Способ диагностики заболеваний путем скрининга тканей, крови или жидкостей организма животных или человека на предмет обнаружения нефизиологических уровней гепсидина и его терапевтическое применение

Способ диагностики заболеваний путем скрининга тканей, крови или жидкостей организма животных или человека на предмет обнаружения нефизиологических уровней гепсидина и его терапевтическое применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка является частичным продолжением заявки №10/441089, зарегистрированной 19 мая 2003 г., которая является частичным продолжением заявки №10/299486, зарегистрированной 19 ноября 2002 г.

Железо является существенным микроэлементом, который требуется для роста и развития всех живых организмов; оно обязательно для синтеза ДНК и широкого спектра метаболических процессов. Однако нарушения метаболизма железа связаны с рядом существенных заболеваний млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, железодефицитную анемию, гемосидероз или гемохроматоз, заболевание с перегрузкой железом (Pietrangelo, А., (2002) Am J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, G403-414; Andrews, N.C. (2000) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 1, 75-98; Philpott, C.C. (2002) Hepatology 35, 993-1001; Anderson and Powell, (2002) Int J Hematol 76, 203-203; Beutler et al., (2001) Drug-Metab. Dispos. 29, 495-499). В физиологических условиях содержание железа у человека регулируется контролируемой адсорбцией. У млекопитающих адсорбция железа осуществляется преимущественно в двенадцатиперстной кишке и верхних отделах тощей кишки, и это является единственным механизмом, с помощью которого железо запасается и физиологически контролируется (Philpott, С.С. (2002) Hepatology 35, 993-1001). После адсорбции железо связывается с циркулирующим трансферрином и доставляется к тканям организма. В печени, главном месте запасания железа, связанное с трансферрином железо захватывается клетками с помощью опосредованного рецепторами эндоцитоза через классический трансферриновый рецептор (TfR1) (Collawn et al. (1990) Cell 63, 1061-1072) и, вероятно, в больших количествах через недавно идентифицированный гомологичный трансферриновый рецептор 2 (TfR2) (Kawabata et al. (1999) J Biol Chem 274, 20826-20832). Внеклеточный домен данного белка на 45% идентичен соответствующей части TfR1 (там же). TfR2 может также связывать трансферрин в связи с двумя молекулами железа и способствовать захвату железа. Мутации TfR2 связаны с определенными формами гемохроматоза, демонстрируя важную роль TfR2 в гомеостазе железа (Philpott, С.С. (2002) Hepatology 35, 993-1001; Camasehella et al., (2000) Nat. Genet. 25, 14-15; Fleming et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10653-10658). TfR2 экспрессируется преимущественно в печени (Fleming et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2214-2219; Subramaniam et al., (2002) Cell Biochem. Biophys. 36, 235-239), однако его точная клеточная локализация до сих пор не известна.

Существует механизм обратной связи, который увеличивает абсорбцию железа у индивидуумов с дефицитом железа, в то время как абсорбция железа снижается у людей с избытком железа (Pietrangelo, А., (2002) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 282, G403-414; Philpott, C.C. (2002) Hepatology 35, 993-1001; Anderson and Powell, (2002) Int J Hematol 76, 203-203). При наследственном гемохроматозе (НН), однако, данный регуляторный механизм, очевидно, нарушается; несмотря на избыток железа, повышенное количество железа абсорбируется из пищи, и это ведет к аккумуляции избытка железа во внутренних органах, приводя к дисфункции и недостаточности органов. Молекулярные механизмы, с помощью которых кишечник отвечает на изменения в потребностях организма в железе, плохо изучены. В данном контексте гепсидин, недавно идентифицированный пептид млекопитающих (Krause et al. (2000) FEBS Lett 489, 147-150: Park et al. (2001) J Biol Chem 276, 7806-7810), претендует на роль ключевого сигнального компонента, регулирующего гомеостаз железа (Philpott С.С. (2002) Hepatology 35, 993-1001; Nicolas et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 4596-4601).

Гепсидин представляет собой небольшой обогащенный цистеином пептид, продуцируемый преимущественно в печени. Данная молекула регулирует абсорбцию железа в кишечнике и ингибирует высвобождение железа из макрофагов. Гепсидин был первоначально выделен из плазмы крови и мочи человека как пептид из 25 аминокислот (а.к.), проявляющий антимикробную активность (Krause et al. (2000) FEBS Lett 489, 147-150; Park et al. (2001) J Biol Chem 276, 7806-7810). Впоследствии, при поиске специфичных для печени генов, которые регулируются железом, были идентифицированы кДНК гепсидина, кодирующие 83 а.к. предшественник у мышей и 84 а.к. предшественник у крысы и человека, включая предполагаемый 24 а.к. сигнальный пептид (Pigeon et al. (2001) J Biol Chem 276, 7811-7819). Структура кДНК гепсидина человека предполагает, что он транслируется как препропептид из 84 аминокислот, который в результате процессинга с аминоконца превращается в прогепсидиновый пептид из 60 аминокислотных остатков, который подвергается дополнительному процессингу до гепсидинового пептида из 25 аминокислот (Park et al. (2001)).

