Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа

Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение касается терапии антагонистами, которые связываются с поверхностными маркерами В-клеток. В частности, настоящее изобретение относится к использованию такого рода антагонистов для лечения аутоиммунных заболеваний у млекопитающих, которые обнаруживают неадекватный ответ на ингибитор TNF-альфа.

Предпосылки создания изобретения

Лимфоциты - это один из множества типов белых клеток крови, которые образуются в костном мозге в процессе гемопоэза. Существуют две основные популяции лимфоцитов: В-лимфоциты (В-клетки) и Т-лимфоциты (Т-клетки). Наибольший интерес представляют В-клетки.

В-клетки созревают в костном мозге и покидают его, экспрессируя на своей поверхности антигенсвязывающее антитело. Когда нативная В-клетка впервые встречается с антигеном, по отношению к которому экспрессируемое на ее поверхности антитело является специфичным, она начинает быстро делиться и ее потомство дифференцируется в В-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые "плазматическими клетками". В-клетки памяти имеют большее время жизни и продолжают экспрессировать связанное с мембраной антитело той же специфичности, что и родительские клетки. Плазматические клетки не продуцируют связанного с мембраной антитела, но вместо этого синтезируют антитело в секретируемой форме. Секреторные антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

CD20-антиген (также называемый рестриктивным дифференцировочным антигеном В-лимфоцитов человека, Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно 35 kD, экспрессируемый пре-В и зрелыми В-лифмоцитами (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989); и Einfeld et al., ЕМВО J. 7(3): 711-717 (1988)). Указанный антиген также экспрессируется более чем 90% В-клеток неходжкинских лимфом (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), но не обнаруживается на поверхности гемопоэтических стволовых клеток, про-В-клеток, нормальных плазматических клеток или других клеток здоровых тканей (Tedder et al., J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). CD20 регулирует ранний(ранние) этап(ы) процесса активации инициации клеточного цикла и дифференцировки (Tedder et al., supra) и, возможно, функционирует как кальциевый ионный канал (Tedder et al J,. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).

Установленная экспрессия CD20 В-клетками лимфом позволяет рассматривать этот антиген как потенциальную мишень для воздействия на соответствующие лимфомы. В принципе, это можно представить следующим образом: пациенту вводят антитела, специфичные по отношению к поверхностному антигену В-клеток CD20. Эти анти-CD20-антитела специфично связываются с CD20 антигеном, скорее всего, как нормальных, так и злокачественных В-клеток; антитело, связавшееся с поверхностным CD20 антигеном, может обеспечивать разрушение и уменьшение числа неопластических В-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с анти-CD20-антителом таким образом, что агент целенаправленно "доставляется" непосредственно к неопластическим В-клеткам. В независимости от подхода основной целью является разрушение опухоли; специфический подход может заключаться в применении определенного анти-CD20 антитела, и, следовательно, возможные подходы для воздействия на CD20 антиген могут значительно различаться.

CD19 представляет собой другой поверхностный антиген, который экспрессируется В-клетками. Как и CD20, CD19 обнаруживается на поверхности В-клеток на всех этапах их дифференцировки, начиная от стволовой клетки и заканчивая клеткой, непосредственно предшествующей конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки (Nadler L. Типирование лимфоцитов II, 2: 3-37 и Приложение; Renling et al,. eds. (1986), Springer Verlag). В отличие от CD20 антитело, связывающееся с CD 19, вызывает интернализацию CD 19 антигена. CD19 антиген среди прочих распознается антителом HD237-CD19 (также называемым "В4" антителом) (Kiesel et al., Исследование лейкоза II, 12: 1119 (1987)). Антиген CD19 обнаруживается у 4-8% мононуклеарных клеток периферической крови и более чем у 90% В-клеток, выделенных из периферической крови, селезенки, лимфатического узла или миндалины. CD19 не определяется у Т-клеток периферической крови, моноцитов или гранулоцитов. Практически все Т-клеточные острые лимфобластные лейкозы (ALL), В-клеточные хронические лимфоцитарные лейкозы (CLL) и В-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, распознаваемый В4 антителом (Nadler et al., J. Immunol. 131: 244 (1983), а также Nadler et al. в работе "Прогресс в гематологии" Vol.XII, pp.187-206. Brown, E. ed. (1981), Grune & Stratton, Inc.).

