Вакцинная композиция, содержащая трансферрин-связывающий белок и hsf из грамотрицательных бактерий

Вакцинная композиция, содержащая трансферрин-связывающий белок и hsf из грамотрицательных бактерий

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и вакцинам на основе грамотрицательных бактерий, их изготовлению и применению таких композиций в медицине. Более конкретно, изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим как трансферрин-связывающий белок, так и Hsf. Присутствие обоих этих антигенов ведет к более высоким уровням продуцирования бактериальных антител.

Предшествующий уровень техники

Грамотрицательные бактерии являются возбудителями, вызывающими ряд патологий человека, и существует необходимость разработки эффективных вакцин против многих таких бактерий. В частности, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa и Yersinia enterocolitica представляют собой грамотрицательные бактерии, являющиеся причиной патологий, которые можно лечить вакцинированием.

Neisseria gonorrhoeae является этиологическим агентом гонореи, одного из наиболее часто регистрируемых в мире передающихся половым путем заболеваний с ориентировочной заболеваемостью 62 миллиона случаев в год (Gerbase et al., 1998, Lancet 351; (Suppl.3) 2-4). Клинические проявления гонореи включают воспаление слизистых оболочек урогенитального тракта, просвета прямой кишки и неонатальные глазные инфекции. Восходящие гонококковые инфекции у женщин могут привести к бесплодию, внематочной беременности, хроническому воспалительному заболеванию таза и образованию тубоовариального абцесса. Сепсис, артрит, эндокардит и менингит связаны с осложненной гонореей.

Большое количество штаммов гонококков с устойчивостью к антибиотикам способствует повышенной заболеваемости и осложнениям, связанным с гонореей. Заманчивой альтернативой лечению гонореи антибиотиками явилось бы ее предупреждение путем вакцинации. В настоящее время для инфекций, вызываемых N.gonorrhoeae, вакцины не существует.

Neisseria meningitidis является важным патогеном, особенно у детей и совершеннолетней молодежи. Сепсис и менингит представляют собой наиболее опасные для жизни формы инвазивного менингококкового заболевания (ИМЗ). Это заболевание из-за его высокой распространенности и смертности стало глобальной проблемой здравоохранения.

На основании антигенных различий в капсульных полисахаридах были идентифицированы тринадцать серогрупп N.meningitidis, наиболее распространенными из которых являются А, В и С, ответственные за 90% случаев заболеваний во всем мире. Серогруппа В является наиболее распространенной причиной менингококкового заболевания в Европе, США и в некоторых странах Латинской Америки.

Были разработаны вакцины на основе капсульных полисахаридов серогрупп А, С, W и Y, и было показано, что они сдерживают вспышки менингококкового заболевания (Peltola et al., 1985, Pediatrics 76; 91-96). Однако серогруппа В является слабо иммуногенной и индуцирует только временный антителогенез преимущественно IgM (иммуноглобулин М) изотипа (Ala'Aldeen D and Cartwright К 1996, J.Infect. 33; 153-157). Следовательно, в настоящее время нет достаточно эффективной вакцины против менингококков серогруппы В, которые ответственны за большую часть заболеваний в странах умеренного климата. Это представляет особую проблему в связи с тем, что распространенность заболевания серотипа В возрастает в Европе, Австралии и Америке, главным образом у детей младше 5 лет. Разработка вакцины против менингококков серогруппы В вызывает особые трудности, так как полисахаридная капсула является слабо иммуногенной благодаря своей иммунологической близости к молекуле адгезии нервных клеток человека. Соответственно стратегии получения вакцин были сосредоточены на экспонированных на поверхности структурах наружной мембраны менингококков, но затруднением являлось заметное варьирование этих антигенов среди штаммов.

Дальнейшие разработки привели к введению вакцин, изготовленных из везикул наружных мембран, которые содержат ряд белков, которые составляют нормальное содержимое бактериальной мембраны. Одной их них является VA-MENGOC-BC®, кубинская вакцина против N.meningitidis серогрупп В и С (Rodriguez et al 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440). Эта вакцина была разработана для борьбы с эпидемией инвазивного менингококкового заболевания на Кубе, которая не была элиминирована при помощи программы вакцинации с использованием капсульно-полисахаридной АС вакцины. Преобладающими серогруппами были В и С, и при помощи VA-MENGOC-BC® вакцины вспышку успешно контролировали с оцениваемой эффективностью вакцины 83% в отношении штаммов N.meningitidis серогруппы В (Sierra et al., 1990 In Neiserria, Walter Gruyter, Berlin, m. Atchman et al (eds) p.129-134, Sierra et al. 1991, NIPH Ann. 14; 195-210). Эта вакцина была эффективна в отношении конкретной эпидемии, однако вызванный иммунный ответ не предохранял бы от других штаммов N.meningitidis.

