Способ продуцирования экзогенного белка в молоке трансгенных млекопитающих и способ очистки белков из молока

Способ продуцирования экзогенного белка в молоке трансгенных млекопитающих и способ очистки белков из молока

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Белковые факторы и гормоны, участвующие в поддержании здоровья человека, в настоящее время производятся фармацевтической индустрией путем экстракции или - в последние десятилетия - с помощью рекомбинантной технологии. Экспрессии генетических конструкций, включенных в нужные гены, с успехом добивались в линиях клеток бактерий, дрожжей или млекопитающих. Однако применение культур клеток млекопитающих для получения комплексных белков, таких как белки, которые требуют точности в соблюдении характера гликозилирования, сопряжено с внедрением дорогостоящих процессов.

В последнее десятилетие все больше используется технология рекомбинантных ДНК для продуцирования коммерчески важных биологических материалов. С этой целью клонированы последовательности ДНК, кодирующие целый ряд белков человеческого организма, имеющих важное медицинское значение. К ним относятся инсулин, активатор плазминогена, альфа-1-антитрипсин и факторы VIII и IX свертывания крови. В настоящее время, несмотря на наличие новых технологий рекомбинантной ДНК, такие белки обычно очищают из крови и тканей - дорогостоящие и отнимающие много времени процессы, которые могут повлечь за собой риск переноса инфекционных агентов, таких как факторы, которые вызывают СПИД и гепатит.

Хотя экспрессия последовательностей ДНК в бактериальных клетках для продуцирования необходимых и важных с медицинской точки зрения белков выглядит привлекательно, на практике бактерия часто оказывается неподходящим объектом в качестве хозяина, потому что инородные белки в бактерии не стабильны, и процессинг протекает некорректно.

Осознавая существование данной проблемы, попытались осуществить экспрессию клонированных генов в культуре ткани млекопитающего, добиваясь в некоторых случаях жизнеспособной стратегии. Однако периодическое культивирование животных клеток является дорогостоящим и технически трудоемким процессом.

Следовательно, существует потребность в способе получения биологических веществ, таких как корректно модифицированные полипептиды эукариотов, отличающемся высоким выходом продукта и низкой себестоимостью. Отсутствие агентов, способных инфицировать человеческий организм, должно стать достоинством такого способа.

Возможность получения трансгенных животных с нужным геном, например рогатого скота, с целью получения значительных количеств белка человеческого организма в составе молока, представляет значительный интерес для индустрии. Некоторые группы исследователей опубликовали статьи о своих успехах в продуцировании человеческого сывороточного альбумина, альфа-антитрипсина и некоторых других белков у трансгенных коров или коз.

Предварительно было проведено множество экспериментов на мышах или крысах, и трансгенная экспрессия всегда ограничивалась молочными железами, так как использовали промоторы бета-казеина или лактальбумина, которые реагировали только с фактором транскрипции молочной железы женских особей в период лактации.

Экспрессия гетерологического белка исключительно в молоке связана с тем, чтобы избежать нежелательного влияния на здоровье животного-хозяина и обеспечить легкий способ очистки.

В настоящее время исследователи уделяют внимание нескольким системам для улучшения выхода продукции клеточной трансфекции или селекции и выбора источника гомологичной эмбриональной соматической клетки для улучшения жизнеспособности и иммунной системы клонированных животных.

С другой стороны, существует огромный интерес к явлению переноса ядра соматической клетки в основном в связи с тем, чтобы сделать возможным размножение элитных домашних животных и создание трансгенных животных для сельскохозяйственных и биомедико-биологических целей. Коротко, перенос ядра (ПЯ) включает в себя энуклеацию ооцита реципиента, с последующим переносом донорской клетки в перивителлиновое пространство в непосредственной близости от реципиентного цитопласта, и их слияние. Развитие индуцируется искусственно, посредством химической или физической активации. Путем переноса ядра соматической клетки успешно получено клонированное потомство у овцы (Campbell, K.H., et al., Nature 380: 64-66 (1996), 1996; Wells, D.N., et al., Biol Reprod 57: 385-393 (1997); Wilmut, I., et al, Nature 385:810-813 (1997)); козы (Baguisi, A., et al., Nat Biotechnol 17: 456-461 (1999)) и у коровы (Cibelli, J.B., et al., Science 280: 1256-1258 (1998); Kato, Y., et al., Science 282: 2095-2098 (1998); Wells, D.N., et al., Reprod Fertil Dev 10: 369-378 (1998)).

