Композиции иммуноглобулина и способ их получения

Композиции иммуноглобулина и способ их получения

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к стабильным, концентрированным композициям белков или антител, таким как натализумаб, у которых сохраняется активность антитела и которые также могут вводиться в небольшом объеме субъекту с состояниями различной тяжести, нуждающемуся в этом.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиции антител и белков известны в области техники. Однако получение белковых композиций, таких как композиции антител, которые являются химически и биологически стабильными, чревато сложностями. Получение композиций, которые также не только стабильны, но и могут сохранять небольшой объем (т.е. позволяя инъекцию небольшого объема) даже с повышенной концентрацией белка, такого как антитело, также является проблематичным. Существует необходимость в таких композициях. Например, концентрированные количества белка в фиксированном объеме, который также является стабильным, будут особенно полезными пациентам с меняющейся массой. Введение жидкостей пациентам с меняющейся массой может, например, иметь побочные реакции. Разработке таких композиций препятствуют сами белки или антитела, которые имеют высокую склонность к агрегации и осаждению.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, несмотря на то, о чем ранее сообщалось в литературе, существует необходимость в улучшенных способах получения композиций белков и/или антител. Также существует необходимость в стабильных композициях с большими концентрациями антитела или белка, у которых сохраняется активность антитела или белка. Также необходимы стабильные композиции концентрированного белка, которые сохраняют фиксированный объем. Заявители описывают в настоящем описании стабильные композиции, которые далее могут быть использованы для получения композиций антител, особенно композиций с высокими концентрациями антител, которые не осаждаются и являются стабильными при хранении при рекомендованной температуре. Высококонцентрированные и стабильные композиции антител существенно помогут врачам в лечении субъектов с меняющейся массой.

Один аспект изобретения обеспечивает стабильную водную фармацевтическую композицию, включающую иммуноглобулин (или другой белок), фосфатный буфер, полисорбат и хлорид натрия. Предпочтительно полисорбатом является полисорбат 80, предпочтительно в количестве от около 0,001% до около 2,0% (мас/об). Наиболее предпочтительно полисорбат присутствует в количестве около 0,02%. В другом варианте воплощения изобретения иммуноглобулин или другой белок присутствует в композиции в количестве от около 0,1 мг/мл до около 200 мг/мл. Предпочтительно композиция забуферена до рН от около 3,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно около 6,0±0,5. Композиция является предпочтительно изотонической. Композиция может дополнительно содержать гистидин. Предпочтительно гистидином является L-гистидин.

В другом аспекте изобретения иммуноглобулином в вышеуказанной композиции является антитело к альфа-4 интегрину, такое как натализумаб или другое гуманизированное антитело или моноклональное антитело. Такое антитело может присутствовать в стандартном количестве или в концентрированном количестве, например, около 15 мг/мл или более. Предпочтительно, натализумаб присутствует в количестве от около 20 мг/мл до около 150 мг/мл. В случаях, когда композиция присутствует в концентрации от около 15 мг/мл или более, такая композиция сохраняется в фиксированной объеме, например около 125 мл.

Следующей целью изобретения является обеспечение способа лечения пациента с состояниями различной тяжести, терапевтическим количеством иммуноглобулина, включающего введение композиции, как описано выше в данном описании, где состояние лечат введением композиции. Следующим аспектом изобретения является то, что состояние является таковым, которое опосредовано альфа-4 интегрином, и в таких условиях иммуноглобулин является таковым, который распознает и связывается с альфа-4-интегрином, таким как натализумаб.

Следующий аспект изобретения обеспечивает композицию, включающую фосфат натрия, полисорбат, белок и NaCl с pH 6,0±0,5, где композиция является стабильной при хранении при 5-8°C в течение длительного периода времени.

Другой аспект изобретения обеспечивает способ получения стабильной композиции, содержащей белок, включающей смешивание фосфата натрия, хлорида натрия, полисорбата и белка и доведение рН смеси фосфорной кислотой до около pH 6,0±0,5.