Кроме того, выделены дополнительные антитела, которые распознают антигены, специфичные для каждого этапа дифференцировки В-клеточной линии. Среди них можно указать на антитело В2 к антигену CD21; антитело В3 к антигену CD22 и антитело J5 к антигену CD10 (также называемому CALLA). См. патент US No. 5595721 от 21 января 1997 г. (Kaminski et al.).

Ритуксимаб (RITUXAN®) представляет собой генно-инженерное химерное моноклональное антитело типа "человек/мышь", направленное против антигена CD20. В патенте US No. 5,736,137 от 7 апреля 1998 г. (Anderson et al.) ритуксимаб фигурирует под названием "С2В8". RITUXAN® предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или резистентной низкодифференцированной или фолликулярной CD20 позитивной В-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro показали, что RITUXAN® связывается с системой комплемента человека и разрушает лимфоидные В-клеточные линии посредством комплемент-опосредованной цитотоксичности (CDC, от англ. Complement-Dependent Cytotoxicity) (Reffet al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Кроме того, он обладает значительной активностью в исследованиях антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC, от англ. Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity). Недавно в экспериментах по включению клетками меченного тритием тимидина было показано, что RITUXAN® имеет антипролиферативный эффект и способен непосредственно вызывать апоптоз клеток, в то время как другие анти-CD19 и анти-CD20 антитела этими свойствами не обладают (Maloney et al., Blood 88(10): 637a (1996)). Также экспериментально был установлен синергизм в действии RITUXAN®, препаратов для химиотерапии и токсинов. В частности, RITUXAN® сенсибилизирует лекарственно-устойчивые В-клеточные линии лимфом к цитотоксическому эффекту доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al., Химиотерапия и радиофармацевтика раковых заболеваний 12(3): 177-186 (1997)). Преклинические исследования in vivo показали, что RITUXAN® способствует исчезновению В-клеток из периферической крови, лимфатических узлов и костного мозга у обезьян циномолгус, по-видимому, с помощью опосредованных комплементом и антителами процессов (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)).

Патенты и заявки на патенты, касающиеся антител к CD20, включают патенты US 5776456, 5736137, 6399061 и 5843439, а также заявки на патент US US 2002/0197255 A1 и US 2003/0021781 A1 (Anderson et al.); патент US No. 6455043 B1 и заявку WO 00/09160 (Grillo-Lopez.A.); заявку WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); заявку WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); заявку WO 00/44788 (Braslawsky et al.); заявку WO 01/10462 (Rastetter, W.); заявку WO 01/10461 (Rastetter and White); заявку WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); заявку на патент US US 2002/0006404 A1 и заявку WO 02/04021 (Hanna and Hariharan); заявку на патент US US 2002/0012665 A1 и заявку WO 01/74388 (Hanna, N.); заявку на патент US US 2002/0009444 A1 и заявку WO 01/80884 (Grillo-Lopez, А.); заявку WO 01/97858 (White, С.); заявку на патент US US 2002/0128488 A1 и заявку WO 02/34790 (Reff, M.); заявку WO 02/060955 (Braslawsky et al.); заявку WO 02/096948 (Braslawsky et al.); заявку WO 02/079255 (Reff and Davies); патент US No. 6171586 В1 и заявку WO 98/56418 (Lam et al.); заявку WO 98/58964 (Raju, S.); заявку WO 99/22764 (Raju, S.); заявку WO 99/51642 и патенты US No. 6194551 В1, 6242195 В1, 6528624 В1, 6538124 В1 (Idusogie et al.); заявку WO 00/42072 (Presta, L.); заявку WO 00/67796 (Curd et al.); заявку WO 01/03734 (Grillo-Lopez et al.); заявку на патент US US 2002/0004587 A1 и заявку WO 01/77342 (Miller and Presta); заявку на патент US US 2002/0197256 A1 (Grewal, I.); патенты US No. 6090365 B1, 6287537 В1, 6015542 В1, 5843398 В1 и 5595721 В1 (Kaminski et al.); патенты US No. 5500362 В1, 5677180 B1, 5721108 B1 и 6120767 B1 (Robinson et al.); патент US No. 6410391 B1 (Raubitschek et al.); патент US No. 6244866 В1 и заявку WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); заявку WO 01/13945 (Barbera - Guillem. E.); заявку WO 00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg и Hansen); заявку WO 00/76542 (Golay et al.); заявку WO 01/72333 (Wolin и Rosenblatt); патент US No. 6368596 B1 (Ghetie et al.); заявку на патент US No. US 2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); заявку на патент US No. US 2003/0026801 A1 (Weiner и Hartmann); заявку WO 02/102312 (Engleman, E.), которые приведены здесь в качестве ссылок. См. также патент US No. 5849898 и заявку ЕР No. 330191 (Seed et al.); патент US No. 4861579 и заявку ЕР 332865 А2 (Meyer и Weiss) и заявку WO 95/03770 (Bhat et al.).