Существует несколько факторов, влияющих на результаты ПЯ, которые включают в себя способы энуклеации, слияния, активации и синхронизации цикла клетки донор-реципиент. Высокая эффективность энуклеации реципиентных ооцитов достигается путем применения ДНК-специфических жизнеспособных красителей для визуализации хроматина (Stice, S. L., and Keefer, C. L., Biol Reprod 48: 715-719 (1993); Westhusin, M.E., et al., J Reprod Fertil 95: 475-480 (1992)). Слияние донорской клетки с ооцитом реципиента зависит от безошибочности выравнивания клетки в пульсирующем поле, от контакта клетки донора с ооцитом реципиента и от размера донорских клеток (Collas, P., et al., Anal Biochem 208: 1-9 (1993)). Усовершенствована активация ПЯ воспроизведенного эмбриона, и темпы развития в бластоцист стали сравнимы с оплодотворенными in vitro ооцитами (Liu, L., et al., Mol Reprod Dev 49: 298-307 (1998)).

Продемонстрировано успешное развитие эмбрионов с ПЯ при использовании зрелых ооцитов (Willadsen, S. M., Nature 320: 63-65 (1986)), зигот (McGrath, J., and Solter, D., Dev Biol N Y 4:37-55 (1985)) и эмбрионов на стадии деления (Tsunoda, Y., et al., J Reprod Fertil 96: 275-281 (1992)) как реципиентов цитопластов, однако это зависит также и от источника донорских ядер. Совместимость клеточного цикла между реципиентом-цитопластом и донорскими клетками является одним из важных факторов, который влияет на развитие эмбрионов с ПЯ. Для сохранения плоидности воспроизводимого эмбриона необходима надлежащая синхронизация.

Митотический клеточный цикл имеет следующие последовательные фазы: предрепликационная гэп-фаза (G1), синтез ДНК (S-фаза), предмитотическая гэп-фаза (G2) и митоз (M-фаза). В течение одного клеточного цикла все геномные ДНК перед митозом единожды реплицируются. Донорское ядро в состоянии интерфазы переносили в энуклеированный зрелый ооцит (метафаза II), претерпевший несколько морфологических изменений. После слияния, но перед тем как произойдет разрыв оболочки донорского ядра (NEBD), хромосомы конденсируются (PCC). Эти процессы индуцируются посредством фактора-промотора созревания/митоза/мейоза (MPF) и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) (Collas, P., and Robl, J. M., Biol Reprod 45: 455-465(1991)). Активность MPF и MAPK найдена во всех клетках в состоянии мейоза и митоза, и наивысшая активность обнаружена в метафазе, и в ооцитах млекопитающих высокие уровни активности могут также индуцировать угнетение в метафазе II. Уменьшение активности MPF и MAPK при оплодотворении или активации кальций-ионофором является сигналом для завершения мейоза, эмиссии второго полярного тельца, деконденсации ядра спермы и формирования пронуклеуса.

Непосредственное действие NEBD и PCC на донорский хроматин зависит от клеточного цикла ядра донора в момент переноса. Диплоидные G₀/G_l-ядра конденсируются с образованием одинарных хроматид, но тетраплоидные G₂-ядра конденсируются с образованием двойных хроматид. Однако ядра в S-фазе в момент переноса выглядят “пульверизованными”; PCC вызывает обширное повреждение ДНК. Следовательно, корректная плоидность может быть получена посредством перенесения G₁- или G₀-ядра в ооциты, находящиеся в метафазе II в момент активации или перед активацией. Второй способ состоит в переносе ядра в предварительно активированный ооцит в S-фазе, в данном случае возможно применение донорской клетки в G₁, G₀ или S-фазах. Поскольку активность MPF и MAPK низкая, хроматин деконденсируется и ДНК претерпевает репликацию без PCC и NEBD.