Следующие исследования эффективности, проведенные в Латинской Америке во время эпидемий, вызванных гомологичными и гетерологичными серогруппе В менингококковыми штаммами, продемонстрировали некоторую эффективность у детей старшего возраста и взрослых, но ее эффективность была значительно ниже у более младших детей, которые имеют наибольший риск инфицирования (Milagres et al., 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424). Неясно, насколько эффективной была бы вакцина в странах с многоштаммовым эндемическим заболеванием, таких как Великобритания. Исследования иммуногенности в отношении гетерологичных штаммов продемонстрировали лишь ограниченную перекрестно-реактивную сывороточную бактерицидную активность, особенно у детей (Tappero et al. 1999, JAMA 281; 1520-1527).

Вторая вакцина на основе везикул наружных мембран была разработана в Норвегии с использованием изолята серотипа В, типичного серотипа, преобладающего в Скандинавии (Fredriksen et al., 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Эту вакцину тестировали в клинических исследованиях, и было обнаружено, что она обладает защитной эффективностью 57% через 29 месяцев (Bjune et al., 1991, Lancet, 338; 1093-1096).

Однако использование везикул наружных мембран (ВНМ) в вакцинах связано с некоторыми проблемами. Например, ВНМ содержат токсичные липополисахариды, и они могут содержать иммунодоминантные антигены, которые либо являются специфичными для штамма, либо экспрессируются вариантно. Описан ряд способов, которые можно использовать, чтобы преодолеть некоторые из проблем вакцин на основе препаратов везикул наружных мембран. В WO 01/09350 описаны способы, которые направлены на решение некоторых из этих проблем, например, посредством уменьшения токсичности и модификации антигенов, присутствующих на везикулах наружных мембран.

Существуют различные проблемы, связанные с анти-менингококковыми вакцинами, имеющимися в распоряжении в настоящий момент. Вакцины из наружных мембран на основе белков обычно являются специфичными и эффективными в отношении лишь нескольких штаммов. Полисахаридные вакцины также частично оптимальны, поскольку они обычно вызывают слабые и короткие иммунные ответы, в частности в отношении серогруппы В (Lepow et al., 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96).

Инфекции, вызываемые Neisseria, представляют значительную проблему для здравоохранения, для решения которой или нет вакцины, как в случае с N.gonorrhoeae, или, как в случае с N.meningitides, имеются вакцины с ограничениями по эффективности и защитной способности в отношении гетерологичных штаммов. Очевидно, что существует необходимость разработки вакцин лучшего качества против инфекций, вызываемых Neisseria, которые улучшат эффективность имеющихся в настоящее время вакцин и сделают возможной защиту против более широкого ряда штаммов.

Описание графических материалов

Чертеж - окрашенный кумасси гель, демонстрирующий уровни экспрессии Hsf, TbpA и NspA в препаратах везикул наружных мембран, происходящих от различных штаммов N.meningitidis. Полоса 1 - маркеры молекулярной массы; полоса 2 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды регулировались негативно; полоса 3 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно; полоса 4 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а NspA регулировался позитивно; полоса 5 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а Hsf регулировался позитивно; полоса 6 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA регулировался позитивно; полоса 7 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA и Hsf регулировались позитивно; полоса 8 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA и NspA регулировались позитивно.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении раскрыта комбинация антигенов, которые при их объединении в иммуногенной композиции или вакцине могут индуцировать титры бактерицидных антител, более высокие, чем титры, индуцируемые этими антигенами при введении по отдельности. Предпочтительно комбинация антигенов вызывает синергически более высокие титры бактерицидных антител. Так как бактерицидные антитела непосредственно отражают эффективность вакцин-кандидатов, результатом комбинации Tbp и Hsf в вакцинах будут высокоэффективные вакцины. Дополнительным преимуществом изобретения является то, что комбинация двух антигенов, Tbp и Hsf, также сделает возможной защиту против широкого ряда штаммов.

Данное изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок или их антигенные фрагменты. Эти белки либо выделяют, либо предпочтительно очищают по меньшей мере до 30%, 40%, более предпочтительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%-ной чистоты, или обогащают в смеси с другими антигенами. Трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок могут быть выделены или могут происходить от одного и того же или от разных штаммов грамотрицательных бактерий.

“Выделенный” означает выделенный из обычного окружения белка руками человека. “Очищенный” означает очищенный по меньшей мере до 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%-ной чистоты до того, как этот антиген комбинируют с другими компонентами иммуногенной композиции по изобретению.

“Происходящий от” означает, что ген, кодирующий белок, происходит от конкретного бактериального штамма, или что белок очищен из конкретного бактериального штамма. Следовательно, “происходящий от” включает рекомбинантные белки, продуцируемые в отдельной системе экспрессии, если ген, кодирующий этот белок, происходит от названной бактерии.

