Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов

Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к иммортализованным линиям клеток птиц, подходящим для получения биологических препаратов или вирусов для вакцинации. В частности, линии клеток получают из первичных клеток, которые трансформируют, по меньшей мере, двумя вирусными или клеточными генами, один из которых вызывает прогрессию клеточного цикла, тогда как другой препятствует врожденным защитным механизмам клетки, индуцированным дисрегуляцией репликации. Кроме того, изобретение относится к получению указанных иммортализованных линий клеток и их применению для получения биологических препаратов или вирусов для вакцинации.

Уровень техники

Яйца кур с эмбрионом по-прежнему представляют собой один из главных субстратов для получения вакцин для человека. Они способны поддерживать репликацию широкого спектра вирусов человека и животных. Этот спектр включает ослабленные вирусы, то есть дефектные вирусы, у которых ослаблена способность к репликации в клетках человека или млекопитающих и, таким образом, их можно использовать в качестве вакцин. Ослабление можно получать или поддерживать путем непрерывного пассирования в яйца с эмбрионом. Отсутствие определенного набора вирусного и бактериального заражения в яйцах кур, используемых для получения человеческой вакцины должно быть заверено сертификатом (без специфичного патогена или SPF). Яйца SPF поставляются промышленно. Широкая применимость и длительный международный опыт работы поддерживали эту стратегию, несмотря на очевидные недостатки.

SPF группы кур и яиц с эмбрионом являются дорогостоящими, и их стоимость может составлять до 40% стоимости вакцин. Кроме того, трудно непрерывно поддерживать группы SPF, полностью свободные от патогенов, для которых наблюдаются периодические вспышки заболевания в группах SPF. Партия вакцины не может быть выпущена до тех пор, пока поставщик SPF не удостоверится в том, что родительские куры для яиц с эмбрионом, используемые для производства партии вакцины, были полностью свободны от любого заболевания. Эта неопределенность значительно увеличивает стоимость получения данных вакцин. В ситуациях пандемии с внезапной потребностью в специфической вакцине (например, грипп) поставка яиц SPF может быть строго ограничена. Кроме того, крупномасштабные процессы для инфицирования яиц и поддержания роста вируса являются длительными и иногда неустойчивыми в различных сериях вакцин.

С развитием методик клеточной культуры производители вакцины заменили яйца с эмбрионом изолированными зародышевыми фибробластами курицы. В то время как применение первичных клеточных культур улучшает профиль безопасности, эффективность и надежность производственного процесса, оно также дополнительно увеличивает затраты: фибробласты кур получают из яиц SPF путем измельчения эмбрионов, для создания и амплификации жизнеспособных клеток. Как характерно для первичных клеток животных, фибробласты претерпевают старение: время удвоения при пассировании увеличивается и, в конечном счете, все клетки умирают. Этот процесс наблюдается приблизительно после 20 пассажей, намного раньше, чем в клеточных субстратах грызунов или в некоторых клеточных субстратах человека, используемых в настоящее время в производстве вакцин (таких как MRC-5 или WI-38). Культуры фибробластов необходимо поддерживать в присутствии 5-10% фетальной телячьей сыворотки, что привносит в производственный процесс дополнительные факторы риска. Они также требуют твердой поверхности для роста и не растут в суспензии, предпочтительном состоянии для применения в биореакторе. Даже с применением многослойных клеточных фабрик это значительно ограничивает процедуры в увеличенном масштабе. Вследствие ограниченного времени жизни для каждой партии фибробластов кур необходимо проводить полный набор тестов на безопасность.

Фибробласты представляют собой единственный тип клеток из широкого разнообразия различных тканей эмбриона курицы, которые хорошо размножаются. Преобладание фибробластов по сравнению с другими типами клеток в некоторых случаях уменьшало теоретический выход вируса, поскольку в яйцах главной областью для амплификации вируса обычно является хориоаллантоисная мембрана, слой эпителиальных клеток.

Рассмотренные проблемы внесли свой вклад в серьезный дефицит вакцины гриппа в последние два года (2003 и 2004). Для преодоления этих ограничений была бы высоко востребована постоянная линия клеток, растущая в искусственной среде определенного состава, предпочтительно в суспензии или, по меньшей мере, на носителях.