К опубликованным источникам информации, в которых раскрыта терапия при использовании ритуксимаба, относятся следующие: Perotta и Abuel "Ответ у больных с хронически рецидивирующей идиопатической тромбоцитопенической пурпурой на ритуксимаб в течение 10 лет его применения" Реферат # 3360, Blood 10(1) (часть 1-2): стр.88В; Stashi et al,. "Лечение взрослых больных с хронической идиопатической тромбоцитопенической пурпурой при использовании химерного моноклонального антитела к CD20 (ритуксимаба)" Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R., "Медицинские еретики" New Scientist (7 Апреля; 2001); Leandro et al,. "Клинический результат терапии с истощением В-лимфоцитов у 22 больных ревматоидным артритом" Ann Rheum Dis 61: 833-888 (2002); Leandro et al., "Истощение лимфоцитов при ревматоидном артрите: безопасность, эффективность и дозовый ответ" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al., "Открытое исследование истощения В-лимфоцитов при системной красной волчанке" Arthritis and Rheumatism 46(1): 2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge, "Длительное улучшение при ревматоидном артрите при использовании методики истощения В-лимфоцитов" Rhematology 40: 2050211 (2001); Edwards et al., "Терапия, основанная на истощении В-лимфоцитов, при ревматоидном артрите и других аутоиммунных заболеваниях" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards et al., "Эффективность и безопасность ритуксимаба, химерного моноклонального антитела, направленного к В-клеткам: рандомизированные, контролируемые с помощью плацебо исследования больных ревматоидным артритом" Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine и Pestronk, "Связанные с IgM-антителами полинейропатии: химиотерапия, основанная на истощении В-клеток, при использовании ритуксимаба" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al., "Эффективность избирательной блокады В-клеток при терапии ревматоидного артрита" Arthritis and Rheumatism 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al," Лечение DMARD-рефрактерного ревматоидного артрита ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Октябрь 24-29; Новый Орлеан, LA 2002; Tuscano, J., "Успешное лечение инфликсимаб-рефрактерного ревматоидного артрита ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Октябрь 24-29; Новый Орлеан, LA 2002.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии. У большинства пациентов, страдающих хроническим РА, даже при надлежащей терапии могут происходить прогрессивное разрушение суставов, их деформация, нарушение многих функций и даже преждевременная смерть. Более девяти миллионов больных ревматоидным артритом посещают врачей и более 250000 пациентов ежегодно подвергаются госпитализации. Задачи терапии РА заключаются в предотвращении или контролировании повреждений сустав, предотвращении утраты их функции и уменьшении боли. Первоначальная терапия РА обычно включает применение одного или более следующих лекарственных средств: нестероидных противовоспалительных препаратов (NSAIDs), глюкокортикоидов (внутрисуставные инъекции) и преднизолона в низких дозах. См. "Руководство по лечению ревматоидного артрита" Arthritis and Rheumatism 46(2): 328-346 (Февраль 2002). К большей части пациентов с заново диагностированным РА применяется модифицирующая заболевание антиревматическая лекарственная (DMARD) терапия в течение трех месяцев с момента постановки диагноза. Во время DMARD-терапии РА обычно используют гидроксихлороквин, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномид, этанерсепт, инфликсимаб (совместно с перорально и подкожно вводимым метотрексатом), азатиоприн, D-пеницилламин, Gold (перорально). Gold (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбированный белок А стафилококков.

Поскольку при заболевании РА в организме больного синтезируется фактор некроза опухолей альфа (TNFα), ингибиторы TNFα используются для лечения указанного заболевания.