Третья схема синхронизации была продемонстрирована на мышах, когда развитие жизнеспособного потомства получали путем реконструкции эмбриона, используя донорскую клетку в G₂-фазе или метафазе и энуклеированный ооцит в метафазе II (Cheong, H.T., et al., Biol Reprod 48: 958-963 (1993); Kwon, 0.Y., and Kono, T., Proc Natl Acad Sci USA 93: 13010-13013 (1996)). Обнаружено вытеснение полярного тельца из эмбриона, воспроизводимого посредством ПЯ, в результате чего получен одинарный диплоид эмбриона и диплоид полярного тельца (Kwon, O.Y., and Kono, T., Proc Natl Acad Sci USA 93: 13010-13013 (1996)). Однако о формировании полярного тельца после ПЯ в энуклеированный ооцит в MII-фазе у рогатого скота, овцы или свиней данных нет, что говорит о различии в специфике механизма, контролирующего формирование интактной веретенообразной структуры и вытеснение полярных телец.

Предполагается, что стадии клеточного цикла донорской клетки и реципиента также играют важную роль в перепрограммировании ядра донорской клетки. Увеличение промежутка времени между переносом донорского ядра и транскрипцией зиготы может улучшить перепрограммирование ядра. По этой причине некоторые авторы несколько часов активировали ооцит после слияния (Cibelli, J.B., et al., Science 280: 1256-1258 (1998); Wakayama, T., et al., Nature 394: 369-374 (1998); Wells, D.N., et al., Biol Reprod 60: 996-1005 (1999)). Другие авторы использовали последовательный перенос ядра (Stice, S.L., and Keefer, C. L., Biol Reprod 48: 715-719 (1993)).

Неизученный способ увеличения времени перепрограммирования донорского ядра состоит в переносе ядра перед метафазой II. После разрыва зародышевого пузырька (GVBD) все превращения ядра регулировались главным образом посредством увеличения MPF и MAPK в цитозоле ооцита, что предотвращает реорганизацию оболочки ядра и начало S-фазы до оплодотворения или активации. Следовательно, зрелый ооцит может быть универсальным реципиентом для донорской клетки, находящейся в метафазе или G₂-фазе. Донорские клетки даже могут быть использованы в G₁-фазе или G₀-фазе, если индуцировать активацию в S-фазе перед делением клетки.

Перепрограммирование ядра возможно при использовании в качестве донорских клеток бластомеров в G₂-фазе или M-фазе (Cheong, H.T., et al., Biol Reprod 48: 958-963 (1993); Kwon, O.Y., and Kono, T., Proc Natl Acad Sci USA 93: 13010-13013 (1996); Liu, L., et al., Mol Reprod Dev 47: 255-264 (1997)). Объяснением этому может быть тот факт, что в результате конденсации хромосомы некоторые факторы перемещаются из хроматина. Фактически, при переносе ядра NEBD и PCC рассматривались как морфологические признаки перепрограммирования ядра. Кроме того, во время оплодотворения хроматин спермы находится в крайне конденсированном состоянии, его объем значительно меньше, чем объем ядра соматических клеток, и ооцит имеет возможность удалить ядерный белок спермы. Хромосомы ооцита во время слияния спермы с ооцитом также конденсированы. Возможно, что конформация конденсированного хроматина может иметь некоторую биологическую значимость. Следовательно, посредством имитации этой ситуации через перенос ядра в метафазе, энуклеированный в метафазе реципиент может улучшить результат ПЯ. Тем не менее, несколько исследователей применили этот подход к домашним животным, и использовали при этом бластомеры в качестве донорских клеток (Liu, L., et al., Mol Reprod Dev 47: 255-264 (1997)).

Целью данного изобретения является характеристика и повышение качества известного переноса ядра соматической клетки, создание надежного и экономичного технического приема для получения генетически идентичных телят из зрелых донорских клеток.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенному млекопитающему, отличному от человека, характеризующемуся продуцированием неожиданно высоких уровней рекомбинантного гормона роста в своем молоке. Рекомбинантный гормон роста может представлять собой гормон роста человека, но не ограничиваться этим. Трансгенное млекопитающее, отличное от человека, может представлять собой животное рода быков, но не ограничиваться этим.

Изобретение, кроме того, относится к плазмиде, которая обеспечивает экспрессию нужного белка в клетках молочной железы млекопитающих, в которых экспрессия регулируется посредством промотора бета-казеина. Нужный белок может представлять собой гормон роста человека, но не ограничиваться этим.

Изобретение относится также к различным способам создания трансгенных млекопитающих, отличных от человека, которые продуцируют рекомбинантный гормон роста в своем молоке. Рекомбинантный гормон роста может, не ограничиваясь этим, представлять собой гормон роста человека. Трансгенное млекопитающее, отличное от человека, может, не ограничиваясь этим, представлять собой животное рода быков.