Некоторые из вирусов, обычно растущие в фибробластах кур, были адаптированы к определенным линиям клеток. Клетки BHK-21 (почки эмбриона хомяка) поддерживают рост различных штаммов вакцинии, гриппа и аутовакцины (Drexler I. et al., J. Gen. Virol. 79(Pt2):347-52 (1998); Gumusderelioglu M. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 33:167-72 (2001); Merten O.W. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 397:141-51 (1996)) и беспрепятственно растут в больших ферментерах на носителях в бессывороточных условиях (Pay T.W. et al., Dev. Biol. Stand 60:171-4 (1985); Gallegos Gallegos R. M. et al., Arch. Med. Res. 26:59-63 (1995)). Для вакцинии это относится даже к сильно ослабленному штамму Анкара (MVA), который был получен в клетках кур. Линия клеток BHK-21 принята для получения определенных вакцин для домашнего скота (Lubiniecki A.S., Bioprocess Technol. 10:495-513 (1990)). Однако линия BHK-21 не удовлетворяет требованиям безопасности для живых вакцин для человека. Клетки BHK формировались спонтанно, они являются чрезвычайно онкогенными и об их истории сообщалось недостаточно.

Согласно обсуждению FDA, CBER от 12 мая 2000 клеточных субстратов, разработка "минимально очищенных живых ослабленных вирусных вакцин и вакцин на вирусных векторах" в опухолевых клетках, полученных из естественно встречающихся опухолей от людей и других млекопитающих, или из человеческих клеток и клеток млекопитающих, трансформированных за счет неизвестных механизмов, неприемлемо.

В качестве исключения из правила линия клеток VERO (происходящая от африканской зеленой обезьяны) приемлема в качестве клеточного субстрата для производства вакцины, что основано на доказанном профиле безопасности и на отсутствии трансформированного фенотипа при определенном количестве пассажей. Данную линию клеток широко использовали для производства вакцин против полиомиелита и оспы для клинического применения. Однако для клеток VERO необходимо прикрепление и они пригодны только для процессов, основанных на носителе.

Кроме того, в производстве вируса гриппа применялись клетки MDCK (спонтанная линия клеток из эпителия почки собаки) с описанной историей (Tree J. A. et al., Vaccine 19:3444-50 (2001)).

Позднее, как следствие разработки вакцины, основанной на векторе, и подходов генной терапии, интенсивно обсуждались новые, так называемые сконструированные линии клеток, полученные от человека, и они были включены в спектр потенциальных клеточных субстратов для получения вакцины (Vaccines and Related Biological Products advisory committee (совещательный комитет по вакцинам и связанным с ними биологическим продуктам), сессия от 16 мая, 2001). Были созданы новые постоянные линии клеток для обеспечения комплементарных генов для рекомбинантных вирусов с недостаточной репликацией вне системы продуцирования. Однако устойчивое введение комплементарных генов требует увеличения времени культивирования, которое либо превышает естественный предел количества пассажей, доступных для первичных клеток, либо возникает допустимый предел количества пассажей для клеток VERO до полной трансформации.

Сконструированные линии клеток производят in vitro с подробным документированием с применением охарактеризованных генов для трансформации. Например, комплементарные гены из области E1 аденовирусов непосредственно демонстрируют трансформирующие свойства и позволяли получать линии клеток человека, например, PER.C6 (Fallaux F.J. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998)). Приложение этих линий клеток не ограничено вирусным вектором, для которого они разработаны, но может быть распространено на другие вирусы. Например, в PER.C6 можно размножать вирус гриппа (Pau M.G. et al., Vaccine 19:2716-21 (2001)). Однако этот вывод не относится ко всем вирусам, имеющим отношение к разработке вакцины, в частности к вирусам птиц, таким как вирусы заболевания Марека, инфекционного бурсита, болезни Ньюкастла, герпеса индеек или анемии кур. Несмотря на то что некоторые из этих вирусов хорошо реплицируются в линиях клеток млекопитающих, рост вируса часто является недостаточным. Для других вирусов репликация является недостаточной и ограничена отдельными, особенно адаптированными штаммами.

Кроме того, при адаптации к клеточному субстрату, полученному от примата, вероятно, сайты связывания рецептора на вирусе изменятся, что приведет к модифицированному антигенному рисунку и, таким образом, общему действию на иммуногенность. Данная генетическая адаптация может обратить ослабление для штаммов, которые выращивали путем пассирования в клетках птиц, таких как MVA, или адаптированный к курам вирус кори (Escoffier C., Gerlier D., J. Virol. 73:5220-4 (1999)), или создать новые штаммы, более эффективно реплицирующиеся в клетках человека по сравнению с изолятами дикого типа. Такие вирусы могут также достичь более высокого патогенного потенциала.