Экспрессия гепсидина исчезает у мышей с избытком железа из-за направленного разрушения гена вышележащего стимуляторного фактора 2 (Usf2), проявляющих тот же фенотип, что и найденный у мышей hfe-/- (Nicolas G., et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 8780-8785), приводя к заключению, что данный пептид играет центральную роль в метаболизме железа. Наоборот, гиперэкспрессия гепсидина, как показано, ведет к тяжелой железодефицитной анемии у трансгенных мышей (Nicolas et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 4596-4601), указывая на то, что гепсидин является центральным регулятором гомеостаза железа. Более того, недавние исследования показали, что экспрессия гепсидина в печени снижается у hfe нокаутной мыши (Ahmad et al. (2002) Blood Cells Mol Dis 29, 361-366), а мутации в пептиде гепсидине связаны с тяжелым ювенильным гемохроматозом (Roetto et al. (2003) Nat Genet 33, 21-22), что открывает новые перспективы для понимания молекулярного патогенеза избытка железа. Однако механизм, с помощью которого гепсидин поддерживает баланс запасов железа в организме или корректирует абсорбцию железа пищи при физиологических и патологических состояниях, все еще ожидает своего открытия.

В данном отношении клеточная локализация данного пептида и его регуляция при различном уровне железа имеют важное значение для исследования функции гепсидина. Хотя анализ методом Нозерн-блоттинга уровней мРНК гепсидина человека и мыши в различных органах позволил выявить, что гепсидин преимущественно экспрессируется в печени (Krause et al. (2000) FEBS Lett 489, 147-150; Park et al. (2001) J Biol Chem 276, 7806-7810; Nicolas et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 4596-4601), не существует данных о клеточной локализации данного пептида.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение касается регуляции гепсидином захвата железа клетками млекопитающих и применения гепсидина и/или специфических антител против гепсидина для диагностики заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма железа. Наборы для диагностического определения согласно изобретению могут быть, в частности, использованы для скрининга всей популяции либо людей, либо животных и идентификации тех субъектов, которые имеют данные заболевания.

В одном аспекте изобретение представляет собой способ диагностики патологического состояния, характеризующегося нефизиологическими уровнями гепсидина, включающий получение образца ткани или жидкости от субъекта; контактирование образца с антителом или его фрагментом, который специфически связывает полипептид из средней части (аминокислоты от 20 до 50) или С-конца (аминокислоты от 65 до 84), и количественное определение уровня гепсидина с применением теста, основанного на связывании антитела и полипептида; где нефизиологический уровень гепсидина является показателем патологического состояния. В одном аспекте согласно изобретению чувствительные диагностические методы и наборы, как установлено, способны определять прогепсидин в плазме человека. Изобретение открывает широкий диапазон терапевтических перспектив, где антитело против гепсидина и диагностические методы и наборы могут быть использованы для определения гепсидина в качестве параметра, характеризующего прогрессирование заболеваний, указанных выше, и после терапии.

В одном осуществлении изобретение касается получения и очистки белка гепсидина, включая прогепсидин и его фрагменты. В другом осуществлении изобретение касается специфических антител против гепсидина, или их фрагментов, или вариантов, которые, в свою очередь, могут быть использованы в иммунных тестах для определения белка гепсидина, включая прогепсидин у предполагаемых людей или животных.

В другом аспекте изобретения диагностические способы и наборы для определения гепсидина могут быть использованы в генетических технологических подходах, таких как для определения гиперэкспрессии или снижения экспрессии гепсидина.

В еще одном аспекте изобретения гепсидин может быть использован для терапевтического лечения описанных здесь заболеваний путем лечения субъектов гепсидином и агонистами или антагонистами гепсидина. Захват железа клетками может модулироваться путем варьирования концентрации гепсидина, ингибирования связывания гепсидина с железом или рецептором TfR2. Соответственно, гепсидин и агонисты или антагонисты гепсидина могут быть использованы для лечения состояний, при которых существуют нарушения метаболизма железа. Например, такие вещества могут быть пригодны для лечения указанных выше заболеваний.