Показано, что в комбинации Tbp и Hsf взаимодействуют успешно и предпочтительно синергически, вызывая иммунный ответ, который выше в единицах бактерицидной активности (например, при измерении посредством анализа бактерицидности сыворотки, или АБС) и предпочтительно выше, чем аддитивный ответ, вызываемый этими антигенами по отдельности, более предпочтительно по меньшей мере в 1,1, 1,2, 1,5, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в десять раз. Значительным преимуществом добавления к вакцине как Tbp, так и Hsf по сравнению с существующими вакцинами будет получение сильного бактерицидного иммунного ответа и возможность защиты против многих штаммов.

Одним воплощением данного изобретения является иммуногенная композиция, содержащая как трансферрин-связывающий белок, так и Hsf-подобный белок. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, содержащую по меньшей мере один антиген, который может вызывать иммунный ответ при введении хозяину. Tbp и Hsf-подобный белок могут происходить от любого штамма грамотрицательных бактерий, включая Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Bordetella, Neisseria (включая Neiserria meningitidis, которая может являться серогруппой А, В, С, W135 или Y, и Neisseria gonorrhoeae) или от любой из грамотрицательных бактерий, описанных выше. Данное изобретение охватывает иммуногенные композиции, в которых Tbp и Hsf-подобный белок происходят либо от одного, либо от разных штаммов грамотрицательных бактерий.

Трансферрин-связывающие белки

Трансферрин-связывающий белок (transferrin binding protein, Tbp) представляет собой белок или белковый комплекс на наружной мембране грамотрицательных бактерий, который связывает трансферрин. Некоторые белки в этом семействе образуют бета-цилиндр, заякоренный в наружной мембране. В структуре трансферрин-связывающего белка может содержаться внутриклеточный N-концевой домен с TonB боксом и "plug"-домен, множественные трансмембранные бета-цепи, связанные короткими внутриклеточными и более длинными внеклеточными петлями. Другими примерами являются липопротеины, которые взаимодействуют с образованием комплекса с интегральным мембранным белком. Примерами данного семейства белков являются TbpA и TbpB. Обозначение Tbp охватывает любой из этих белков отдельно или в комбинации, а также комплекс, образованный из TbpA и TbpB. Предпочтительно в иммуногенной композиции по изобретению присутствует по меньшей мере TbpA.

Различают два семейства TbpB, имеющих высокую молекулярную массу и низкую молекулярную массу соответственно. Высоко- и низкомолекулярные формы TbpB (WO 93/06861; ЕР 586266) объединяются с разными семействами TbpA (WO 93/06861; ЕР 586266; WO 92/03467; US 5912336), которые различаются на основании гомологии. Несмотря на одинаковую молекулярную массу, TbpA известны как высокомолекулярные и низкомолекулярные семейства из-за их объединения с высоко- или низкомолекулярной формой TbpB (Rokbi et al., FEMS Microbiol. Lett. 100; 51, 1993). Известно, что TbpA и TbpB экспрессируются в ряде бактерий, включая N.meningitidis (WO 93/06861; ЕР 586266; WO 92/03467; US 5912336), N.gonorrhoeae (WO 92/03467; US 5912336), Н.influenzae (Gray-Owen et al., Infect. Immun. 1995; 63: 1201-1210, Schryvers J.Med. Microbiol. 1989; 29: 121-130; WO 95/13370; WO 96/40929), A.pleuropneumoniae, M.cararrhalis (Mathers et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997; 19: 231; Chen et al., Vaccine 1999; 18: 109; WO 97/13785; WO 99/52947) и Р.haemolytica (Cornelissen et al., Infection and Immunity 68; 4725, 2000). TbpA и TbpB также упоминаются как Tbp1 (NMB 0461) и Tbp2 (NMB 0460) соответственно (Cornelissen et al., Infection and Immunity 65; 822, 1997).

При его использовании здесь Tbp означает трансферрин-связывающий белок из грамотрицательных бактерий, включая Moraxella catarrhalis и Haemophilus influenzae, предпочтительно Neisseria, более предпочтительно N.meningitidis или N.gonorrheoea и наиболее предпочтительно N.meningitidis серотип В. Tbp охватывает как TbpA, так и TbpB, а также высокомолекулярные и низкомолекулярные формы TbpA и TbpB. Tbp охватывает отдельные белки, описанные выше, и комплексы этих белков и любых других белков или их комплексов, способные связывать трансферрин.