По указанным выше причинам производители вакцины отказываются переходить на линии клеток млекопитающих, и развилась потребность в бессмертных линиях клеток птиц.

Исследование индукции опухолей у птиц с помощью птичьих альфаретровирусов обеспечило первые данные на молекулярном уровне о трансформации клетки в целом. Ретровирусные онкогены получают из клеточных генов со значительной частью мутированных или делетированных регуляторных доменов. Некоторые из факторов, которые идентифицировали в ходе этих исследований, такие как v-myc или v-ras, непосредственно поражают компоненты путей как ретинобластомы (RB), так и p53. Другие белки, такие как v-src или v-erbB, представляют собой конститутивно активируемые (следовательно, дисрегулируемые) трансдукторы сигнала, которые имитируют проникающие внеклеточные митогены. Связанная с данными факторами проблема заключается в том, что их мишенью является только один из нескольких путей, необходимых для эффективной трансформации. Присутствие v-src или v-myc предрасполагает клетку к трансформации и требует дополнительных спонтанных и непредсказуемых изменений в клетке для полного превращения. Следовательно, трудно оценить риск для пациента, представляемый клетками, трансформированными одним из ретровирусных онкогенов.

В других случаях отдельный сильный опухолевый антиген (например, v-jun) может непосредственно вызвать формирование опухоли (Hartl M. et al., Curr. Cancer Drug Targets 3 :41-55 (2003)). Множество птичьих вирусных онкогенов сохраняют онкогенный потенциал в клетках млекопитающих.

Линии клеток, созданные этими вирусами, не подходят для производства вакцин. Ретровирус, несущий онкоген, можно активировать и перенести вместе с вакциной. Даже опухолевый антиген, не заключенный в вирусные LTRs, может представлять большой риск, если он может трансформировать клетки млекопитающих без помощи комплементарных антигенов. Данный риск обычно оценивают путем рассмотрения трансформирующего потенциала, количества вакцинируемых и количества клеточной нуклеиновой кислоты, перенесенной с вакцинным вирусом. Данное количество ограничено эффективностью процесса очистки и в настоящее время не может составлять менее чем 10 пг/доза. Данный критерий является особенно жестким для получения вакцины, где здоровую популяцию часто инокулируют в очень молодом возрасте.

Те же аргументы относятся к трансформации ДНК-вирусов, таких как папилломавирусы и полиомавирусы. Эти вирусы содержат агрессивные онкогены: большой T-антиген SV40 представляет собой многофункциональный белок, который воздействует как на контролирование контрольного пункта в G1 клеточного цикла, так и на активность p53. Поэтому большой T-антиген легко иммортализует и трансформирует множество тканей млекопитающих, полученных от грызуна и человека. С добавлением малого T-антигена (дополнительно усиливающего действие большого T-антигена и дополнительно модулирующего путь AKT3) было возможно иммортализовать клетки птиц (часть заявки на патент США 2001-0016348). Однако даже со сложными современными способами очистки большой T-антиген SV40 считают слишком агрессивным для применения в линиях клетки, полученных для применения в медицине человека. В отличие от приведенных выше, гены, предложенные в этом изобретении, нарушают контрольный пункт клеточного цикла и инактивацию p53 посредством раздельных факторов: необходимый одновременный перенос двух различных факторов для трансформации резко уменьшает любой теоретический риск для вакцинируемого.

Заявка на патент США 2001-0016348 описывает применение антиапоптотического пути, никак не связанного с настоящим изобретением. Он не обеспечивает второй ген, противостоящий внутреннему сигналу апоптоза, в виду принудительной прогрессии клеточного цикла, вызванной первым геном. Апоптоз также можно индуцировать различными внешними стимулами, например нехваткой факторов роста или откреплением от подложки. Передача данного типа проапоптотического сигнала может быть ингибирована генами семейства bcl-2, главными объектами заявки на патент США 2001-0016348.

Ввиду того, что 90% карцином шейки матки несут последовательности папилломавируса, полагают, что аденовирусы C-типа (которые включают типы 2 и 5) не индуцируют опухоли in vivo, и аденовирусные последовательности не были обнаружены в ткани опухоли человека.