Изобретение относится также к способу продуцирования нужного белка, включающему в себя создание трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое продуцирует указанный белок в своем молоке, получение указанного молока от трансгенного млекопитающего, отличного от человека, и выделение указанного нужного белка из молока. Нужный белок может представлять собой, не ограничиваясь этим, гормон роста человека. Трансгенное млекопитающее, отличное от человека, может представлять собой, не ограничиваясь этим, животное рода быков.

Изобретение относится также к способу продуцирования и выделения рекомбинантного гормона роста из молока трансгенного млекопитающего. Рекомбинантный гормон роста может представлять собой, не ограничиваясь этим, гормон роста человека. Трансгенное млекопитающее может представлять собой, не ограничиваясь этим, животное рода быков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1A-1B показан суточный объем молока, собираемого от трансгенной коровы, полученной путем слияния энуклеированного ооцита и фибробласта, предварительно трансфицированного плазмидой, содержащей ген, который кодирует гормон роста человека (hGH) и промотор, который направляет его экспрессию к клеткам молочной железы.

На фиг.2A-2C показана плотность бактерий, обнаруженных в молоке, собираемом от той же самой трансгенной коровы.

На фиг.3A-3B показана биологическая активность hGH, содержащегося в молоке той же самой трансгенной коровы.

На фиг.4A показана суточная масса hGH, получаемого из молока той же самой трансгенной коровы. Эта величина и суточный объем молока, собираемого от трансгенной коровы, вместе нанесены на график на фиг.4B.

На фиг.5A показана концентрация hGH и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) в сыворотке той же самой трансгенной коровы, и суточная масса hGH, продуцируемого в молоке той же самой трансгенной коровы. Концентрация hGH в сыворотке трансгенной коровы и суточная масса hGH, продуцируемого в молоке трансгенной коровы, вместе нанесены на график на фиг.5B. На фиг.5C профили концентрации hGH и IGF-1 во времени в сыворотке трансгенной коровы вместе нанесены на график.

На фиг.6A и 6B показана концентрация hGH и инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) в сыворотке двух трансгенных телят, полученных посредством субклонирования коровы, которая является трансгенной в отношении продуцирования hGH в ее молоке.

На фиг.6C и 6D профили концентрации hGH и IGF-1 во времени в сыворотке каждого из трансгенных телят вместе нанесены на график.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к отличному от человека трансгенному млекопитающему, характеризующемуся продуцированием неожиданно высокого уровня рекомбинантного гормона роста в своем молоке. Указанное млекопитающее может представлять собой, не ограничиваясь этим, животное рода быков. Другой род трансгенных млекопитающих может представлять собой, не ограничиваясь этим, род свиней, род овец, род коз или род грызунов.

Рекомбинантный гормон роста может представлять собой, не ограничиваясь этим, гормон роста человека. Данная молекула, известная также как соматотропин, является белком, состоящим из 191 аминокислоты с молекулярным весом приблизительно 22 кД. Она необходима для линейного роста, и применение ее хорошо изучено.

Изобретение также относится к трансгенному млекопитающему, характеризующемуся тем, что в его молоке продуцируется рекомбинантный гормон роста, стимулирующий молочные железы животного к продуцированию большего количества молока, содержащего указанный гормон.

Изобретение относится также к плазмиде, содержащей ген, кодирующий нужный белок, оперативно связанный с промотором бета-казеина и геном β-лактамазы. Указанный нужный белок может представлять собой, не ограничиваясь этим, гормон роста человека. Указанная плазмида может представлять собой плазмиду pRβhGH.

В следующем воплощении, плазмида дополнительно содержит устойчивый к неомицину ген для селекции генетически устойчивых клеток. Примером такой плазмиды является плазмида pRNeo.

В следующем воплощении плазмида содержит ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок, такой как GFP, который контролируется промотором цитомегаловируса (CMV). Примером такой плазмиды является плазмида pRNeoGreen.

Кроме того, изобретение относится к плазмиде, такой как описана выше и которая линеаризована посредством рестрикционного расщепления. В частности, прибегая к использованию рестрикционного фермента ApaLI, вырезали ген β-лактамазы.