Эти и другие аспекты согласно изобретению будут лучше поняты при ссылке на последующие чертежи и подробное описание.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность белка-предшественника гепсидина человека, содержащая на N-конце типичный 24 а.к. сигнальный пептид (линия между а.к. 24 и 25 указывает на предполагаемый сайт отщепления сигнальной последовательности), 35 а.к. про-область и с-концевые 20-, 22- и 25- а.к. пептиды гепсидина, отличающиеся только по укорочению с N-конца, как отмечено стрелками. После отщепления сигнального пептида от предшественника гепсидина получается молекула прогепсидина, состоящая из 60 а.к. Предполагаемыми дисульфидными связями в гепсидине 25 являются 1-8, 2-7, 3-6 и 4-5, как показано прерывистыми линиями (из Hunter et al., 20). Антисыворотки EG (1 и 2)-HepN выработаны против предшественника гепсидина, а.к. 28-47, антисыворотка EG(1)-HepC, выработана против а.к. 70-84, как указано символами антител.

Фиг.2 иллюстрирует следующее: (А): РТ-ПЦР анализ печени человека (линии 2 и 3) и клеток HepG2 (линии 4 и 5), показывающий экспрессию гена гепсидина. Указан лэддер п.н. ДНК (линии 1 и 7). Линия 6 представляет собой негативный контроль. (B-D): анализ гепсидина иммуноблоттингом в экстрактах морской свинки (линии 1) и печени человека (линии 2), а также в клетках HepG2 (линии 3), сыворотке человека (линии 4) и скелетной мышце морской свинки (линии 5, контроль) с антителами EG(1)-HepN (В), EG(2)-HepN (С) и EG(1)-HepC (D). Отмечаются иммунореактивные полосы в области 10 и 20 кДа, полученные со всеми антителами, узнающими различные эпитопы в предшественнике гепсидина. (Используемые маркеры молекулярной массы: фосфорилаза В, 105 кДа; глутаматдегидрогеназа, 53 кДа; карбоангидраза, 34 кДа; миоглобин синий, 23 кДа; миоглобин красный, 17 кДа; лизоцим, 13 кДа; апротинин, 7 кДа; инсулин, 3 кДа).

Фиг.3 иллюстрирует определение гепсидина в клетках HepG2 с помощью флуоресцентной микроскопии с применением антител EG(1)-HepN (A), EG(2)-HepN (В) и EG(1)-HepC (С) (Масштаб отрезка 8 мкм).

Фиг.4 иллюстрирует клеточную локализацию гепсидина в печени морской свинки (A-F) и человека (G-I). Парафиновые срезы при иммуноокрашивании антителами, специфичными к разным областям EG(1)-HepN (A, D, G), EG(2)-HepN (В, Е, Н) и EG(1)-HepC (С, F, I), проявляют отчетливую иммунореактивность в базолатеральном домене мембраны гепатоцитов (стрелки). (Увеличение: А-С, X 180; D-I, X 540).

На фиг.5 иллюстрируются иммуногистохимически обработанные срезы печени морской свинки (А, антитело EG(1)-HepN; В, антитело EG(2)-HepN; С, антитело EG(1)-HepC, проявляющие четкую зональность гепсидина в печеночных дольках, со снижением иммунореактивности от перипортальных зон (звездочки) к центральным венам (головки стрелок). Отмечается, что не найдено никакой иммунореактивности в гепатоцитах вокруг центральных вен. (Стрелка в В указывает на портальную триаду.) (А-С, X 180).

На фиг.6 иллюстрируются результаты ИФА для циркулирующего прогепсидина человека. Представлена характерная стандартная кривая с концентрациями гепсидина-(28-47) в нг/мл и экстинкцией раствора ИФА при длине волны 450 нм. Отмечается высокая разрешающая способность в диапазоне от 4 до 400 нг/мл гепсидина - (28-47).

На фиг.7 иллюстрируются нанесенные рамки величин венозных сывороточных концентраций прогепсидина у 2 6 здоровых добровольцев (контроль), 40 больных хронической почечной недостаточностью, 19 больных хронической почечной недостаточностью и почечной анемией и 35 больных наследуемым гемохроматозом. Линия в рамке указывает медиану, кружок указывает среднее. Нижний и верхний конец рамки указывает 1-й и 3-й квартиль, усы - минимальные и максимальные величины. Прерывистая линия отмечает средний уровень циркулирующего иммунореактивного прогепсидина у контрольной группы (106,16 нг/мл).