Белок может быть лиофилизирован в композиции по настоящему изобретению. Полисорбатом является предпочтительно полисорбат 80k, присутствующий в количестве около 0,02% (мас/об), и белком является предпочтительно натализумаб. Композиция, кроме того, может включать гистидин.

Предпочтительно, белок лиофилизирован в растворе, содержащем 5 мМ гистидина, 20 мг/мл сахарозы и 0,02% полисорбата 80 при pH 6, и белком является натализумаб в концентрации 20 мг/мл.

Следующей задачей изобретения является обеспечение изделия, включающего контейнер, содержащий стабильную композицию, описанную выше и в этом документе.

Другой аспект изобретения обеспечивает способ лечения пациента с состояниями различной тяжести, включающий одновременное или последовательное введение пациенту терапевтически эффективной комбинации композиции, описанной выше и в этом документе, и соединения или лечения, эффективного в отношении состояния.

Следующей задачей изобретения является обеспечение применения любой из стабильных композиций, описанных в данном описании, для получения лекарственного препарата для лечения состояния, где лекарственный препарат является эффективным для лечения указанного состояния. Этот лекарственный препарат может, кроме того, включать второе соединение или терапию для лечения состояния.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Под названием «белок» понимают включая, но не ограничиваясь, иммуноглобулины, ферменты, рецепторы и их фрагменты. Хотя обсуждение композиции обеспечено преимущественно в отношении антитела или иммуноглобулина, другие белки рассматриваются как взаимозаменяемые в описанных композициях.

Под названием «иммуноглобулин» понимают включая, но не ограничиваясь, антитела или фрагменты антитела (такие как scFv, Fab, Fc, F(ab')₂) и другие, созданные методами генной инженерии, части антител. В зависимости от аминокислотной последовательности постоянного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них могут быть далее поделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4; IgA1 и IgA2. Постоянные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (µ), соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Предпочтительно, иммуноглобулин распознает и связывается с альфа-4 интегрином.

Термин «антитело» используется в широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая антитела агонисты и антагонисты), композиции антител с политипной специфичностью и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2, scFv и Fv), при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. «Антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, приматизированные® антитела и других антитела, полученные с помощью генно-инженерных технологий.

Термин «моноклональное антитело», как используется в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными в отношении одного антигенного участка. Более того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные относительно различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено относительно отдельной детерминанты на антигене. В добавление к их специфичности моноклональные антитела являются предпочтительными в том, что они синтезируются системами экспрессии клеток млекопитающих или трансгенными способами, не загрязняясь другими иммуноглобулинами. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессироваться у коз, как описано у Behboodi, et al. (2002) Transgenic cloned goats and the production of therapeutic proteins. In Principles of Cloning. Elsevier Science (USA); и Meade et al. (1999). Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals in Gene expression systems: using nature for the art of expression. J. M. Fernandez и J. P. Hoeffler ed., Academic Press. Определение «моноклональный» указывает характер антитела, как полученного из преимущественно гомогенной популяции антител и не должно истолковываться как требующий продукции антитела любым определенным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены способами, описанными в Shepherd et al, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000).

Термин «моноклональные антитела» также включает «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащим к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. Например, способность связываться с альфа-4 интегрином. «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек антител фагов с использованием методик, описанных, например, в Clackson et al, 1991 Nature 352: 624-628 и Marks et al, 1991 J. Mol. Bioh, 222: 581-597. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных, кроличьих, бычьих, лошадиных, свиных и подобных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитела реципиента), в которых остатки от участка, определяющего комплиментарность (CDR) реципиента, заменены остатками из CDR нечеловеческих видов (донорские антитела), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркаса Fv человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе реципиента, ни во вносимом CDR или каркасной последовательности. Такие модификации делают для дальнейшего повышения качества и оптимизации действия антитела. В общем гуманизированные антитела будут включать по существу все из по меньшей мере, одного и обычно двух, изменяющихся доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все участки FR являются таковыми обобщающей последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина.