Хотя Tbp может относиться как к высоко-, так и к низкомолекулярной форме TbpA или TbpB, предпочтительно чтобы в иммуногенной композиции по изобретению присутствовали как высокомолекулярная, так и низкомолекулярная форма TbpA и/или TbpB. Наиболее предпочтительно присутствует высокомолекулярный и низкомолекулярный TbpA.

Предполагается, что вместо Tbp белков или в дополнение к ним в иммуногенные композиции по изобретению могут быть включены другие белки, участвующие в усвоении железа. Белки, участвующие в усвоении железа, из Moraxella catarrhalis включают TbpA, TbpB, Ton-В-зависимый рецептор, СорВ (Sethi et al., Infect. Immun. 1997; 67: 3666-3671), HasR, OmpB1 и LbpB (Du et al., Infect. Immun. 1998; 66: 3656-3665; Mathers et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997; 19: 231-236; Chen et al., Vaccine 1999; 18: 109-118). Белки, участвующие в усвоении железа, из Haemophilus influenzae включают TbpB, HasR, TonB-зависимый рецептор, гемоглобин-связывающий белок, HhuA, HgpA, HgbA, HgbB и HgbC (Соре et al. Infect. Immun. 2000; 68: 4092-4101; Maciver et al., Infect Immun. 1996; 64: 3703-3712; Jin et al., Infect. Immun. 1996; 64:3134-3141; Morton et al., J.Gen. Microbiol. 1990; 136: 927-933; Schryvers J.Med. Microbiol. 1989; 29: 121-130). Захватывающие железо белки из Neisseria meningitidis включают Tbp1 (NMB 0461), Tbp2 (NMB 0460), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), LbpA (NMB 1540), LbpB (NMB 1541), Lipo 28, также известный как GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), Ton В-зависимые рецепторы (NMB 0964 и NMB 0293) и HmbR (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815, 2000).

Tbp белки, включаемые в иммуногенные композиции по изобретению, представляют собой белки, имеющие гомологию с TbpA и TbpB из N.meningitidis, как описано в WO 93/06861 и ЕР 586266; предпочтительно имеющие более чем 40%, 45%, 50%, 60%, 70%-ную, более предпочтительно более чем 80 или 90%-ную, наиболее предпочтительно более чем 95%, 96%, 97%, 98%, 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью TbpA и TbpB, как описано в WO 93/06861 и ЕР 586266.

Tbp содержит несколько различающихся областей. Например, в случае TbpA из штамма Н44/76 N.meningitidis, 186 аминоконцевых аминокислот образуют внутренний глобулярный домен, 22 бета-цепи охватывают мембрану, образуя бета-цилиндрическую структуру. Они связаны короткими внутриклеточными петлями и более крупными внеклеточными петлями. Внеклеточные петли 2, 3 и 5 имеют наибольшую степень изменчивости последовательности, а петля 5 является поверхностно экспонированной. Петли 5 и 4 вовлечены в лигандное связывание и предпочтительно представляют собой TbpA фрагменты для включения в иммуногенные композиции по настоящему изобретению.

Кроме методик генетического позитивного регулирования, описанных в заявке, трансферрин-связывающие белки также могут позитивно регулироваться в грамотрицательных бактериях при их росте в условиях ограничения по железу, как описано ниже. В иммуногенных композициях по изобретению, в которых трансферрин-связывающий белок позитивно регулируется в везикуле наружных мембран, позитивное регулирование предпочтительно достигается посредством культивирования штамма-хозяина в условиях ограничения по железу. Этот способ также приводит к позитивному регулированию вариабельных железо-регулируемых белков, в частности FrpB в штаммах Neisseria, и гем/гемопексин утилизирующего белка С, HgpA и HgpB в Haemophilus influenzae, которые могут стать иммунодоминантными. Следовательно, полезно негативно регулировать экспрессию (и предпочтительно делетировать кодирующие гены) таких белков, как описано ниже, чтобы гарантировать, что иммуногенная композиция по изобретению будет вызывать иммунный ответ против антигенов, присутствующих в широком разнообразии штаммов.

Hsf-подобные белки

Hsf-подобные белки являются белками-автотранспортерами, имеющими гомологию с Hsf N.meningitidis с последовательностями, описанными в WO 99/31132; предпочтительно они имеют более чем 40%, 50%, 60%, 70%-ную, более предпочтительно более чем 80%-ную, наиболее предпочтительно более чем 90%-ную, наиболее предпочтительно более чем 95%, 96%, 97%, 98%, 99%-ную идентичность с Hsf аминокислотной последовательностью, раскрытой в WO 99/31132 (предпочтительно SEQ ID NO 2, 4, 6 или 8). Hsf-подобные белки представляют собой поверхностно-экспонированные белки, и предполагается, что они функционируют как адгезины. Эти белки образуют многомерный комплекс и экспрессируются во время инфицирования и колонизации.