На фиг.8 иллюстрируется корреляция между прогепсидином и железом (А), ферритином (В) и насыщением трансферрина (С) в пробах больных, леченных и не леченных НН. Авторы отмечают, что в их пробах заметной корреляции не найдено.

На фиг.9 иллюстрируется полная нуклеотидная (SEQ ID NO:1) и аминокислотная последовательности (SEQ ID NO:2) одной формы гепсидина, воспроизведенные из базы данных GenBank nos. поступления NM021175 и ААН20612 соответственно.

Фиг.10 иллюстрирует следующее: (А): РТ-ПЦР анализ почки человека (линия 2), мыши (линия 3) и крысы (линия 4), показывающий экспрессию гена гепсидина. Указан лэддер п.н. ДНК (линии 1 и 5). (В, С): анализ гепсидина иммуноблоттингом в экстрактах почки человека (линии 1), крысы (линии 2) и мыши (линии 3), а также в моче человека (линии 4) с антителами EG(2)-HepN (В) и EG(1)-HepC (С). Отмечаются иммунореактивные полосы в области 9,5 кДа, полученные с обоими антителами, узнающими различные эпитопы в предшественнике гепсидина. (Используемые маркеры молекулярной массы: фосфорилаза В, 105 кДа; глутаматдегидрогеназа, 53 кДа; карбоангидраза, 34 кДа; миоглобин синий, 23 кДа; миоглобин красный, 17 кДа; лизоцим, 13 кДа; апротинин, 7 кДа; инсулин, 3 кДа).

Фиг.11 иллюстрирует клеточную локализацию гепсидина в коре почки крысы. Парафиновые срезы при иммуноокрашивании антителами, специфичными к разным областям, EG(1)-HepC (A), EG(2)-HepC (В), EG(1)-HepN (С) и EG(2)-HepN (D), проявляют отчетливую иммунореактивность в дистальных отделах трубочек коры почки. В некоторых трубочках иммунореактивность распределяется в цитоплазме эпителиальных клеток (стрелки), но в других иммунореактивность локализуется у апикального полюса соответствующих клеток (D, головки стрелок). Отмечается, что в клубочках (звездочки) отсутствует какая-либо иммунореактивность гепсидина. (Увеличение: А, X 90; B-D, X 180).

Фиг.12 иллюстрирует тканевое распределение гепсидина в почке крысы (А и С) и мыши (В и D). Иммуногистохимия с антителом EG(2)-HepN выявляет внешнюю зону мозгового слоя (А и В), с заметным снижением иммунореактивности гепсидина между наружной полоской (os) и внутренней полоской (is), что показано черными пунктирными дугами. С и D показывают отсутствие иммунореактивности гепсидина во внутреннем мозговом слое (m). Сильная иммунореактивность наблюдается в коре (с). (Увеличение: А, В и D, X 90; С, X 180.)

Фиг.13 иллюстрирует субклеточную локализацию гепсидина в почке крысы при иммуноокрашивании антителами EG(1)-HepN (A), EG(2)-HepN (В и D) и EG(1)-HepC (С). В некоторых дистальных трубочках иммунореактивность гепсидина распределяется в цитоплазме эпителиальных клеток (стрелки), но в других иммунореактивность интенсивно концентрируется в направлении апикального полюса соответствующих клеток (черные головки стрелок). Отмечается, что в клубочках (звездочки) и проксимальных трубочках (полые головки стрелок) отсутствует какая-либо иммунореактивность гепсидина. (Увеличение: A-D, X 360.)

Фиг.14 иллюстрирует клеточную локализацию гепсидина в почке человека. Антитела EG(1)-HepN (A), EG(2)-HepN (В и D) и EG(1)-HepC (С) выявляют отчетливую иммунореактивность в дистальных трубочках коры почки (стрелки). В тех же самых трубочках существуют различия внутриклеточного распределения иммунореактивности гепсидина, с наличием интенсивно (черные головки стрелок) и слабо (полые головки стрелок) иммунореактивных эпителиальных клеток с цитоплазматическим окрашиванием. В клубочках не наблюдается какой-либо иммунореактивности (звездочки). (Увеличение: А-С, X 180; D, X 360.)

Фиг.15 иллюстрирует определение иммунореактивности гепсидина на апикальном полюсе дистальных клеток трубочек почки человека антителами EG(1)-HepN (A), EG(2)-HepN (В и D) и EG(2)-Hep С (С). Отмечается интенсивная иммунореактивность на апикальном полюсе секреторных эпителиальных клеток (черные головки стрелок, в некоторых клетках отсутствует иммунореактивность гепсидина (полые головки стрелок). Звездочка указывает клубочек. (Увеличение: А-С, X 180; D, X 360.)