Выражение «линейные антитела» также включено в общий термин «антитело» и является парой тандема сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

«Вариантное антитело» (также включенное в общий термин «антитело») представляет собой молекулу, которая отличается в аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности «родительского» антитела посредством добавления, удаления и/или замещения одного или более аминокислотных остатка(ов) в последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте воплощения изобретения вариант включает одно или более замещения(й) аминокислот в одном или более гипервариабельном участке(ах) родительского антитела. Например, вариант может включать, по меньшей мере, одно замещение, например, от около одного до около десяти, и предпочтительно от около двух до около пяти, в одном или более гипервариабельных участках родительского антитела. Обычно вариант будет иметь аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%-ную идентичность аминокислотной последовательности с последовательностями вариабельных доменов тяжелых или легких цепей родительского антитела, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ную, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%-ную, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ную, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ную. Идентичность или гомология в отношении этой последовательности определяется в данном документе как процентное отношение аминокислотных остатков последовательности-кандидата, которое идентично остаткам родительского антитела, после распрямления последовательностей и вставки промежутков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, удалений или вставок в последовательность антитела не должно толковаться как влияющее на идентичность или гомологию последовательности.

Для анализа таких свойств необходимо сравнить Fab форму варианта с Fab формой родительского антитела или форму антитела полной длины с формой полной длины родительского антитела, например, так как было обнаружено, что вид антитела влияет на его активность в исследованиях биологической активности, описанных в этом описании. Интересующим вариантным антителом является таковое, которое проявляет, по меньшей мере, около 10-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 20-кратное, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 50-кратное увеличение биологической активности по сравнению с родительским антителом. «Родительским» является таковое, которое закодировано аминокислотной последовательностью, используемой для получения варианта. Предпочтительно, родительское антитело имеет участок человеческой сети и имеет постоянный участок(ки) человеческого антитела. Например, родительским антителом может быть гуманизированное или человеческое антитело.

«Выделенное антитело» представляет собой такое, которое было идентифицировано и выделено и/или извлечено из компонента его естественной окружающей среды. Загрязняющими компонентами его естественной окружающей среды являются вещества, которые вмешиваются в диагностическое или лечебное применение антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворы. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения антитело очищено (1) до более чем 95% по массе антитела, что определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с выдавливающей чашей, или (3) до гомогенности по SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием голубого Кумасси или, предпочтительно, серебряного красителя. Выделенные антитела включают антитела in situ в рекомбинантной клетке, поскольку, по меньшей мере, один компонент естественной окружающей среды антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело получают, по меньшей мере, одной стадией очистки.

«Фрагменты антитела» включают часть интактного антитела, обычно антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. «Одноцепочечные Fv» или фрагменты антител «sFv» включают домены антител VH и VL, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепочке. Обычно полипептид Fv, кроме того, включает полипептидное связующее звено между доменами VH и VH, которое позволяет sFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенспецифическими участками, такие фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же самой полипептидной цепочке (VH-VL). При использовании связующего звена, которое является слишком коротким, чтобы позволить образовать пару между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждены образовывать пару с комплиментарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Путь введения антител находится в соответствии с известными методами и хорошо известен и может включать, например, инъекцию или инфузию внутривенным, интраперитонеальным, внутримозговым, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным путями или введением в место повреждения, или посредством систем с замедленным высвобождением. Антитела могут вводиться непрерывно инфузией или болюсной инъекцией. Терапевтические композиции антител обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт для эксплуатации, например пакет или флакон с внутривенным раствором, имеющим заглушку, прокалываемую подкожной инъекционной иглой. «Фармацевтически приемлемые» эксципиенты (например, растворители, добавки) представляют собой таковые, которые могут приемлемо вводиться субъекту млекопитающему для получения эффективной дозы применяемого активного ингредиента. «Стабильной» композицией является таковая, в которой белок преимущественно сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. Под «стабильной» также обозначают композицию, которая проявляет небольшие или не проявляет признаков нестабильности, включая агрегацию и/или дезамидирование. Например, композиции, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут оставаться стабильными в течение, по меньшей мере, двух лет при хранении, как указано, при температуре 5-8°C.