Альтернативно была сделана попытка выведения линий клеток путем непрерывного пассирования фибробластов эмбрионов кур. Ввиду того, что клетки грызунов, как представляется, довольно легко претерпевают спонтанную иммортализацию (Curatolo et al., In Vitro 20:597-601 (1984)), клетки птиц и примата с этой точки зрения очень устойчивы (Harvey, et al., Genes and Development 5:2375-2385 (1991); Pereira-Smith, J. Cell Physiol. 144:546-9 (1990); Smith et al., Science 273:63-67 (1996)). Соматические клетки птиц или приматов испытывают недостаток в теломеразе, и старение вызвано укорачиванием концевых участков хромосом (теломеров). Тем не менее, линия фибробластов кур UMNSAH-DF1 была выведена с применением данного подхода (патенты США 5 672 485 и 6 207 415). Иммортализация с применением данного подхода вызвана спонтанными мутациями множества онкогенов или генов-супрессоров опухоли. Это редкое явление, вероятность повторения которого мала, особенно в клетках ткани другого происхождения. Что наиболее важно, такой подход противоречит подходу «Определенного Риска», который является общим правилом для живых вакцин человека и представляет подробную информацию о генах иммортализации для оценивания риска переноса онкогена. Кроме того, согласно FDA (Обсуждение CBER от 12 мая, 2000, клеточных субстратов), применение опухолевых клеток, полученных из естественно встречающихся опухолей или клеток, которые были трансформированы за счет неизвестных механизмов, не приемлемо для разработки минимально очищенных живых ослабленных вирусных вакцин и вакцин на вирусных векторах.

Спонтанно развившаяся линия фибробластов кур UMNSAH-DF1 демонстрирует изменения в активности E2F и p53 (Kim et al., Oncogene 20: 2671-82 (2001)). Это не является неожиданностью, поскольку увеличенная активность клеточного цикла требует активного E2F и поскольку из исследований клеток млекопитающих известно, что высокая активность E2F индуцирует апоптоз в присутствии активного p53. Исследование характеризует бессмертную стадию, не проясняя причинные явления: возможно, иммортализацию вызвали мутации в большом количестве генов.

Процесс спонтанной трансформации может быть усилен при помощи химических мутагенов (патент США 5 989 805). Отдельные линии клеток, полученные с применением этого подхода, преодолевали старение, но остались похожими на фибробласты и не являются онкогенными. Несмотря на то что это представляет важную особенность с точки зрения безопасности, эти клетки имеют малое значение для методик крупномасштабной ферментации. Кроме того, этот подход, основанный на случайном событии, также противоречит руководящим принципам «Определенного Риска».

Для биологического производства также были предложены линии клеток птиц, происходящие из естественно встречающихся опухолей, таких как фибросаркома перепела (WO 97/08307). Кроме того, руководящие принципы «Определенного Риска» для применения в получении вакцины для человека нарушаются способом, основанным на случайных событиях.

Подходы, предпринятые в исследованиях, описанных выше, отчетливо контрастируют с активным введением специфичных групп генов иммортализации в соответствии с настоящим изобретением, которое определяет причинные факторы иммортализации и позволяет оценивать риск, обеспечивает высокую гибкость в отношении выбора различных тканей и позволяет регулировать определенные характеристики получающейся линии клеток.

Несмотря на то что с яйцами и фибробластами кур работают давно, с ними также связан очень характерный фактор риска, которому только недавно стали уделять большее внимание: клетки кур высвобождают, по меньшей мере, два типа ретровирусных частиц, эндогенный ретровирус птицы (EAV) и эндогенный вирус лейкоза птицы (ALV-E). Проблема сходна с присутствием эндогенных ретровирусных частиц в клетках мыши, которые используются для производства рекомбинантных белков (таких как NS0). Однако в отличие от клеток мыши клетки кур продемонстрировали наличие обратной транскриптазы. Благодаря более эффективным методикам обнаружения, активность RT была также обнаружена в произведенных клетками кур вакцинах против кори, свинки и желтой лихорадки (Hussain A.I. et al., J. Virol. 77:1105-11 (2003); Shahabuddin M. et al., J. Clin. Microbiol. 39 :675-84 (2001)). Вопрос о том, приводит ли наличие активности обратной транскриптазы к передаваемым ретровирусам, остается спорным: более подробный анализ показал, что CEF (от белого леггорна) содержит пять локусов с интегрированными EAVs, два из которых могут экспрессировать инфекционный ALV-E, тогда как остальные три - дефектны (Johnson J.A., Heneine W., J. Virol. 75:3605-12 (2001)). Tsang S.X. и др., J. Virol. 73: 5843-51 (1999) также обнаружили активность RT и высвобождение вирусных частиц, но не наблюдали передачи после тщательного поиска последовательностей EAV в мононуклеарных клетках крови детей, получавших вакцину против свинки. В соответствии с Weekly Epidemiological Record, WHO (73) 28 (1998), независимые лаборатории исследовали инфекционность частиц для различных клеток человека и других млекопитающих путем обширного совместного культивирования и не могли обнаружить передачу активности RT или продуктивной инфекции. Эти сведения поддерживают эпидемиологические исследования, которые не выявили связи между применением произведенных клетками кур вакцин и частотой возникновения рака, в том числе и в детском возрасте.