Этанерсепт (ENBREL®) представляет собой инъекционный лекарственный препарат, который разрешен в US для лечения активной формы РА. Этанерсепт связывается с TNFα и удаляет его большую часть из суставов и крови, тем самым предотвращая развитие воспаления и других симптомов РА, обусловленное TNFα. Этанерсепт является иммуноадгезивным белком слияния, состоящим из внеклеточного участка рецептора фактора некроза опухолей человека (TNFR) мол. массы 75 kD (p75), связывающего лиганд, соединенного с Fc-участком IgG1 человека. Этот лекарственный препарат обладает рядом побочных эффектов, в том числе может вызывать серьезные инфекции и сепсис, расстройства нервной системы, такие как рассеянный склероз (МС). См., например, www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html

Инфликсимаб, поступающий в продажу под торговым наименованием REMICADE®, представляет собой иммуносупрессорный лекарственный препарат, предназначенный для лечения РА и болезни Крона. Инфликсимаб представляет собой химерное моноклональное антитело, которое целенаправленно связывается с TNFα в организме больного и уменьшает обусловленное TNFα воспаление. Показана взаимосвязь инфликсимаба с летальными процессами, например сердечной недостаточностью, и инфекционными заболеваниями, в том числе туберкулезом, а также демиелинизацией, приводящей к МС.

В декабре 2002 г. компания Abbott Laboratories получила разрешение FDA на выпуск препарата адалимумаб (HUMIRA™), до этого известного под названием D2E7. Адалимумаб представляет собой моноклональное антитело человека, связывающееся с TNFα, для которого было показано, что оно способно снижать проявления и симптомы, а также замедлять прогрессивное развитие структурных изменений у взрослых людей, больных РА от средней до тяжелой формы, которые обнаруживают недостаточную отвечаемость на традиционную терапию DMARD.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, в первую очередь, относится к способу лечения аутоиммунных заболеваний у млекопитающего с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, заключающемуся во введении такому млекопитающему терапевтически эффективного количества антагониста, который связывается с поверхностным маркером В-клеток.

Например, настоящее изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, заключающемуся во введении такому млекопитающему эффективного терапевтического количества антитела, которое связывается с CD20.

Кроме того, настоящее изобретение касается способа снижения риска развития негативных побочных эффектов, включая инфекции, сердечную недостаточность и демиелинизацию, заключающегося во введении млекопитающему с аутоиммунным заболеванием терапевтически эффективного количества антагониста, который связывается с поверхностным маркером В-клеток.

Детальное описание изобретения

I. Определения

Термин "фактор некроза опухолей альфа (TNFα)", используемый в настоящем описании, относится к молекуле TNFα человека, имеющей аминокислотную последовательность, описанную Pennica et al., Nature 312: 721 (1984) или Aggarwal et al., JBC 260: 2345 (1985).

Термин "ингибитор TNFα", используемый в настоящем описании, относится к агенту, который в некоторой степени ингибирует биологическую функцию TNFα, главным образом, путем связывания с TNFα и нейтрализации его активности. Примерами ингибиторов TNFα, которые специальным образом рассматриваются здесь, являются этанерсепт (ENBREL®), инфликсимаб (REMICADE®) и адалимумаб (HUMIRA™).

Термин "неадекватный ответ на ингибитор TNFα" означает неадекватный ответ на предшествующее или текущее лечение ингибитором TNFa, связанное с токсичностью лекарственных препаратов и/или с недостаточной эффективностью лечения. Неадекватный ответ может быть определен лечащим врачом, имеющим определенный опыт в данной области.

Млекопитающими, у которых во время предшествующего или текущего лечения ингибитор TNFα проявлял или проявляет "токсичность", являются такие млекопитающие, у которых наблюдались или наблюдаются один или более нежелательных побочных эффектов, таких как инфекции (главным образом тяжелые инфекции), застойная сердечная недостаточность, демиелинизация (приводящая к развитию МС), гиперчувствительность, неврологическая симптоматика, аутоиммунизация, неходжкинская лимфома, туберкулез (ТВ), образование аутоантител и т.д.

У млекопитающих с "неадекватной эффективностью" сохранялись проявления активной формы заболевания во время предшествующего или текущего лечения ингибитором TNFα. Например, у пациента может сохраняться активный процесс после одного или трех месяцев лечения ингибитором TNFα.