Различные аналитические методики для измерения стабильности белка доступны в области техники и описаны в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) и Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90, например. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени, как показано представленными примерами. Хранение стабильных композиций, если это предпочтительно, допустимо в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, более предпочтительно 12 месяцев, более предпочтительно 12-18 месяцев и более предпочтительно в течение 2 лет или более.

Белок, такой как антитело или его фрагмент, «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтической композиции, если он не проявляет признаков агрегации, осаждения, дезамидирования и/или разложения при визуальной оценке цвета и/или прозрачности, или оценкой по светорассеянию УФ или хроматографией с вытеснением по размеру.

Белок «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтической композиции, если химическая стабильность в заданное время является таковой, что белок расценивается как все еще сохраняющий свою биологическую активность. Химическая активность может быть оценена определением и количественной оценкой химически измененных форм белка. Химическое изменение может включать модификации размера (например, усечение), которое может быть оценено с использованием хроматографии с вытеснением по размеру, SDS-PAGE и/или масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией в матрице с времяпролетным масс-анализом (MALDI/TOF MS), например. Другие типы химических изменений включают изменения заряда (например, появляющиеся как результат дезамидирования), которые могут быть оценены, например, ион-обменной хроматографией. Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтической композиции, если биологическая активность антитела в заданное время находится в пределах 10% (с ошибками анализа) биологической активности, проявляемой в момент времени, когда фармацевтическую композицию получали, что определяли в анализе связывания антигена, например.

Под «изотоническим» подразумевают, что интересующая композиция имеет преимущественно такое же осмотическое давление, как человеческая кровь. Изотонические композиции обычно имеют осмотическое давление от около 250 до 350 мОсм. Изотоничность может быть измерена с использованием осмометра типа давления пара или замораживания льда, например.

Как используется в данном описании, «буфер» относится к буферному раствору, который противодействует изменениям рН действием его кислотно-основных связанных компонентов. Буфер по настоящему изобретению имеет рН в диапазоне от около 3,0 до около 7,5; предпочтительно от около pH 4,0 до около 7,0; более предпочтительно от около pH 5,0 до около 6,5; и наиболее предпочтительно имеет pH около 6,0±0,5. pH любого значения между вышеуказанными диапазонами также рассматривается.

В фармакологическом смысле, в контексте настоящего изобретения, «терапевтически эффективное количество» антитела относится к количеству, эффективному для предотвращения или лечения расстройства, для лечения которого антитело является эффективным. «Расстройством» является любое состояние, на которое окажет благотворное влияние лечение антителом или белком. Оно включает острые или хронические расстройства или заболевания, включая такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому расстройству.

«Лечение» относится и к терапевтическому лечению, и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают таковых, которые уже имеют расстройство, а также таковых, у которых расстройство предотвращают.

«Консервант» представляет собой соединение, которое может быть включено в композицию, чтобы существенно уменьшать в ней бактериальное действие, таким образом способствуя получению композиции для множественного использования, например. Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензинаммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы являются длинноцепочечными соединениями), и хлорид бензэтония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.

Под «пациентом» или «субъектом» подразумевают включение любого млекопитающего. «Млекопитающее», которое подвергается лечению, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая, но не ограничиваясь, людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных из зоопарка, спортивных и комнатных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и подобные. Предпочтительно, млекопитающим является человек.