Кроме того, в указанном Weekly Epidemiological Record, WHO подчеркивает значение клеток-хозяев кур для поддержания ослабления определенных штаммов вакцин. Альтернативные процессы получения в настоящее время не доступны, и данное отсутствие альтернатив является важной причиной для принятия известного и непрерывного источника вирусного загрязнителя.

Однако эпидемиологические исследования привносят популяции и не касаются случайных событий или детальных исследований. Эпидемиологические исследования не могут опровергнуть теоретические риски, например: допущенная эндогенная активность RT может маскировать активность RT от недопустимой экзогенной инфекции, и эндогенные вирусы могут быть мобилизованы и активированы, если в клетки введены конструкции оболочки (Ronfort C. et al., Virology 207:271-5 (1995)).

Однако было показано, что клетки уток и гусей не содержат последовательности, родственной EAV и ALV, а у японского перепела отсутствует обратная транскриптаза (Smith L.M. et al., J. Gen. Virol. 80(ptl):261-8 (1999); Brudno L.A. et al., Vopr. Virusol. 97-100 (1980)).

Аденовирусы (AdV) представляют собой хорошо охарактеризованные, голые (без оболочки) повсеместные вирусы. Для наиболее распространенных серотипов Ad2 и Ad5 доминирование среди населения приближается к 90%. Некомпетентные по репликации версии этих вирусов используют в качестве генной терапии и вакцинных векторов в исследованиях с пациентами-людьми. Гены из области E1 Аденовируса 5 человека использовали для трансформации некоторых специфических клеток человека in vitro (линии клеток 293 и PER.C6; Fallaux F.J. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998); Graham F.L. et al., J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)). Общий процесс неэффективен по сравнению с более сильными многофункциональными онкогенами, такими как большой T-антиген SV40. На основании наблюдения, что 293 демонстрирует специфичные маркеры нейронов и PER.C6 имеют нейроэктодермальное происхождение, было выдвинуто предположение, что транформация Ad5, основанная на E1, ограничена нейронными клетками (Shaw et al. Faseb J 16(8): 869-71(2002)). Учитывая значительный видовой барьер между клетками человека и птиц, эффективная иммортализация множества тканей птиц за счет трансфекции ожидается в еще меньшей степени.

Линии клеток млекопитающих, трансформированные по E1, использовали для получения живых очищенных векторов аденовируса в клинических исследованиях. При тщательном контроле количества загрязняющей клеточной ДНК в препарате вакцины и ее размера трансформирующие гены Ad5 не рассматривают как защитный барьер (Vaccines and Related Biological Products advisory committee, session from May 16, 2001).

Аденовирусы реплицируются в ядре зараженной клетки. Поскольку неделящиеся клетки-хозяева не допускают полного жизненного цикла вируса, аденовирусы развили механизм, чтобы перевести клетки в S-фазу. Для увеличения размера вспышки дочерних вирусов до максимума они также развили механизм избегания апоптоза как реакции клетки-хозяина на проникновение капсида и репликацию вируса. Область генома, которая обеспечивает как прогрессию клеточного цикла, так и торможение апоптоза, представляет собой область E1.

E1 область фактически состоит из двух отдельных кассет экспрессии, E1A и E1B, выстроенных в тандеме, и каждая из которых наделена собственным промотором и сайтом полиаденилирования. По меньшей мере, три белка транслируются из первичного транскрипта E1A за счет альтернативного сплайсинга. Было обнаружено, что среди прочих белки E1A разрушают комплексы RB/E2F и противостоят коактиваторам транскрипции p300 и CBP. Освобождение E2Fs от репрессора RB индуцирует прогрессию клеточного цикла из фазы G1 в S в то время как комплекс E1A/p300 индуцирует апоптоз через несколько путей (Putzer B.M. et al., Cell Death Differ. 7:177-88 (2000)), включая репрессию транскрипции MdM2, отрицательного регулятора ключевого сенсора апоптоза, p53.

