном анализе на свертывание, по существу, таком, какой описывается в WO 92/15686.

Подразумевается, что термин “химическая устойчивость” относится к образованию какого-либо химического изменения в полипептидах фактора VII после хранения в растворе в условиях ускоренного протекания процессов. Примерами являются гидролиз, деамидирование и окисление, а также ферментативное расщепление, приводящие к образованию фрагментов полипептидов фактора VII, в частности, серусодержашие аминокислоты склонны к окислению с образованием соответствующих сульфоксидов.

Композиции содержат полипептиды фактора VII, ионы кальция и/или магния, буферные агенты и, необязательно, другие эксципиенты, которые также стабилизируют полипептиды фактора VII, в том числе модификаторы ионной силы и модификаторы тоничности. Концентрация полипептидов фактора VII колеблется от примерно 0,1 до примерно 10 мкг/мл.

Используемый в данном описании термин “модификатор ионной силы” относится к веществам, которые вносят вклад в ионную силу раствора. Такими веществами являются нейтральные соли, например хлорид натрия или хлорид калия; аминокислоты; короткие пептиды (например, с 2-5 аминокислотными остатками, такие как, например, глицилглицин) или смеси по меньшей мере двух из указанных модификаторов и другие вещества. Предпочтительным веществом является хлорид натрия. Модификаторы ионной силы присутствуют в концентрации по меньшей мере примерно 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ, 400 мМ, 800 мМ, 1000 мМ, 1200 мМ, 1500 мМ, 1800 мМ, 2000 мМ или по меньшей мере 2200 мМ.

Используемый в данном описании термин “модификатор тоничности” относится к веществам, которые вносят вклад в осмоляльность раствора. Модификаторами тоничности являются аминокислоты, короткие пептиды (например, с 2-5 аминокислотными остатками), нейтральные соли, моно- или дисахариды, полисахариды, сахарные спирты, или смеси по меньшей мере двух из указанных модификаторов и другие вещества. Примерами модификаторов тоничности являются хлорид натрия, хлорид калия, цитрат натрия, сахароза, глюкоза, глицилглицин и маннит и другие вещества. Обычно модификаторы присутствуют в концентрации от примерно 1 до примерно 500 мМ, от примерно 1 до примерно 300 мМ, от примерно 10 до примерно 200 мМ или от примерно 20 до примерно 150 мМ, в зависимости от других присутствующих ингредиентов. Можно использовать нейтральные соли, такие как, например, хлорид натрия или хлорид калия.

“Нейтральной солью” называется соль, которая при растворении в водном растворе не является ни кислотой, ни основанием.

Термин “вещество, подходящее для поддержания рН в интервале от примерно 4,0 до примерно 8,0” включает такие вещества, которые поддерживают рН раствора в приемлемом интервале от примерно 4,0 до примерно 8,0, например от примерно 4,0 до примерно 7,0, от примерно 4,5 до примерно 7,0, от примерно 5,0 до примерно 7,0, от примерно 5,0 до примерно 6,5, от примерно 5,5 до примерно 7,0, от примерно 5,5 до примерно 6,5, от примерно 6,0 до примерно 7,0, от примерно 5,0 до примерно 6,0, от примерно 6,4 до примерно 6,6 или от примерно 5,2 до примерно 5,7 или примерно 5,5. Термин можно использовать как взаимозаменяемый с термином “буферный агент”. Такими веществами могут быть кислоты и соли: цитраты (натрия или калия), ацетаты (аммония, натрия или кальция), гистидин (L-гистидин), малаты, фосфаты (натрия или калия), винная кислота, янтарная кислота, MES, HEPES, имидазол, трис, лактаты, глутаматы, глицилглицин, PIPES, глицин, или смеси по меньшей мере двух из указанных буферных агентов и другие вещества. Интервал концентрации буфера выбирают для сохранения предпочтительного рН раствора. Буферный агент также может представлять собой смесь по меньшей мере двух буферных агентов, где смесь способна обеспечить величину рН в конкретном интервале. В других воплощениях концентрация буфера находится в интервале от примерно 1 мМ до 100 мМ, от 1 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 1 мМ до примерно 25 мМ, от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ или равна примерно 10 мМ.