Ведется подготовка процедуры депонирования вышеназванных плазмид согласно Будапештскому Договору. Имя и адрес депонента: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany. Номера соответствующих образцов будут получены в порядке очереди.

Далее, изобретение относится к плазмиде, сконструированной на основе Neo-резистентной генсодержащей плазмиды, такой как pVEβcashGH, в которую была встроена модифицированная укороченная область бета-казеинового промотора выше области, кодирующей hGH. Линейный фрагмент может быть получен из плазмиды pVEβcashGH посредством удаления гена бета-лактамазы.

Изобретение, кроме того, относится к способу трансфекции генетических конструкций с использованием комбинации катионных липидов для утилизации липосомами.

Описаны также способы селекции неомицин-резистентных клеток в подходящей среде, так же как и способы селекции зеленых флуоресцирующих трансгенных клеток. Данные клетки отбирали с осторожностью, чтобы избегать повреждения клетки.

Изобретение относится также к способу переноса ядер клеток, угнетенных в G₀-фазе или в различные периоды времени клеточного цикла, в энуклеированные бычьи ооциты.

Изобретение относится к способу переноса трансгенного эмбриона в простимулированную гормоном матку коровы.

Согласно изобретению описан способ определения параметров здоровья животного. Для того чтобы определить такие параметры, анализы проводили как на основе сыворотки, так и на основе молока.

Далее, изобретение относится к способу создания трансгенного млекопитающего, отличного от человека, включающему в себя получение гена, который кодирует гормон роста, клонирование гена в плазмиду, где ген оперативно связывается с промотором, который будет направлять экспрессию гена в клетки молочной железы, что приводит к экспрессии плазмиды, трансфекцию соматических клеток с экспрессируемой плазмидой таким образом, что плазмида включается в геном клеток, что приводит к образованию трансгенных соматических клеток, энуклеацию зрелого ооцита, что приводит к образованию безъядерного ооцита, слияние одной трансгенной соматической клетки с энуклеированным ооцитом, что приводит к образованию моноклеточного эмбриона, имплантирование эмбриона в матку млекопитающего-реципиента и мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение, кроме того, относится к способу создания трансгенного млекопитающего, отличного от человека, включающего в себя экстракцию соматических клеток из женской особи млекопитающего, которая является трансгенной по продуцированию рекомбинантного гормона роста в своем молоке, не обязательно фибробластов, энуклеацию зрелого ооцита, что приводит к образованию безъядерного ооцита, слияние одной трансгенной соматической клетки с энуклеированным ооцитом, что приводит к образованию моноклеточного эмбриона, имплантацию эмбриона в матку млекопитающего-реципиента и мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Далее, изобретение относится к способу создания трансгенного млекопитающего, отличного от человека, включающего в себя суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, которая является трансгенной по продуцированию рекомбинантного гормона роста в своем молоке, искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи нетрансгенного млекопитающего, отличного от человека, с получением эмбриона, отбор эмбрионов, имплантирование эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение далее относится к способу создания трансгенного млекопитающего, отличного от человека, включающему в себя суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, которая трансгенна по продуцированию рекомбинантного гормона роста в своем молоке, искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи млекопитающего, отличного от человека, которая является трансгенной по продуцированию указанного рекомбинантного гормона роста, получение эмбрионов, отбор эмбрионов, имплантирование эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и моноторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение далее относится к способу создания трансгенного млекопитающего, отличного от человека, включающему в себя суперовуляцию нетрансгенной женской особи, отличной от человека, искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи млекопитающего, отличного от человека, которая является трансгенной по продуцированию указанного рекомбинантного гормона роста, получение эмбрионов, отбор эмбрионов, имплантирование эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и моноторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Рекомбинантный гормон роста может представлять собой гормон роста человека, но этим не ограничивается. Трансгенное млекопитающее, отличное от человека, может представлять собой животное рода быков, но этим не ограничивается.

Изобретение, кроме того, относится к способу продуцирования белка, включающему в себя создание трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое продуцирует нужный белок в своем молоке с неожиданно высокой продуктивностью, получение молока от трансгенного млекопитающего, отличного от человека, и выделение нужного белка из молока.