Поскольку E1A сенсибилизирует клетки к TNF-индуцированному апоптозу, он считается противоопухолевым агентом, и он используется в экспериментальных подходах для лечения опухолей (Lee W.P. et al., Cancer Res. 63:6229-36 (2003)).

Кроме того, действуя как модулятор транскрипции, он ведет клетки к де-дифференциации, особенности, предпочтительной для потенциального клеточного субстрата.

Guilhot и др. (Guilhot C. et al., Oncogene 8:619-24 (1993)) показали, что ретровирусная трансдукция белка 12S E1A из Ad5 может привести к иммортализации клеток перепела. По всей видимости это является следствием взаимодействия между RB птицы и E1A. Однако процесс не осуществляется, когда ген вводят путем трансфекции голой ДНК вместо инфекции ретровируса (собственное наблюдение). Авторы заявки предполагают, что чрезвычайно эффективная и устойчивая трансдукция путем инфекции ретровируса создала пул клеток, достаточно большой, чтобы накопить отдельные клетки со спонтанными геномными изменениями, которые блокировали апоптоз, который в норме индуцируется при инактивации RB. Эти необходимые, но неизвестные изменения увеличивают риск для вакцинируемых, и получающуюся линию клеток нельзя считать сконструированной линией клеток (результат определенных блоков в специфичных проводящих путях). Кроме того, трансформирующий ген, введенный посредством ретровирусов, фланкирован инвертированными концевыми повторами и, следовательно, может быть мобилизован. Такое явление может даже быть более выраженным в линиях клеток, которые экспрессируют обратную транскриптазу из эндогенных ретровирусов.

Сущность изобретения

Ввиду изложенного выше, по-прежнему требуется разработка линии клеток птицы с удобными свойствами роста для крупномасштабного производства, с применением определенного сочетания иммортализующих/трансформирующих генов. Кроме того, желательно, чтобы ни один из этих генов не мог трансформировать клетки млекопитающих, вне зависимости от других генов. Кроме того, отдельный ген не должен оказывать иммортализующего/трансформирующего действия или приводить к апоптозу клеток, экспрессирующих соответствующий ген. Риск сопряженного переноса реципиенту вакцины дополнительно должен быть сведен к минимуму путем размещения соответствующих генов на отдельных блоках экспрессии. Наконец, поскольку население обычно подвергнуто воздействию соответствующих генов, было бы желательно, чтобы эти гены не были связаны с формированием опухолей у людей. Производимая линия клеток не должна высвобождать инфекционные вирусные частицы из эндогенных ретровирусов или вообще не проявлять активность обратной транскриптазы.

Было обнаружено, что трансформация клеток птиц двумя специфическими вирусными и/или клеточными генами, один из которых действует на белки ретинобластомы, а другой действует на белок p53, обеспечивает линию клеток, хорошо подходящую для получения вирусов для вакцинации.

Таким образом, изобретение обеспечивает:

(1) линию клеток птиц, иммортализованную с помощью сочетания вирусных и/или клеточных генов (которые ниже будут коротко называться "ген (гены)"), по меньшей мере, одного первого гена, воздействующего на функцию белка ретинобластомы и, по меньшей мере, одного второго гена, воздействующего на белок p53 или представителя данного семейства, где, предпочтительно, первый ген подавляет контролирование контрольного пункта G1 и второй ген подавляет апоптоз, индуцированный первым геном;

(2) способ получения линии клеток, как определено выше в (1), содержащий трансформирование/трансфицирование исходной клетки первым и вторым геном;

(3) применение линии клеток, как определено в (1) выше, для получения биологических препаратов или вирусов, предпочтительно, для получения вакцины или для генотерапии; и

(4) способ получения вирусов или биологических препаратов, с применением линии клеток, как определено выше в (1).