Под термином "снижение риска развития негативных побочных эффектов" подразумевается снижение риска развития побочных эффектов, возникающих в результате лечения антагонистом, который связывается с поверхностным маркером В-клеток, до уровня ниже того, который наблюдается при лечении ингибитором TNFα. Такие побочные эффекты включают инфекции (главным образом, тяжелые инфекции), сердечную недостаточность и демиелинизацию (рассеянный склероз) и т.д.

Термин "поверхностный маркер В-клеток", используемый в настоящем описании, относится к антигену, экспрессируемому на поверхности В-клеток, являющемуся "мишенью" для действия антагониста, который с ним связывается. Примерами поверхностных маркеров В-клеток могут служить CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, Cd79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 лейкоцитарные поверхностные маркеры. Поверхностным маркером В-клеток, представляющим особый интерес, является такой маркер, который экспрессируется преимущественно В-клетками по сравнению с другими не В-клеточными тканями млекопитающих, причем как предшественниками В-клеток, так и зрелыми В-клетками. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения маркером является CD20 или CD19, обнаруживаемый на поверхности В-клеток на всех этапах их дифференцировки, начиная со стволовой клетки вплоть до клетки, непосредственно предшествующей конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки. Предпочтительным поверхностным маркером В-клеток является CD20.

Антиген "CD20" - это негликозилированный фосфопротеин с молекулярным весом ~35 kDa, обнаруживаемый на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется ранними предшественниками В-клеток и сохраняется вплоть до конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки. CD20 выявляется на поверхности как нормальных, так и злокачественных В-клеток. Другими названиями CD20, которые встречаются в литературе, являются "В-лимфоцитарный рестриктивный антиген" и "Вр35". Антиген CD20 описан, например, dark et al., PNAS (USA) 82: 1766 (1985).

Термин "аутоиммунное заболевание", используемый в настоящем описании, относится к заболеванию или патологическому состоянию, возникающему в собственных тканях организма и направленному против них. Примерами аутоиммунных заболеваний или патологических состояний являются (без ограничений указанными) артрит (ревматоидный артрит, болезнь Стилла, остеоартрит, псориатический артрит), псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, системная склеродермия и системный склероз, иммунные ответы, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS, от англ. Adult Respiratory Distress Syndrome), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзема, астма, состояния, сопровождающиеся Т-клеточной инфильтрацией и хроническим воспалительным ответом, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системная красная волчанка (SLE, от англ. System Lupus Erythematosus), ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные ответы, связанные с реакцией гиперчувствительности немедленного и замедленного типов, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, грануломатоз, включая грануломатоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая ANCA), апластическая анемия, анемия Дайемонда-Блекфэна, иммунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA, от англ. Autoimmune Hemolytic Anemia), пернициозная анемия, истинная эритроцитарная аплазия (PRCA, от англ. Pure Red Cell Aplasia), недостаточность фактора VIII, гемофилия А, аутоиммунная нейтропения, панцитопения, лейкопения, заболевания, ассоциированные с диапедезом лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (CNS, от англ. Central Nervous System), синдром множественного поражения органов, миастения гравис, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, заболевания, связанные с образованием антигломерулярных антител в базальной мембране, антифосфолипидный синдром, аллергический нейрит, болезнь Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, Синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, реакция отторжения трансплантата, реакция "трансплантат против хозяина" (GVHD, от англ. Graft Versus Host Desease), пузырчатка буллезная, пузырчатка, аутоиммунные полиэндокринопатии, синдром Рейтера, синдром "деревянного человека", гигантоклеточный артериит, иммунокомплексный нефрит, IgA нефропатия, IgM полинейропатии или опосредованные IgM нейропатии, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP, от англ. Idiopathic Thrombocytopenic Purpura), тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР, от англ. Thrombotic Thrombocytopenic Purpura), аутоиммунная тромбоцитопения, аутоиммунные заболевания яичек и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоидизм, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоидизм, болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунный полигландулярный синдром (или синдромы полигландулярной эндокринопатии), диабет I типа, также называемый инсулинзависимым сахарным диабетом (IDDM, от англ. Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) и синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (HIV), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантационный) в противоположность NSIP, синдром Гиейна-Барре, васкулиты крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (болезнь Такаясу), васкулиты сосудов среднего диаметра (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), анкилозирующий спондилит, болезнь Бергера (IgA нефропатия), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз, целиакия (глютеновая энтеропатия), криоглобулинемия, боковой амиотрофический склероз (ALS, от англ. Amyotrophic Lateral Sclerosis), ишемическая болезнь сердца и др.