На фиг.16 иллюстрируются нанесенные рамки величин венозных сывороточных концентраций и концентраций в моче прогепсидина у 22 здоровых добровольцев (контроль) и 22 больных хронической почечной недостаточностью. Линия в рамке указывает медиану, а кружок указывает среднее. Нижний и верхний конец рамки указывает 1-й и 3-й квартиль, усы - минимальные и максимальные величины. Прерывистая линия отмечает средний уровень циркулирующего иммунореактивного прогепсидина у контрольной группы (104,2 нг/мл).

Лучший вариант осуществления изобретения

В настоящем изобретении описывается, что гепсидин регулирует захват железа клетками млекопитающих и нефизиологическая экспрессия гепсидина ведет к заболеванию с вовлечением нарушения метаболизма железа. Применяемый здесь термин гепсидин означает прогепсидин, гепсидин или его фрагменты. Физиологическая концентрация гепсидина в крови составляет в диапазоне приблизительно от 50 приблизительно до 150 нг/мл. Нефизиологические концентрации находятся ниже или выше данного диапазона. Нефизиологические количества белка гепсидина или его фрагмента связаны с нарушениями метаболизма железа, ведущими к дефициту железа или его избытку, такими как железодефицитная анемия; заболевания с генетическим или не генетическим избытком железа, такие как гемосидероз и гемохроматоз или вторичный гемохроматоз, ацерулоплазминемия, гипотрансферринемия, атрансферринемия; заболевания с избытком железа неопределенного происхождения, например, в случае заболеваний билиарной системы, болезней печени, особенно алкогольных заболеваний печени, неалкогольного стеатогепатоза и хронических инфекций при гепатите В и С; заболевания с нарушением утилизации железа, такие как сидеробластная анемия, талассемия; гематологические заболевания, такие как лейкоз, полиглобулия, макроцитарная, микроцитарная или нормоцитарная анемия, анемия с ретикулоцитозом, гемолитическая анемия; нарушения ретикулоэндотелиальной системы, обусловленные инфекциями и заболеваниями; воспаления и инфекции, включая сепсис; иммунологические заболевания и опухоли, такие как карцинома, саркома, лимфома, которые ведут к нефизиологическим концентрациям гепсидина; нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Вильсона. Данное открытие позволяет разработать тесты для определения белка гепсидина и его фрагментов и его последующую очистку с сохранением его нативной конфигурации и физиологической активности. Изобретение частично основано на открытии, что у больных, страдающих от определенных нарушений, в ткани, крови и жидкостях организма, будь то человек или животное, присутствует белок гепсидин.

В данном изобретении впервые показано, что белок гепсидин, включая прогепсидин, у больных с данными нарушениями присутствует в ткани, крови и жидкостях организма, будь то человек или животное, в концентрациях, существенно превышающих найденные у нормальных людей или животных, которые не подвержены данным заболеваниям. Это достигнуто путем тестирования образца ткани, крови или жидкости организма у больного и определения присутствия и количества белка гепсидина и/или прогепсидина. Определение и количественное измерение любого белка гепсидина, включая прогепсидин или его фрагмент, в ткани, крови или жидкостях организма в соответствии с данным изобретением пригодно для подтверждения клинического диагноза описанных здесь заболеваний у заболевших пациентов и прослеживания течения заболевания. Изобретение пригодно также для мониторинга заболевания в течение и после периода лечения агентами, которые тестируются на их способность стабилизировать, снижать или предотвращать наступление таких заболеваний.

Только в целях описания изобретение будет описано в плане (а) получения белка гепсидина, включая прогепсидин или его фрагменты; (b) получения антител, которые специфически связывают белок гепсидин, включая прогепсидин или его фрагменты; (с) диагностических тестов и наборов для диагностики подтипов или мониторинга описанных здесь заболеваний; (d) способов гиперэкспрессии и отрицательной регуляции гепсидина или прогепсидина и (е) терапевтического лечения описанных здесь заболеваний.

В одном аспекте изобретения заявители предлагают способ определения роли гепсидина в физиологических условиях и при соответствующих заболеваниях. В другом аспекте изобретения заявители предлагают специфические антитела против средней части и С-конца молекулы предшественника гепсидина. В данном аспекте изобретения эти антитела применяли для определения клеточной локализации гепсидина в печени человека и морской свинки. Создан чувствительный ИФА, который определяет прогепсидин в человеческой сыворотке у больных с НН, хронической почечной недостаточностью (CRI) и почечной анемией (RA). Авторы показали, что прогепсидин выходит в кровь через базолатеральную мембрану гепатоцитов и экскретируется почками. Так как сывороточные уровни гепсидина существенно негативно регулируются при НН и при хронической RA, гепсидин должен играть роль в патофизиологии данных заболеваний.