Необязательно, композиции также могут содержать поверхностно-активное вещество или детергент. К “поверхностно активным веществам” или “детергентам”, как правило, относятся вещества, защищающие белок от напряжений, возникающих на границе раздела воздух/раствор, и напряжений, возникающих на границе раздела раствор/поверхность (например, приводящих к агрегации белка). Детергент, предпочтительно, является неионным детергентом, к которым относятся полисорбаты (например, твин^®), такие как полисорбат 20 или 80, простые алкилэфиры полиоксиэтилена или полоксамеры, такие как полоксамер 188 или 407 (например, полиолы плюроники^®), и другие блоксополимеры этилена/пропилена, или полиэтиленгликоль (PEG), такой как PEG8000, и другие вещества. Количество присутствующего поверхностно-активного вещества колеблется от примерно 0,005 до примерно 2,0%.

Необязательно, композиция может содержать антиоксидант. К антиоксидантам относятся аскорбиновая кислота, цистеин, гомоцистеин, цистин, цистатионин, метионин, глутатион и другие пептиды, содержащие цистеин или метионин, в частности пептиды с 2-5 аминокислотными остатками, где по меньшей мере один из остатков является остатком метионина или цистеина, и другие вещества; предпочтительным является метионин, в частности L-метионин. Антиоксидант включают в концентрации 0,1-5 мг/мл, например 0,1-4, 0,1-3, 0,1-2 или 0,5-2 мг/мл.

В композицию также можно включать консервант для задержки роста микробов и посредством этого появляется возможность упаковки полипептидов фактора VII “многократного применения”. К консервантам относятся фенол, бензиловый спирт, ортокрезол, метакрезол, паракрезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид бензалкония и хлорид бензатония. Консерванты, как правило, включают в концентрации 0,1-20 мг/мл, в зависимости от интервала рН и типа консерванта. Необязательно, композиция также может содержать вещество, способное ингибировать деамидирование.

В данном описании конкретные количества следует понимать как величины в пределах ±10%, например, примерно 50 мМ предполагает 50 мМ ± 5 мМ; например, 4% предполагает 4% ± 0,4%, и т.д.

Проценты являются массовыми (масса/масса) как в случае, когда они относятся к твердым веществам, растворенным в растворе, так и к жидкостям, смешанным в растворах. Например, для твина это отношение масса 100% исходного раствора/масса раствора.

Термин “ионная сила” представляет собой ионную силу раствора (µ), которая определяется уравнением m = ¹/₂S([I](Z_i ²)), где µ представляет собой ионную силу, [I] представляет собой молярную концентрацию иона, и Z₁ представляет собой заряд (+ или -) иона (James Fritz and George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979). В разных воплощениях изобретения ионная сила композиции составляет по меньшей мере 50, например, по меньшей мере 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000, 1200, 1600, 2000, 2400, 2800 или по меньшей мере 3200.

Термин “изотонический” означает “изотонический с сывороткой”, т.е. примерно 300 ± 50 миллиосмоль/кг. Тоничность предназначается для измерения осмоляльности раствора перед введением. Термин “гипертонический” предназначается для обозначения уровней осмоляльности свыше физиологического уровня сыворотки, например, уровне выше 300 ± 50 миллиосмоль/кг.

Термин “фармацевтически эффективное количество” или “эффективное количество” отражает эффективную дозу, которую определяет квалифицированный врач-практик, который может оттитровать дозировки для достижения желаемой реакции. При определении дозы учитываются такие факторы как сила, биологическая доступность, желательные фармакокинетические/фармакодинамические профили, условия лечения, факторы, связанные с пациентом (например, масса, здоровье, возраст и т.д.), наличие совместно вводимых лекарственных средств (например, антикоагулянтов), время введения или другие факторы, известные врачу-практику.