Термин "антагонист" обозначает молекулу, которая при связывании с поверхностным маркером В-клеток разрушает В-клетки или снижает их количество в организме млекопитающих и/или препятствует реализации одной или нескольких функций В-клеток, например, путем предотвращения или снижения уровня гуморального иммунного ответа, обеспечиваемого В-клетками. Предпочтительно антагонист обладает способностью истощать пул В-клеток (т.е. снижать уровень циркулирующих В-клеток) у млекопитающих, получающих его в качестве лекарственного средства. Такое снижение может быть достигнуто посредством осуществления нескольких механизмов, таких как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) и/или комплементопосредованная цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индуцирование гибели В-клеток (например, путем апоптоза). К антагонистам, рассматриваемым в рамках настоящего изобретения, относятся антитела, синтетические или нативные пептидные последовательности и небольшие молекулы антагонистов, которые связываются с поверхностным маркером В-клеток, необязательно конъюгированные или слитые с цитотоксическим агентом. Предпочтительным антагонистом является антитело. Термины "антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" означают опосредуемую клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие рецепторы Fc (FcRs) [например, натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги], распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем лизируют такую клетку-мишень. Основные клетки, опосредующие ADCC, а именно натуральные киллеры, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcRIII. Экспрессия FcR гемопоэтическими клетками обобщена в Таблице 3 на стр.464 в работе Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки активности интересующей молекулы в отношении ADCC можно осуществить анализ ADCC in vitro, как описано в патенте US No. 5500362 или 5821337. Подходящими эффекторными клетками для такого анализа являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и натуральные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно оценка активности представляющей интерес молекулы в отношении ADCC может быть осуществлена in vivo, например, на модельном животном, как это описано Clynes et al,. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

"Эффекторные клетки человека" - это лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcRs и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по крайней мере, FcRIII и выполняют эффекторную функцию в отношении ADCC. Примерами лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), натуральные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; наиболее предпочтительными являются PBMCs и NK.

Термин "Fc рецептор" или "FcR" используется для описания рецептора, который связывается с Fc-участком молекулы антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR антитела человека. Кроме того, предпочтительным FcR является такой рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма рецептор). К указанному FcR относятся рецепторы FcγRI, FcγRII и FcγRIII подклассов, в том числе их аллельные варианты и рецепторы, полученные в результате альтернативного сплайсинга. FcγRII рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, различающиеся, главным образом, только в цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную, основанную на тирозине активирующую структуру (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную, основанную на тирозине ингибирующую структуру (ITIM). (см. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs описаны Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcRs, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, здесь объединены общим термином "FcR". Этот термин также относится к неонатальному рецептору FcRn, который отвечает за передачу материнского IgGs плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

"Комплементопосредованная цитотоксичность" или "CDC" означает способность молекулы лизировать "мишень" в присутствии комплемента. Каскад реакций активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с распознаваемым антигеном. Для оценки активности комплемента можно осуществить анализ CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al,. J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

К антагонистам, "ингибирующим рост", относятся антагонисты, которые предотвращают или снижают пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связываются эти антагонисты. Например, антагонист может предотвращать или снижать пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

К антагонистам, "индуцирующим апоптоз", относятся такие антагонисты, которые индуцируют запрограммированную клеточную гибель, например гибель В-клеток, что определяется в стандартных исследованиях апоптоза, таких как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сморщивание клеток, дилатация эндоплазматического ретикулума, клеточная фрагментация и/или формирование мембранных везикул (называемых также тельцами апоптоза).

Термин "антитело", используемый в настоящем описании, имеет очень широкое значение и специальным образом относится к интактным моноклональным антителам, поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), сконструированным, по крайней мере, на основе двух интактных антител, и фрагментам антител при условии, что они обладают необходимой биологической активностью.

Термин "фрагменты антител" относится к участкам интактных антител, предпочтительно содержащим антигенсвязывающую область. Примерами фрагментов антител являются Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, сконструированные из антительных фрагментов.