Получение белка гепсидина

Выделение белка гепсидина из крови и жидкостей организма

В целях согласно изобретению термин белок гепсидин определяется как любой полипептид гепсидин млекопитающих, имеющий приблизительно 80-процентную идентичность аминокислотной последовательности с предсказанной аминокислотной последовательностью, опубликованной Pigeon и соавторами ((2001) J. Biol. Chem. 276, 7811-7819). Предлагаемые здесь белки гепсидины включают прогепсидин, гепсидин и его фрагменты. Предлагаемые здесь белки гепсидины включают также белки, характеризуемые аминокислотными последовательностями, сходными с таковыми очищенных белков гепсидинов, но в которых есть природные или преднамеренно созданные модификации. Например, модификации в пептиде гепсидине или последовательностях ДНК могут быть сделаны специалистами в данной области с применением известных способов. Интересующие модификации в последовательности белка гепсидина могут включать в себя изменение, замену, замещение, вставку или делецию выбранного аминокислотного остатка в кодирующей последовательности. Например, один или более остатков цистеина могут быть удалены или заменены другой аминокислотой для изменения конформации молекулы. Способы вызвать такое изменение, замещение, замену, вставку или делецию хорошо известны специалистам в данной области (см., например, патент США №4518584). Предпочтительно, чтобы такое изменение, замещение, замена, вставка или делеция сохраняли желаемую активность белка. Области белка гепсидина, которые важны для функции белка, могут быть определены различными способами, известными в данной области, включая метод сканирования аланина, который включает систематическую замену одной или ряда аминокислот на аланин, с последующим тестированием полученного содержащего аланин варианта на биологическую активность. Данный тип анализа дает возможность оценить важность замененной(ных) аминокислоты(от) для биологической активности.

Получение белка гепсидина может быть осуществлено с помощью выделения белка гепсидина из ткани, крови или жидкостей организма человека или животных, страдающих гемохроматозом, железодефицитной анемией, гемосидерозом, циррозом печени и другими такими описанными здесь заболеваниями, с применением стандартных способов, известных специалистам в данной области. Такие способы, включенные в изобретение, также относятся к способам получения белка гепсидина, включая выращивание клеток-хозяев в культуре в подходящей культуральной среде и очистку белка гепсидина из клеток или из культуры, в которой растут клетки.

Различные способы, известные в данной области, могут быть использованы для получения любого из выделенных белков гепсидинов согласно изобретению. Например, белок гепсидин может быть также получен путем химического синтеза аминокислотной последовательности белка гепсидина (Pigeon et al., (2001) J. Biol. Chem. 276, 7811-7819) по предсказанной при клонировании и секвенировании кДНК, кодирующей белок гепсидин. Данная информация о последовательности белка гепсидина может быть использована для предсказания подходящей аминокислотной последовательности фрагмента белка гепсидина для химического синтеза с применением стандартных способов пептидного синтеза, известных в данной области. Данные способы включают в себя твердофазный метод, разработанный R. Bruce Merrifield, Erickson and Merrifield, «Solid-Phase Peptide Synthesis», in The Proteins, Volume 2, H.Neurath & R.Hill (Eds.) Academic Press, Inc., New York pp.255-257; Merrifield, (1986) «Solid phase synthesis», Science, 242:341-347). В твердофазном методе аминокислоты постепенно добавляют к растущей пептидной цепи, которая соединена с нерастворимым матриксом, таким как полистироловые шарики. Главное преимущество данного способа состоит в том, что желаемый продукт на каждой стадии связывается с шариками, которые могут быть быстро отфильтрованы и промыты, и, таким образом, устраняется необходимость очищать промежуточные продукты. Все реакции выполняют в одном сосуде, что исключает потери, обусловленные повторяющимися переносами продуктов. Данный твердофазный способ химического пептидного синтеза может быть легко автоматизирован, что делает его подходящим для рутинного синтеза пептидов, содержащих приблизительно 50 остатков, с хорошими выходом и степенью чистоты (Stewart and Young, (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.; Tam et al., (1983) J. Am. Chem. Soc, 105: 6442). Например, может быть синтезирован фрагмент белка гепсидина, соответствующий аминокислотным остаткам с 1 по 50 или с 34 по 84, как изображено на фиг.9. На самом простом уровне для получения небольших пептидов и фрагментов белка гепсидина особенно пригоден имеющийся в продаже аппарат для синтеза пептидов. Фрагменты применяют, например, для выработки антител против природного белка гепсидина.