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - схематические отрезки плазмид экспрессии, используемые для усиленной иммортализации первичных клеток утки (пример 2). Сигналы полиаденилирования опущены для ясности. Буквенно-цифровые обозначения слева представляют собой короткие идентификаторы плазмид. mPGK и hPGK - промоторы фосфоглицераткиназы мыши и человека соответственно; ad5, E1-эндогенный промотор Ad5; moCMV, быстродействующий ранний промотор CMV мыши; tk - промотор киназы тимидина вируса простого герпеса; orf 22 и gam1 - гены вируса CELO; E1A и E1B - гены области E1 аденовируса 5.

Фиг.2 - изображения фазовоконтрастной микроскопии в качестве примера формирования очага в трансфицированных Ad5-E1 эмбриональных клетках печени утки (плазмида 49E). A - начальное увеличение 4 x, для отображения полного очага, заключенного в стареющих первичных клетках. B - начальное увеличение 20 x: периметр крупного округлого очага малых клеток, собранных в компактный монослой, видимый в правой части рамки, быстро стареющие первичные клетки ближе к левой части.

Фиг.3 - иммунофлюоресцентный анализ для белков E1A и E1B 55К (пример 3). Два верхних ряда - смесь иммортализованных плазмидой 49E и первичных клеток печени утки; нижние два ряда - клетки положительного контроля 293. Левый столбец - фазовоконтрастные изображения; средний столбец - иммунное окрашивание белков E1A или E1B 55К, как обозначено на фигурах; правый столбец- окрашивание DAPI. Белок E1B 55К характерным образом локализуется к цитоплазме и собирается в скопления, что дает неравномерное распределение пятнами. E1A является ядерным белком. Следует отметить уплотненные ядра, которые ярко окрашиваются DAPI в трансформированных клетках утки.

Фиг.4 - анализ Q-PERT (количественный анализ PERT) супернатанта клеток для обнаружения активности ретровирусов (пример 4). Полужирные квадраты - положительный контроль CHO; незаполненные квадраты - отрицательный контроль воды; полужирные ромбы - фибробласты эмбрионов кур; полужирные треугольники - отрицательный контроль линии клеток 293; серые круги - отрицательный контроль только с субстратом; незаполненные треугольники - клетки печени утки, иммортализованные плазмидой 49E; дельта Rn - излучение репортерного красителя над уровнем начальной фоновой флюоресценции.

Фиг.5 - амплификация MVA в некоторых из описанных линий клеток утки и CEFp (пример 5). Инфицирование было выполнено с MOI (множественностью заражения) 0,1. Титрование было выполнено на клетках VERO спустя 48 часов после инфицирования (Пример 2). CEFp - первичные фибробласты эмбрионов кур.

Фиг.6 - серийное пассирование MVA в клетки сетчатки утки, иммортализованные плазмидой 49E (пример 5). Полужирные квадраты - размер вспышки; столбцы - вводимое количество вируса, доведенное до MOI 0,1. Вводимое количество вируса дается как стандарт для демонстрации, что размер вспышки не зависит от экспериментальных флуктуаций в количестве клеток (которое в свою очередь определяет вводимое количество вируса посредством MOI).

Список последовательностей - текст в произвольной форме

SEQ ID NO:	Описание - текст в произвольной форме
1	Праймер VS182
2	Праймер VS183
3	Праймер VS184
4	Праймер VS185
5	Праймер VintSA-F
6	Праймер VintSA-R
7	Плазмида pEFAd5E1A
8	Плазмида pEFAd5E1BSA
9	Плазмида 49E
10	Плазмида 25F
11	Праймер V206
12	Праймер V207
13	Праймер V208
14	Праймер V209
15	Праймер RT
16	Праймер cDNA 1
17	Праймер cDNA 2
18	Плазмида 60E
19	Плазмида 36E

Подробное описание изобретения

Термины "иммортализованный", "иммортализованные клетки" и "иммортализованная линия клеток" в соответствии с настоящим изобретением относятся к клетке или линии клеток, которую трансфицировали/трансформировали определенными функциональными последовательностями ДНК, придающими возможность, по меньшей мере, 200 пассажей, предпочтительно, неограниченного количества пассажей, то есть бессмертия, соответствующим исходным клеткам.

Термин "генная кассета" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как последовательность ДНК, содержащую ген, препятствующий функции белка ретинобластомы, то есть который прямо или косвенно (например, после экспрессии) добивается разрушения комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F и который, кроме того, содержит ген вируса, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоза за счет p53, такой как белок аденовируса E1B 55К всех групп, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно из папилломавирусов человека низкого риска (HPV) (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз за счет p53, такой как mdm2.