Hsf-подобные белки обнаружены во многих грамотрицательных бактериях, включая Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheoea, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis и Escherichia coli. Примеры Hsf-подобных белков, обнаруженных в Neisseria meningitidis, включают Hsf (также известный как NhhA - NMB 0992) (WO 99/31132), Aida-1-подобный белок (Peak et al., 2000, FEMS Imm. Med. Vicrobiol. 28; 329), IgA протеазу, Ssh-2, Нар (WO 99/55873), NadA (J.Exp. Med. 2002 195; 1445), UspA2 и Tsh. Примеры Hsf-подобных белков в Moraxella catarrhalis включают Hsf, UspA1 (WO 93/03761), UspA2 (WO 93/03761), эстеразу наружных мембран и YtfN. Примеры Hsf-подобных белков в Haemophilus influenzae включают Hia/Hsf (St Geme et al., J.Bacteriol. 2000 182: 6005-6013), Нар, IgA1 протеазу, HMW1, HMW2 (Barenkamp et al., Infect. Immun. 1992 60; 1302-1313), YadA, YadAc и YtfN (Hendrixson et al., Mol. Cell 1998; 2: 941-850; St Geme et al., Mol. Micribiol. 1994; 14:217-233; Grass and St. Geme Infect. Immunol. 201; 69; 307-314; St. Geme and Gutter J.Bacteriology 2000; 182; 6005-6013). Примеры Hsf-подобных белков в Escherichia coli включают Hsf, Hia и Нар.

Hsf имеет структуру, общую для белков-автотранспортеров. Например, Hsf из штамма Н44/76 N.meningitidis состоит из головной области по аминному концу белка (аминокислоты 52-479), которая экспонируется на поверхности и содержит вариабельные области (аминокислоты 52-106, 121-124, 191-210 и 230-234), шейной области (аминокислоты 480-509), области гидрофобной альфа-спирали (аминокислоты 518-529) и якорного домена, в котором четыре трансмембранные цепи охватывают наружную мембрану (аминокислоты 539-591).

Hsf может относиться к полноразмерным полипептидам, включая сигнальную последовательность, которая состоит из аминокислот 1-51. Данное изобретение также включает Hsf с удаленной сигнальной последовательностью, так что полипептид состоит из зрелой формы Hsf. Другие предпочтительные формы Hsf могут быть усечены так, чтобы исключить вариабельные области белка, раскрытые в WO 01/55182.

Предпочтительные варианты включают удаление одной, двух, трех, четырех или пяти вариабельных областей, как определено в WO 01/55182. В предпочтительных вариантах удалены остатки из области аминокислотной последовательности от 52 по 237, или удалены аминокислоты от 54 до 237, более предпочтительно удалены остатки между аминокислотами от 52 по 133 или аминокислоты от 55 до 133. Очевидно, что в усеченные варианты может быть включена или из них исключена сигнальная последовательность из Hsf от аминокислоты 1 до 51. Указанная выше последовательность и те, что описаны ниже, могут быть усечены или удлинены на 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 или 15 аминокислот на любом из N- и С-концов или на обоих из них.

Когда Hsf используют как субъединичную вакцину, предпочтительно использовать часть растворимого домена-"пассажира"; например полный домен из аминокислот 52-479, наиболее предпочтительно консервативную его часть, например аминокислоты 134-479.

Хотя предпочтительно использовать полноразмерные Tbp и/или Hsf-подобные белки (в частности TbpA и Hsf) или их встречающиеся в природе варианты, или такие полноразмерные последовательности, в которых отсутствует не более чем 60 аминокислот из N- и/или С-конца, антигенные фрагменты Tbp и/или Hsf-подобных белков также включены в иммуногенную композицию по изобретению. Это фрагменты, содержащие по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 20 аминокислот, более предпочтительно 30 аминокислот, более предпочтительно 40 аминокислот или наиболее предпочтительно 50 аминокислот, взятых непосредственно друг за другом из аминокислотной последовательности Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и Hsf. Кроме того, антигенные фрагменты означают фрагменты, которые иммунологически реактивны с антителами, генерируемыми против N.meningitidis Tbp или Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA или Hsf, или с антителами, генерируемыми при инфицировании хозяина-млекопитающего N.meningitidis. Антигенные фрагменты также включают фрагменты, которые вызывают иммунный ответ, специфичный против Tbp или Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA или Hsf из грамотрицательных бактерий, от которых они происходят. Предпочтительно он защищает от инфицирования бактерией, от которой он происходит, предпочтительно от инфицирования Neisseria, более предпочтительно он защищает от инфицирования N.meningitidis, наиболее предпочтительно он защищает от инфицирования N.meningitidis серогруппы В.