Специалист в данной области может легко следовать известным способам выделения белков, с тем чтобы получить один из выделенных белков/пептидов гепсидина согласно изобретению. Они включают в себя, не ограничиваясь этим, иммунохроматографию, ВЭЖХ, исключающую по размеру хроматографию и иммуноаффинную хроматографию. См., например, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag (1994); Sambrook, et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.

Наконец, для дополнительной очистки белка гепсидина может быть использована одна или более стадий высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) с применением гидрофобных сред для ОФ-ВЭЖХ, например силикагеля, имеющего дополнительный метил или другие алифатические группы. Некоторые или все из указанных выше стадий очистки в различных сочетаниях могут быть также применены для обеспечения по существу гомогенного выделенного белка гепсидина. Очищенный таким образом белок гепсидин является по существу свободным от других белков млекопитающих и определяется в соответствии с настоящим изобретением как выделенный белок.

Последовательность белка гепсидина может быть идентифицирована с применением метода деградации белковой последовательности по Эдману. В данном методе последовательно за один цикл удаляется один аминокислотный остаток с аминоконца пептида для последующей идентификации последовательности с помощью хроматографических способов. См., например, способы, описанные в Konigsberg and Steinman, (1977) Strategy and Methods of Sequence Analysis, in Neurath and Hill (eds.), The Proteins (3rd ed.) Vol.3, pp.1-178, Academic Press. Кроме того, анализ последовательности белка гепсидина может быть ускорен при применении жидкофазного автоматического аминокислотного секвенатора в соответствии с описанным способом (Hewick et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:7990-7997; Stein and Undefriend, (1984) Analy. Chem., 136:7-23), что позволяет тем самым анализировать пикомолярные количества белка гепсидина.

Очищенный белок гепсидин может быть применен в тестах связывания in vitro, которые хорошо известны в данной области, для идентификации молекул, которые связывают белок гепсидин. Данные молекулы включают в себя, не ограничиваясь этим, например, небольшие молекулы, молекулы из комбинаторных библиотек, антитела или другие белки. Молекулы, идентифицированные в тесте связывания, затем тестируют на предмет активности агониста или антагониста в тканевой культуре in vitro или на животных моделях, которые хорошо известны в данной области. Вкратце, молекулы титруют во множестве клеточных культур или на животных и затем тестируют, повлияет ли это на смерть клетки/животного или продлит выживаемость клеток/животного.

Кроме того, связывающие молекулы могут комплексироваться с токсинами, например рицином или токсинами холеры, или с другими соединениями, которые являются токсичными для клетки. Комплекс связывающей молекулы с токсином затем направленно доставляется к опухоли или другой клетке за счет специфичности связывания молекулы с белком гепсидином.

Клонирование и экспрессия рекомбинантного белка гепсидина

В других осуществлениях получение белка гепсидина может быть достигнуто с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Например, подходящие нуклеотидные последовательности, кодирующие белок гепсидин, могут быть синтезированы, клонированы и экспрессированы в подходящих клетках-хозяевах. Так как последовательность ДНК, кодирующая белок гепсидин, известна (Pigeon et al., (2001) J. Biol. Chem. 276, 7811-7819), зонды ДНК могут быть синтезированы с помощью стандартных способов, известных в данной области, для скрининга библиотек кДНК, полученных из печеночной ткани человека или животных, страдающих гемохроматозом, железодефицитной анемией, гемосидерозом, циррозом печени и другими описанными здесь заболеваниями, на специфические кДНК белка гепсидина. Данные зонды кДНК могут быть дополнительно использованы для выделения полного семейства генов белка гепсидина из данных библиотек кДНК с применением способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. См., например, способы, описанные в Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Chapter 7.

Методы гибридизации пригодны для скрининга рекомбинантных клонов с применением меченых смешанных синтетических олигонуклеотидных зондов, где каждый зонд является потенциально полностью комплементарным специфической последовательности ДНК в гибридизуемом образце, который включает гетерогенную смесь денатурированной двуспиральной ДНК. Для такого скрининга гибридизацию предпочтительно выполняют либо на односпиральной ДНК, либо на денатурированной двуспиральной ДНК. При применении строгих условий гибридизации с целью избежания неспецифического связывания возможно, например, учитывать авторадиографическую визуализацию специфического клона ДНК путем гибридизации ДНК-мишени с таким единичным зондом в смеси, который является полностью ей комплементарным (Wallace, et al., (1981) Nucleic Acids Research, 9:879).