Под «Antegren®» обозначают включение антитела, также известного как AN100226 (кодовый номер антитела) или натализумаб (название USAN). Натализумаб представляет собой рекомбинантное, гуманизированное антитело к альфа-4 интегрину. Предпочтительно заболеванием или состоянием, подвергаемым лечению у млекопитающего, является таковое, когда вводят терапевтически эффективную дозу натализумаба.

«Стабильной» обозначают композицию, которая проявляется мало или не проявляет вообще признаков нестабильности, включая агрегацию и/или дезамидирование. Кроме того, «стабильная» также может относится к композиции, которая не проявляет каких-либо признаков нестабильности в течение более чем или ровно двух лет, при хранении, как указано.

2. Общее описание

В описании ниже и в следующих примерах описаны композиции для стабильных композиций антител. Определенные описанные стабильные композиции имеют высокие концентрации антител, но сохраняют фиксированный объем, где антитела в таких композициях являются стабильными и антитела не осаждаются из раствора или не агрегируют. Белки, иные чем антитела, также рассматриваются для композиций с высокой концентрацией.

Антитела обычно вводятся субъекту (например, человеку) в концентрации от около 0,01 мг/мл до около 200 мг/мл. Более типично, антитела варьируются в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 150 мг/мл. Однако существуют обстоятельства, при которых более высокие концентрации необходимо вводить пациенту, например, от около 15 мг/мл до около 200 мг/мл, более предпочтительно от около 15 мг/мл до 150 мг/мл, более предпочтительно от около 20 мг/мл до около 50 мг/мл, и наиболее предпочтительно от около 20 мг/мл и любое целое значение между этими показателями.

Композиции антител могут вводиться млекопитающему, нуждающемуся в лечении белком, в соответствии с известными методами. Такие методы включают, но не ограничиваются, внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечного, интраперитонеального, внутриспинномозгового, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального, интратекального, перорального, местного или ингаляционного путей. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения композицию антитела вводят млекопитающему внутривенным введением.

Соответствующая доза белка будет зависеть, например, от состояния, подвергаемого лечению, тяжести и течения состояния, того, вводится ли белок с превентивной или терапевтической целью, предшествующей терапии, клинической истории пациента и ответа на белок, типа используемого белка и выбора лечащего врача. Белок соответственно вводят пациенту в один момент или в течение ряда введений и может вводиться пациенту в любое время после постановки диагноза. Белок может вводиться в виде единственного лечения или в сочетании с другими лекарственными средствами или лечением, применимым в лечении рассматриваемого состояния. Как используется в данном описании, два (или более) агента можно вводить в комбинации, когда два агента вводят одновременно или вводят независимо таким образом, что агенты буду действовать одновременно.

В применении способов по настоящему изобретению соединения по настоящему изобретению могут использоваться отдельно, или в комбинации, или в комбинации с другими терапевтическими агентами. В определенных предпочтительных вариантах воплощения соединения по настоящему изобретению могут вводиться совместно с другими соединениями, обычно предписываемыми для таких состояний в соответствии с общепринятой медицинской практикой. Например, композиции по настоящему изобретению могут вводиться в комбинации с другими терапевтическими агентами или физическими методами лечения для лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза и болезни Крона.