Предпочтительные фрагменты TbpA включают внеклеточные петли TbpA. При использовании последовательности TbpA из штамма Н44/76 N.meningitidis эти петли соответствуют аминокислотам 200-202 для петли 1, аминокислотам 226-303 для петли 2, аминокислотам 348-395 для петли 3, аминокислотам 438-471 для петли 4, аминокислотам 512-576 для петли 5, аминокислотам 609-625 для петли 6, аминокислотам 661-671 для петли 7, аминокислотам 707-723 для петли 8, аминокислотам 769-790 для петли 9, аминокислотам 814-844 для петли 10 и аминокислотам 872-903 для петли 11. Соответствующие последовательности, после выравнивания последовательностей, в других Tbp белках также составляли предпочтительные фрагменты. Наиболее предпочтительные фрагменты включают аминокислотные последовательности, содержащие петлю 2, петлю 3, петлю 4 или петлю 5 Tbp.

Хотя предпочтительные фрагменты Tbp или TbpA белков, описанных выше, относятся к N.meningitidis, специалист в данной области на основании гомологии последовательностей легко сможет найти в Tbp или TbpA белках из всех указанных выше грамотрицательных штаммов эквивалентные пептиды, которые также являются фрагментами по изобретению.

Предпочтительные фрагменты Hsf включают целую головную область Hsf, предпочтительно содержащую аминокислоты 52-473 Hsf. Дополнительные предпочтительные фрагменты Hsf включают экспонированные на поверхности головные области, включая аминокислоты 52-62, 76-93, 116-134, 147-157, 157-175, 199-211, 230-252, 252-270, 284-306, 328-338, 362-391, 408-418, 430-440 и 469-479. Наиболее предпочтительными фрагментами являются 134-591 для использования в ВНМ препарате по изобретению, и 134-479 для использования в субъединичной композиции по изобретению.

Хотя предпочтительные фрагменты Hsf-подобных или Hsf белков, описанных выше, относятся к N.meningitidis, специалист в данной области на основании гомологии последовательностей легко может найти в Hsf-подобных или Hsf белках из всех указанных выше грамотрицательных штаммов эквивалентные пептиды, которые тоже являются фрагментами по изобретению.

Также в изобретение включены слитые белки из Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и Hsf. Они могут объединять Tbp и Hsf-подобный белок, предпочтительно TbpA и Hsf, или их фрагменты, объединенные в одном и том же полипептиде. Альтернативно изобретение также включает отдельные слитые белки из Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и/или Hsf, или их фрагменты, при условии, что как Tbp, так и Hsf-подобный белок, предпочтительно TbpA и Hsf, или их фрагменты присутствуют в композиции по изобретению. TbpA или Hsf могут, например, образовать слитый белок с β-галактозидазой, глутатион-S-трансферазой, зелеными флуоресцентными белками (green fluorescent proteins, GFP), tags эпитопов, такими как FLAG, myc tag, полигистидин, или поверхностными белками вирусов/бактерий, такими как гемагглютинин вируса гриппа, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин или CRM197.

Выделенные трансферрин-связывающие белки, которые можно вводить в иммуногенные композиции, хорошо известны в данной области техники (WO 0025811). Их можно экспрессировать в бактерии-хозяине, экстрагировать с использованием детергента (например 2% Elugent) и очищать аффинной хроматографией или используя стандартную процедуру колоночной хроматографии, хорошо известную в данной области техники (Oakhill et al., Biochem J. 2002 364; 613-6). Аналогично, Hsf можно выделить, используя методики, хорошо известные в данной области техники. Рекомбинантный Hsf можно экспрессировать в Е.coli или в других бактериальных штаммах. Белок можно очищать, используя аффинную хроматографию. Это может быть стандартной процедурой, если tag введена в Hsf-последовательность.

Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании, как подразумевают авторы изобретения, могут быть заменены терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" соответственно в каждом случае.

Вакцинные комбинации

Данное изобретение относится к комбинациям антигенов, включающим Tbp и Hsf-подобный белок, которые эффективно обеспечивают высокую бактерицидную активность против грамотрицательных бактерий. Антигенные композиции по изобретению могут содержать антигены в дополнение к Tbp и Hsf. Они могут содержать другие белковые антигены из грамотрицательных бактерий, предпочтительно Neisseria и более предпочтительно из N.meningitidis.

N.meningitidis

Для N.meningitidis иммуногенные композиции по изобретению предпочтительно содержат Hsf и TbpA. При получении ВНМ предпочтительно, чтобы Hsf и TbpA позитивно регулировались в штамме N.meningitidis, от которого произошла ВНМ. TbpA может присутствовать как в высоко-, так и в низкомолекулярной форме, и предпочтительно присутствуют обе формы - высокомолекулярная и низкомолекулярная. Hsf предпочтительно присутствует в ВНМ в интегрированной в мембрану усеченной форме, предпочтительно из аминокислот 134-591. Hsf также может присутствовать в виде субъединичной вакцины, предпочтительно в виде домена-"пассажира" (аминокислоты 52-479), наиболее предпочтительно в виде усеченного домена-"пассажира" из аминокислот 134-479.