Альтернативно, экспрессионную библиотеку можно подвергнуть скринингу не прямо на белок гепсидин согласно изобретению, имеющий, по меньшей мере, один эпитоп, а с применением антител к белку. Такие антитела могут быть как поликлональными, так и моноклональными и использоваться для определения продукта экспрессии, указывая на присутствие белка гепсидина. Обычно конструируется библиотека лямбда gtll и проводится иммунологический скрининг в соответствии со способом Huynh, et al., (1985) (in DNA Cloning: A Practical Approach, D.M.Glover, ed., 1:49).

Создание специфических последовательностей ДНК, кодирующих белок гепсидин, может быть осуществлено также с помощью: (1) выделения последовательности двуспиральной ДНК из геномной ДНК и (2) химического получения последовательности ДНК для обеспечения необходимыми кодонами для интересующего белка.

Способ полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть применен для амплификации индивидуальных членов семейства гепсидина для последующего клонирования и экспрессии кДНК белков гепсидинов (см., например, патенты США №№4683202; 4683195; 4889818; Gyllensten et al., (1988) Proc. Nat′l Acad. Sci. USA, 85:7652-7656; Ochman et al., (1988) Genetics, 120:621-623; Triglia et al., (1988) Nucl. Acids. Res., 16:8156; Frohman et al., (1988) Proc. Nat′l Acad. Sci. USA, 85:8998-9002; Loh et al., (1989) Science, 243:217-220).

Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующие последовательности белка гепсидина или его фрагментов и подходящие сигналы, контролирующие транскрипцию/трансляцию, могут быть применены методы, которые хорошо известны специалистам в данной области. Данные методы включают способы рекомбинантной ДНК in vitro, способы синтеза и способы рекомбинации in vivo/генетической рекомбинации. См., например, способы, описанные в Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Chapter 12.

Разнообразные системы хозяев экспрессионных векторов могут быть применены для экспрессии белка гепсидина или его фрагмента. Они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные экспрессионными векторами рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующую последовательность белка гепсидина или его фрагментов; дрожжи, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами, содержащими кодирующую последовательность белка гепсидина или его фрагмента; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусом), содержащими кодирующую последовательность белка гепсидина или его фрагмента; или системы животных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, аденовирусом, вирусом коровьей оспы), содержащими кодирующую последовательность белка гепсидина или его фрагмента.

Экспрессионные элементы данных векторов варьируются по их количеству и специфичности. В зависимости от применяемых хозяина/векторной системы любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы, может быть применено в экспрессионном векторе. Например, при клонировании в бактериальных системах могут быть применены индуцибельные промоторы, такие как pL бактериофага лямбда, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac гибридный промотор) и тому подобное; при клонировании в клеточных системах насекомых могут быть применены такие промоторы, как бакуловирусный полигедриновый промотор; при клонировании в клеточных системах млекопитающих могут быть применены такие промоторы, как поздний аденовирусный промотор или промотор вируса коровьей оспы 7,5К. Промоторы, получаемые с помощью рекомбинантной ДНК или синтетических способов, могут также быть применены для обеспечения транскрипции вставленной кодирующей последовательности белка гепсидина или его фрагмента.

В дрожжах может быть применен ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы. В качестве обзоров см. Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, (1988) Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience Ch. 13; Grant et al., (1987) Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, (1987) Acad. Press, N.Y., Vol.153, hh.516-544; Glover, (1986) DNA Cloning, Vol.II, IRL Press, Wash., D.C. Ch.3; и Bitter, (1987) Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol.152, pp.673-684 и The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, (1982) Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II. Для тестов комплементарности в дрожжах кДНК белков гепсидинов или их фрагментов могут быть клонированы в эписомальные плазмиды дрожжей (Yep), которые автономно реплицируются в дрожжах из-за присутствия в дрожжах 2 мкм кольцевой плазмиды. Последовательность белка гепсидина или его фрагмента может быть клонирована ниже, либо конститутивного промотора дрожжей, такого как ADH или LEU2, либо индуцибельного промотора, такого как GAL (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein (1986) In DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C). Конструкты могут содержать 5′ и 3′ нетранслируемые области родственной мРНК белка гепсидина или те, которые соответствуют гену дрожжей. Плазмиды YEp трансформируют с высокой эффективностью, и плазмиды являются крайне стабильными. Альтернативно, могут быть применены векторы, которые стимулируют интеграцию чужеродных последовательностей ДНК в хромосому дрожжей.

Особенно хорошей экспрессионной системой, которая может быть использована для экспрессии белка гепсидина или