2.1. Способ получения композиции антител

Способ может быть изменен, как известно специалисту в области техники, но обычно следует методике, такой как следующая. Получали ампулу из банка рабочих клеток, которая содержала клетки, которые производили интересующие антитело или белок. Получали инокулят. Культивировали или ферментировали клетки с дополнительной подкормкой, как необходимо. Собирали/очищали клетки центрифугированием и/или фильтрацией. Это можно было сделать, например, концентрированием клеток в 10 раз через спирально уложенный фильтр. Фильтровали через 0,2 мкм промежуточный фильтр, после фильтрации следовала очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (т.е. афинная хроматография) и обратная элюция. Композицию, содержащую антитело, затем обрабатывали при pH 3,6-3,7. Далее смесь подвергали вирусной фильтрации, затем выполняли стадию концентрирования/диафильтрации. Далее композиция могла быть очищена с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионообмен). Эту стадию можно повторить несколько раз. С этого момента композицию далее концентрировали стадией очистки с использованием системы Sephacryl S300HR® (т.е. гель-хроматография), где используемым буфером является фосфат/NaCl. Композицию, содержащую антитела, можно было далее концентрировать для получения композиций с высокой концентрацией (например, 20 мг/мл или более), если желательно. Композицию, содержащую антитела, затем далее буферировали и концентрацию доводили добавлением 0,02% (мас./об.) полисорбата 80. Эту композицию затем подвергали конечной фильтрации с использованием фильтра 0,2 мкм, и ее можно было распределить на этой стадии в 100 мл-10 л полипропиленовые бутыли. Таким образом полученные антитела или иммуноглобулины затем могли быть подвергнуты контролю качества (КК) и реализованы с гарантией качества (ГК). Вышеуказанное может быт сделано, например, для натализумаба, как схематически представлено ниже:

200 л материала (5,0 мг/мл)	2000 л материала (5,0, 20 мг/мл)
Ампула из банка рабочих клеток	Ампула из банка рабочих клеток
Получение инокулята	Получение инокулята
Ферментирование	Ферментирование (дополнительная питательная среда)
Сбор/очистка фильтрацией:10х концентрирование через спирально уложенный фильтр	Сбор/очистка центрифугированием и фильтрацией:10х концентрирование через спирально уложенный фильтр
Фильтрация 0,2 мкм промежуточного продукта	Фильтрация 0,2 мкм промежуточного продукта
Очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (афинная хроматография) (прямая элюция)	Очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (афинная хроматография) (обратная элюция)
Обработка рН 3,7-3,8	Обработка рН 3,6-3,7
--	Вирусная фильтрация
Концентрирование/диафильтрация	Концентрирование/диафильтрация
Очистка с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионобменная хроматография) (одиночный цикл)	Очистка с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионобменная хроматография) (множественные циклы)
Концентрирование	Концентрирование
Очистка с помощью Sephacryl S300HR® (гель-хроматография) (текущий буфер: гистидин/NaCl)	Очистка с помощью Sephacryl S300HR® (гель-хроматография) (текущий буфер: фосфат/NaCl)
--	(Дополнительное концентрирование до 20 мг/мл)
Буфер и доведение концентрации фосфатом/NaCl, 0,02% (мас./об.) полисорбата 80	Буфер и доведение концентрации (добавление 0,02% (мас./об.) полисорбата 80
Окончательная фильтрация 0,2 мкм и распределение(100 мл-1 л полипропиленовые бутыли)	Окончательная фильтрация 0,2 мкм и распределение (100 мл-10 л полипропиленовые бутыли)
Выполнение КК и реализация с ГК очищенной партии AN100226	Выполнение КК и реализация с ГК очищенной партии AN100226

2.2. Композиция антител

В одном аспекте изобретения иммуноглобулин рецептируют в концентрациях около 1,7, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0 или 50,0 мг/мл в 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl (pH 6,0±0,5) и 0,02% полисорбата 80. Если необходимо, уровень pH доводят до 6,0±0,5 фосфорной кислотой.

Один пример различных композиций показан ниже.

Количественная композиция: композиция фосфатного буфера

Компонент	Функция	Единица композиции (на мл) 1,7 мг/мл	Единица композиции (на мл) 5,0 мг/мл	Единица композиции (на мл) 20 мг/мл
Активный ингредиент:
Гуманизированное моноклональное антитело анти-α4-интегрин	Активный	1,7 мг	5,0 мг	20 мг
Другие ингредиенты:
Фосфат натрия, USP	Буфер и тоничность	1,4 мг	1,4 мг	1,4 мг
Хлорид натрия, USP	Буфер и тоничность	8,2 мг	8,2 мг	8,2 мг
Фосфорная кислота, NF	Доведение pH до 6,0±0,5	QS	QS	QS
Полисорбат 80, NF	Ингибирует агрегацию белка	0,2 мг	0,2 мг	0,2 мг
Вода для инъекций, USP	Разбавитель	QS до 1 мл	QS до 1 мл	QS до 1 мл