Термин “лечение” определяется как помощь субъекту и забота о нем, например млекопитающем, в частности человеке, в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и включает введение полипептида фактора VII для предупреждения появления симптомов или осложнений или облегчения симптомов или осложнений или устранения заболевания, состояния или расстройства. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие полипептид фактора VII, можно вводить парентерально субъектам, нуждающимся в таком лечении. Парентеральное введение можно осуществить подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией с помощью шприца, необязательно шприца, напоминающего ручку. С другой стороны, парентеральное введение можно осуществить с помощью инфузионного насоса.

Концентрацию фактора VIIa обычно выражают в мг/мл или в МЕ/мл, причем 1 мг, как правило, представляет 43000-56000 МЕ или более.

Способы применения

Препараты настоящего изобретения можно применять для лечения любых синдромов, чувствительных к фактору VII, таких как, например, расстройства с кровотечением, в том числе, без ограничения, расстройств, вызванных дефицитом факторов свертывания (например, гемофилией А и В или дефицитом факторов свертывания XI или VII); тромбоцитопенией или болезнью Виллебранда, или ингибиторами факторов свертывания, или избыточное кровотечение по любой причине. Препараты также можно вводить пациентам в связи с операцией или другой травмой или пациентам, получающим антикоагулянтную терапию.

Полипептиды фактора VII в композициях по настоящему изобретению

Термины “человеческий фактор VII” или “FVII” обозначает человеческий фактор VII, полученный разными способами, в том числе экстракцией из природного источника и очисткой, и с помощью рекомбинантных систем культивирования клеток. Его последовательность и характеристики указываются, например, в патенте США № 4784950. Термины также перекрывают биологически активные эквиваленты человеческого фактора VII, например, различающиеся на одну или несколько аминокислот во всей последовательности. Кроме того, термины, используемые в данной заявке, предназначены для включения вариантов фактора VII с заменой, делецией и вставкой аминокислот или посттрансляционных модификаций. Используемый в данном описании термин “полипептид фактора VII” охватывает, без ограничения, фактор VII, а также полипептиды, родственные фактору VII. К полипептидам, родственным фактору VII, относятся, без ограничения, полипептиды фактора VII, которые или химически модифицированы относительно человеческого фактора VII и/или содержат одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности относительно человеческого фактора VII (т.е. варианты фактора VII), и/или содержат укороченные аминокислотные последовательности относительно человеческого фактора VII (т.е. фрагменты фактора VII). Такие полипептиды, родственные фактору VII, могут проявлять отличающиеся относительно человеческого фактора VII свойства, включая устойчивость, связывание фосфолипидов, измененную специфическую активность и т.п.

Подразумевается, что термин “фактор VII” охватывает полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также полипептиды, обработанные протеолитически с образованием их соответствующих биологически активных форм, которые можно назвать фактором VIIa. Типично, фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с образованием фактора VIIa. Также подразумевается, что термин “фактор VII” охватывает, без ограничения, полипептиды с аминокислотной последовательностью 1-406 человеческого фактора VII дикого типа (описанной в патенте США № 4784950), а также фактор VII дикого типа, происходящий от других видов, такой как, например, фактор VII коровы, свиньи, собаки, мыши и лосося. Он также охватывает природные аллельные вариации фактора VII, которые могут существовать и встречаются у одного и другого индивидуума. Также степень и локализация гликозилирования или других посттрансляционных модификаций могут изменяться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и характера окружающей хозяина клеточной среды.

Используемый в данном описании термин “полипептиды, родственные фактору VII” охватывает, без ограничения, полипептиды, проявляющие по существу одинаковую или улучшенную биологическую активность относительно человеческого фактора VII дикого типа. К таким полипептидам относятся, без ограничения, фактор VII или фактор VIIa, модифицированные химически, и варианты фактора VII, в которые введены специфические изменения в аминокислотной последовательности, модифицирующие или разруша