Термин "нативные антитела" обычно используется по отношению к гетеротетрамерным гликопротеинам с молекулярной массой около 150000 Дальтон, состоящим из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством ковалентной дисульфидной связи, при этом число дисульфидных связей в тяжелых цепях варьирует в зависимости от идиотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет симметрично расположенные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь на одном конце имеет вариабельный домен (V_H), за которым следуют несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (V_L) на одном конце и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи расположен на одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи находится на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что контакт между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей обеспечивается определенными аминокислотными остатками.

Термин "вариабельный" означает то, что последовательности определенных участков вариабельных доменов разных антител значительно различаются между собой и обеспечивают специфичность связывания каждого антитела со своим определенным антигеном. Однако вариабельность не распределена случайным образом среди вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, расположенных в вариабельных доменах как легких, так и тяжелых цепей. Наиболее консервативные участки вариабельных доменов называются каркасными участками (FRs). Все вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей имеют четыре FRs, которые обеспечивают β-складчатую структуру и связаны тремя гипервариабельными участками, формирующими петли, и в некоторых случаях часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи тесно связаны между собой посредством FRs, а также с гипервариабельными участками другой цепи и участвуют в формировании антигенсвязывающей области антитела (см. Kabat et al., Последовательности иммунологически важных белков, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как обеспечение антителозависимой цитотоксичности (ADCC).

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагментами, каждый из которых содержит одну антигенсвязывающую область, и остаточного "Fc"-фрагмента, наименование которого отражает его способность к быстрой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к получению F(ab')₂-фрагмента, который имеет две антигенсвязывающие области и все еще обладает способностью к перекрестному связыванию антигена.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который включает полноразмерные антиген распознающую и антигенсвязывающую области. Этот участок представляет собой димер одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной взаимосвязи. Его конфигурация такова, что три гипервариабельных участка каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающей области на поверхности V_H-V_L димера. Все вместе шесть гипервариабельных участка обеспечивают специфичность связывания антитела с антигеном. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных участка, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем полноразмерный связывающий участок.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они на карбокси-концевом участке СН1 домена тяжелой цепи имеют несколько дополнительных аминокислотных остатков, включая один или более остатков цистеина из шарнирного участка антитела. Fab'-SH в данном тексте обозначает Fab'-фрагмент, в котором остатки цистеина константного домена имеют по крайней мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антител первоначально были получены как спаренные Fab'-фрагменты, между которыми расположены шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие структуры, представленные соединенными между собой фрагментами антител.

"Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) любых позвоночных животных могут быть отнесены к одному из двух существующих типов, обозначаемых каппа (κ) и лямда (λ), что основано на аминокислотной последовательности константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов тяжелых цепей антитела могут быть разделены на различные классы. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем некоторые из них, в свою очередь, также могут быть разделены на подклассы (идиотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам антител, обозначаются α, δ, ε, γ и µ соответственно. Кроме того, хорошо изучены структура отдельных субъединиц и три возможные пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов.

"Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител включают V_H и V_L домены антител, при этом указанные домены находятся в одной полипептидной цепи. Предпочтительно Fv полипептиды также имеют полипептидный линкер между V_H и V_L доменами, который обеспечивает формирование необходимой для связывания антигена конфигурации scFv. Для более детального ознакомления см. Plückthun, Фармакология моноклоналъных антител vol.113, Rosenburg and Moore eds.. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими областями, включающим вариабельный домен тяжелой цепи

(V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же полипептидной цепи (V_H-V_L). Поскольку линкер является слишком коротким для того, чтобы обеспечить образование пары между двумя доменами в одной цепи, домены объединяются в пару при помощи комплиментарных доменов другой цепи и образуют две антигенсвязывающие области. Диатела подробно описаны, например, в европейском патенте ЕР 404097; международной заявке WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Термин "моноклональное антитело", используемый в настоящем описании, относится к антителу, выделенному из популяции практически полностью гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, образующие популяцию, являются идентичными, за исключением того, что они могут иметь небольшое число природных мутаций. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной антигенной детерминанты. Помимо своей высокой специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они синтезируются гибридомной культурой, "незагрязненной" другими антителами. Прилагательное "моноклональный" означает, что антитело получено из полностью гомогенной популяции антител и не может быть получено способом, который применяется для получения обычных антител. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью гибридомного метода, впервы