К указанным выше композициям могут быть добавлены дополнительные антигены (или позитивно регулироваться, если присутствуют в ВНМ), например NspA (WO 96/29412), Нар (РСТ/ЕР 99/02766), PorA, PorB, OMP85 (также известный как D15) (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (РСТ/ЕР 99/06718), FrpB (в WO 96/31618 смотри SEQ ID NO:38), FrpA (NMB 0585) или FrpC или консервативный участок, общий для обоих, из по меньшей мере 30, 50, 100, 150, 500, 750 аминокислот (WO 92/01460), LbpA и/или LbpB (PCT/EP 98/05117; Schryvers et al., Med. Microbiol. 1999, 32: 1117), FhaB (WO 98/02547, SEQ ID NO:38 [нуклеотиды 3083-9025]), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), MltA (WO 99/57280) (NMB0033) и ctrA (PCT/EP 00/00135).

Предпочтительные комбинации антигенов в иммуногенной композиции по изобретению включают комбинации, содержащие Tbp и Hsf-подобный белок и FhaB; Tbp и Hsf-подобный белок и PilQ; Tbp и Hsf-подобный белок и NspA; Tbp и Hsf-подобный белок и FrpC; более предпочтительно содержащие Tbp и Hsf-подобный белок и Нар; Tbp и Hsf-подобный белок и FrpA/C; Tbp и Hsf-подобный белок и LbpB; Tbp и Hsf-подобный белок и D15. Наиболее предпочтительно D15 будет включен как часть препарата везикул наружных мембран.

Антигены Moraxella catarrhalis

Один или более из следующих белков Moraxella catarrhalis являются предпочтительными для включения в иммуногенную композицию по изобретению (предпочтительно, когда TbpA и Hsf-подобный белки происходят от Moraxella catarrhalis): OMP106 (WO 97/41731 и WO 96/34960), HasR (РСТ/ЕР 99/03824), PilQ (PCT/EP 99/03823), OMP85 (РСТ/ЕР 00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), Р6 (РСТ/ЕР 99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (PCT/EP 99/03822), OmplA1 (PCT/EP 99/06781), Hly3 (PCT/EP 99/03257), LbpA и LbpB (WO 98/55606), TbpA и TbpB (WO 97/13785 и WO 97/32980), OmpE, UspA1 и UspA2 (WO 93/03761) и Omp21.

Антигены Haemophilus influenzae

Один или более из следующих белков Haemophilus influenzae предпочтительны для включения в иммуногенную композицию по изобретению (предпочтительно, когда TbpA и Hsf-подобные белки происходят от Haemophilus influenzae): D15 (WO 94/12641), Р6 (ЕР 281673), TbpA, TbpB, Р2, Р5 (WO 94/26304), ОМР26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Нар, Hin47 и Hif.

Еще одним аспектом изобретения являются вакцинные комбинации, содержащие антигенную композицию по изобретению совместно с другими антигенами, которые успешно применяются против некоторых болезненных состояний, включая состояния, ассоциированные с вирусами или грамположительными бактериями.

В одной предпочтительной комбинации антигенные композиции по изобретению, содержащие Tbp и Hsf-подобный белок, готовят в виде препарата с 1, 2, 3 или предпочтительно всеми 4-мя из следующих менингококковых капсульных полисахаридов или олигосахаридов, которые могут быть чистыми или конъюгированными с белковым носителем: А, С, Y или W-135. Такую вакцину, содержащую TbpA и Hsf из N.Meningitidis, можно успешно применять в качестве глобальной менингококковой вакцины. Предпочтительно включены конъюгированный менингококковый капсульный полисахарид С, С и Y или А и С.

В еще одном предпочтительном воплощении антигенные композиции по изобретению, содержащие TbpA и Hsf, предпочтительно изготовленные в виде препарата с 1, 2, 3 или всеми 4-мя чистыми или конъюгированными менингококковыми капсульными полисахаридами (или олигосахаридами) А, С, Y или W-135, как описано выше, готовят в виде препарата с конъгированным Н.influenzae b капсульным полисахаридом или олигосахаридом, и/или с одним или более чистым или конъюгированным пневмококковым капсульным полисахаридом или олигосахаридом. Возможно вакцина также может содержать один или более белковый антиген, который может защищать хозяина от инфицирования Streptococcus pneumoniae. Такую вакцину можно успешно использовать в качестве вакцины против менингита/стрептококковой пневмонии.