Более подробно описанная выше генная кассета содержит "первый ген", который в предпочтительном аспекте (1) прямо или косвенно (например, посредством клеточных индукторов) обеспечивает разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Этот первый ген может представлять собой ген вируса, такой как E1A мастаденовируса, gam1 и orf22 CELO или E7 папилломавирусов, предпочтительно папилломавирусов человека низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, такой как конститутивно активный CDK4 или сверхэкспрессируемый циклин типа D. Активность первого гена обеспечивает прогрессию клеточного цикла обычно за счет индукции апоптоза или торможения роста при увеличении пассирования.

"Второй ген" присутствует в описанной выше генной кассете для противостояния данному эффекту первого гена. Он предотвращает апоптоз или торможение роста и предпочтительно действует путем ингибирования активации транскрипции за счет p53 посредством увеличения расщепления p53 или преобразования p53 из трансактиватора в репрессор транскрипции. Предпочтительно "второй ген" способен предотвращать активацию транскрипции за счет p53, в том числе подавлять функцию p53 и обеспечивать уменьшение стабильности p53. "Второй ген" может представлять собой ген вируса, такой как белок аденовируса E1B 55К всех групп, orf22 CELO, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно папилломавирусов человека низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз посредством p53, такой как mdm2. Предпочтительно "второй ген" представляет собой orf22 CELO или E1B 55k аденовируса.

Это полностью противоположно введению экзогенного активного p53 дикого типа, которое было связано с получением линии фибробластов кур, за счет неизвестного механизма (US 5 879 924).

"Биологические препараты" в контексте настоящего изобретения содержат терапевтические и рекомбинантные белки, включая антитела, ферменты, гормоны, рецепторы или их лиганды и продукты их слияния. Предпочтительными биологическими препаратами являются рекомбинантные белки.

Одним предпочтительным аспектом варианта выполнения (1) является применение линии клеток, полученной из эмбриона или вылупившейся курицы, утки, гуся, перепела и т.п., предпочтительно из курицы или утки. В особенно предпочтительном аспекте (1) данная линия клеток дополнительно не обладает активностью обратной транскриптазы, получена в результате иммортализации первичной клетки, происходящей из эмбрионов кур, вылупившейся курицы, эмбрионов уток или вылупившихся уток, получена из экстраэмбриональной оболочки и/или культивирована в среде определенного химического состава. Среда предпочтительно не содержит сыворотку животного.

Другим предпочтительным аспектом варианта выполнения (1) является то, что клетки, подвергнутые иммортализации, являются первичными клетками, включая фибробласты, клетки из выделенных сегментов тела (сомитов) или выделенные одиночные органы, включая ткани нейронов, мозга, сетчатки, почек, печени, сердца, мышц и экстраэмбриональные ткани и мембраны, предохраняющие эмбрион. Наиболее предпочтительно клетки из экстраэмбриональных мембран или сетчатки.

Иммортализацию, приводящую к клеткам варианта выполнения (1), предпочтительно проводят путем невирусной трансфекции, включая, без ограничений, трансфекцию, опосредованную липосомами, преципитатами дендримеров или гидроксиапатита ("фосфата кальция") и электропорацию.

Предпочтительно первый ген в варианте выполнения (1), представляет собой ген вируса, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Он включает, без ограничений, ген E1A аденовируса из мастаденовирусов (предпочтительно из мастаденовирусов группы С), белок E7 папилломавирусов, предпочтительно из вируса папилломы человека низкого риска (HPV) (такого как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), ген orf 22 аденовирусов птиц и/или открытые рамки считывания E43 из атаденовируса овцы. Альтернативно первый ген варианта выполнения (1) представляет собой ген клетки, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Он включает, без ограничений, циклин Dl, циклин D2, циклин D3 и/или мутированный CDK4, не восприимчивый к инактивации за счет p16INK4a.

Второй ген варианта выполнения (1) предпочтительно представляет собой ген вируса, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоз за счет p53. Он включает, без ограничений, гены, кодирующие белок E1B55K аденовируса всех групп, GAM-1 из CELO, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно из HPV низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18). Наиболее предпочтительными являются гены, кодирующие белок E1B55K аденовируса и GAM-1 из CELO. Альтернативно второй ген кодирует клеточный белок, предотвращающий торможение роста и апоптоз за счет p53, такой как mdm2.

Первый и второй гены варианта выполнения (1) предпочтительно пространственно разделены гетерогенными последовательностями или расположены на разли