Любая из вышеуказанных композиций является оптимально разлитой в асептический флакон. Такими флаконами могут быть, например, нейтральные стеклянные флаконы типа I EP (например, 5,0 или 20 мл укупориваемые флаконы) с пробками из серого бутилкаучука Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 с алюминиевыми колпачками. Однако, другие подходящие асептические флаконы также рассматриваются. Например, композиции могут быть разлиты в бутыли как указано ниже:

БУТИЛИРОВАНИЕ
Составление смеси буфера фосфата/хлорида натрия/полисорбата 80, если необходимо
Стерилизация флаконов, пробок и производственного оборудования
Разведение буфером фосфат/хлорид натрия/полисорбат 80 антитела до 1,7 или 50 мг/мл, как требуется
Стерильная фильтрация
Асептическое заполнение и укупоривание флаконов Герметизация
Тестирование для реализации

Точнее, натализумаб полученный, например, методикой, обсуждаемой выше, может быть бутилирован, как указано ниже. Лекарственный продукт натализумаб 200 л и 2000 л может быть заполнен на полностью автоматизированной заполняющей линии, снабженной каналом для мытья, стерилизации и апирогенизации флаконов. Пробки, герметизирующий слой и заполняющее оборудование промывают и стерилизуют перед использованием. Этот способ позволяет проводить крупномасштабные обрабатывающие операции, согласующиеся с объемами, получаемыми при ферментировании 2000 л.

При необходимости композиционный буфер, около 10 мМ фосфата, около 140 мМ NaCl, pH 6,0±0,5, около 0,02% полисорбата 80, может быть введен в смесь набора класса 10000 и использоваться для разведения партии лекарственного продукта до конечной концентрации. Заданные значения концентрации, рН и плотности в ходе процесса предпочтительно достигают до фильтрации.

Натализумаб или другой иммуноглобулин в форме композиции может быть стерильно профильтрован через 0,2 мкм фильтр Millipak в уравнительный бак из нержавеющей стали, стерильный внутри. Заполнение, закупоривание пробкой и герметизация натализумаба являются полностью автоматизированными. Собирают образцы в ходе процесса для контроля стерильности партии; исследования заполненной массы и свободного пространства проверяют на всем протяжении процедуры заполнения. Заполненный лекарственный продукт хранят при охлаждении до около 2-8°C.

Заполнение проводят внутри лицензированных стерильных боксов класса 100. Заполняющая линия утверждена для обеспечения полного объема в рамках ожидаемых допустимых отклонений для объемов заполнения 5,0 мл и 20 мл. Всесторонний контроль окружающей среды проводят на всем протяжении процедуры заполнения и оценивают для подтверждения непрерывного соответствия этому стандарту. Контроль среды боксов производят ежеквартально для поддержания асептических процедур заполнения.

Альтернативно, 200 л полученного вещества лекарственного средства может быть бутилировано в соответствии со следующим примером. Флаконы, заполняющие иглы, фильтрующее устройство и трубы получали и стерилизовали перед использованием. Пробки могут быть получены от поставщика. Затем пробки стерилизовали перед заполнением.

Лекарственный продукт натализумаба или другого белка фасовали на полуавтоматической линии заполнения из приготовленной партии компонентов, с автоматизированным заполнением, немедленным закупориванием и последующей процедурой герметизации. Эта процедура является соответствующей для операций с партией малого объема.

Окончательный объем раствора затем стерильно фильтровали через 0,2 мк фильтр Millipak в стерильный стеклянный приемный сосуд в условиях окружающей среды класса 100. Текущая проверка и оценка в ходе процесса гарантировали, что допустимое отклонение наполнен