В еще одном предпочтительном воплощении иммуногенную композицию по изобретению, содержащую Tbp и Hsf-подобный белок, готовят в виде препарата с капсульными полисахаридами, происходящими от одного или более из числа следующих микроорганизмов: Neisseria meningitidis, Haemophilus influezae b, Streptococcus pheumonia, стрептококки группы А, стрептококки группы В, Staphylococcus aureus или Staphylococcus epidermidis. В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды, полученные от одной или более серогрупп А, С, W-135 и Y Neisseria meningitidis. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды, полученные из Streptococcus pneumoniae. Пневмококковые капсульные полисахаридные антигены предпочтительно выбирают из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (наиболее предпочтительно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F). Еще одно предпочтительное воплощение включает ПРФ (полирибозил-рибитол-фосфат) капсульные полисахариды Haemophilus influenzae. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа 5, типа 8 или 336 Staphylococcus aureus. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа I, типа II или типа III из Staphylococcus epidermidis. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа Ia, типа Ic, типа II или типа III стрептококков группы В. В еще одно предпочтительное воплощение входят капсульные полисахариды стрептококков группы А, предпочтительно дополнительно содержащие по меньшей мере один белок М и более предпочтительно - различные типы белка М.

Предпочтительными пневмококковыми белковыми антигенами являются такие пневмококковые белки, которые экспонируются на наружной поверхности пневмококков (которые могут быть распознаны иммунной системой хозяина во время по меньшей мере части жизненного цикла пневмококка), или белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Наиболее предпочтительно этот белок представляет собой токсин, адгезин, 2-компонентный сигнальный трансдуктор или липопротеин из Streptococcus pneumoniae или их фрагменты. Особенно предпочтительные белки включают, но не ограничены ими: пневмолизин (предпочтительно детоксифицированный посредством химической обработки или мутации) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pheumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 и 2", Mitchell et al. Biochim. Biophys. Acta 1989, Jan 23; 1007 (1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties", WO 96/05859 (A.Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA и их варианты с трансмембранной делецией (US 5804193 - Briles et al.); PspC и их варианты с трансмембранной делецией (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA и их варианты с трансмембранной делецией (Berry & Paton, Infect. Immun. 1996 Dec; 64 (12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesion essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); пневмококковые холин-связывающие белки и их варианты с трансмембранной делецией; CbpA и их варианты с трансмембранной делецией (WO 97/41151; WO 99/51266); глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (Infect. Immun. 1996, 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164:207-14); М-подобный белок (ЕР 0837130) и адгезин 18627 (ЕР 0834568). Дополнительными предпочтительными пневмококковыми белковыми антигенами являются описанные в WO 98/18931, в частности выбранные в WO 98/18930 и PCT/US 99/30390.

Также вакцина возможно может содержать антигены, обеспечивающие защиту против одной или более дифтерийной, столбнячной и Bordella pertussis инфекций. Коклюшный компонент может представлять собой убитую цельно клеточную В.pertussis (Pw) или бесклеточный коклюшный компонент (Ра), который содержит по меньшей мере один антиген (а предпочтительно все три) из числа следующих: РТ, FHA и 69 кДа пертактин. Обычно антигены, обеспечивающие защиту против дифтерии и столбняка, представляют собой дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин. Анатоксинами могут являться химически инактивированные токсины или токсины, инактивированные путем введения точечных мутаций.

Вакцина также возможно может содержать один или более антиген, который может защищать хозяина против нетипируемых Haemophilus influenzae, RSV, и/или один или более антиген, который может защищать хозяина против вируса гриппа. Такую вакцину можно успешно использовать в качестве глобальной вакцины против среднего отита.

Предпочтительные белковые антигены нетипируемой Н.influenzae включают белок Fimbrin (US 5766608) и продукты слияния, содержащие его пептиды (например, LB1 продукт слияния) (US 584364 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, белок D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Нар и D15.

Предпочтительные антигены вируса гриппа включают целый, живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или MDCK-клетках, или Vero клетках, или целые flu виросомы (как описано R.Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как НА, NP, NA или М белки, или их комбинации.

Предпочтительные RSV (респираторно-синцитиальный вирус) антигены включают гликопротеин F, гликопротеин G, белок HN, белок М или их производные.

Очевидно, что антигенные композиции по изобретению могут содержать один или более капсульный полисахарид из одного вида бактерий.

Антигенные композиции могут также содержать капсульные полисахариды, происходящие от одного или более видов бактерий.

Такие капсульные полисахариды могут быть неконъюгированными или могут быть сконъюгированы с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин, фрагмент С столбнячного анатоксина, дифтерийный анатоксин, CRM197, пневмолизин, белок D (US6342224), TbpA или Hsf. Одно воплощение данного