Изобретение также относится к способу продуцирования нужного белка у трансгенного млекопитающего, отличного от человека, выполненному посредством технологического приема, включающего в себя получение гена, который кодирует указанный нужный белок, клонирования гена в плазмиду, где ген оперативно связывается с промотором, который будет направлять экспрессию гена в клетки молочной железы, что приводит к экспрессии плазмиды, трансфекции соматических клеток, не обязательно фибробластов, с плазмидой, таким образом, что плазмида включается в геном указанных соматических клеток, что приводит к образованию трансгенных соматических клеток, энуклеацию зрелого ооцита, что приводит к образованию безъядерного ооцита, слияние одной трансгенной соматической клетки с энуклеированным ооцитом, что приводит к образованию моноклеточного эмбриона, имплантирование эмбриона в матку млекопитающего-реципиента и мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение относится также к способу продуцирования нужного белка трансгенным млекопитающим, отличным от человека, выполненному посредством технологического приема, включающего в себя экстракцию соматических клеток из женской особи млекопитающего, трансгенной по продуцированию указанного нужного белка в своем молоке, не обязательно фибробластов, энуклеацию зрелого ооцита, что приводит к образованию безъядерного ооцита, слияние одной трансгенной соматической клетки с энуклеированным ооцитом, что приводит к образованию моноклеточного эмбриона, имплантацию эмбриона в матку млекопитающего-реципиента и мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение относится также к способу продуцирования нужного белка у трансгенного млекопитающего, отличного от человека, выполненному посредством технологического приема, включающего в себя суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, трансгенного по продуцированию указанного нужного белка в своем молоке, искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи нетрансгенного млекопитающего, отличного от человека, продуцирование эмбрионов, отбор эмбрионов, имплантацию эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и мониторинга беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение относится также к способу продуцирования нужного белка трансгенным млекопитающим, отличным от человека, выполненному посредством технологического приема, включающего в себя суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, которая трансгенна по продуцированию указанного нужного белка в своем молоке, искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи млекопитающего, отличного от человека, которая трансгенна по продуцированию указанного нужного белка, продуцирование эмбрионов, отбор эмбрионов, имплантацию эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и моноторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Изобретение относится также к способу продуцирования нужного белка трансгенным млекопитающим, отличным от человека, выполненному посредством технологического приема, включающего в себя суперовуляцию женской особи нетрансгенного млекопитающего, отличного от человека; искусственное оплодотворение млекопитающего спермой, полученной от мужской особи млекопитающего, отличного от человека, являющейся трансгенной по продуцированию указанного нужного белка, продуцирование эмбрионов, отбор эмбрионов, имплантацию эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента и моноторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

Трансгенное млекопитающее, отличающееся тем, что продуцирует неожиданно высокие уровни нужного белка в своем молоке, может представлять собой, не ограничиваясь этим, животное рода быков. Трансгенные млекопитающие могут представлять собой и другой род млекопитающих, например, род свиней, род овец, род коз или род грызунов, но не ограничиваться этим. Нужный белок может представлять собой, но не ограничиваясь этим, гормон роста человека.

Изобретение далее относится к трансгенному млекопитающему, отличному от человека, относящемуся к роду быков, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста человека в своем молоке, и геном которого содержит интегрированную плазмиду, и указанная плазмида содержит ген гормона роста человека и промотор бета-казеина, который направляет экспрессию указанного гена в клетки молочной железы млекопитающего.

Изобретение далее относится к трансгенному млекопитающему, которое продуцирует неожиданно высокие уровни hGH, хотя при этом до сих пор не показан физический рост, ожидаемый при таком высоком уровне продуцирования hGH. Так как трансгенные быки находятся под воздействием присутствующих гормонов роста человека, ожидалось, что расти животные должны быстрее, чем в норме растут нетрансгенные животные, и страдать от таких заболеваний, как сахарный диабет, гипертензия, увеличение риска кардиососудистых заболеваний и гипертрофия органов, включая печень, селезенку, почки и сердце. Такие высокие уровни hGH теоретически должны приводить к нежизнеспособному состоянию. Однако дело не в этом. Млекопитающее, такое как корова, с вызывающими тревогу повышенными уровнями чужеродного белка в крови, представляет собой совершенно здоровое животное, и исключительная продуктивность по количеству производимого рекомбинантного белка представляется неожиданным и технологически прогрессивным благоприятствующим фактором.

Рекомбинантный гормон роста человека согласно изобретению продуцируется в неожиданно высоких количествах. Уровень продуцируемого гормона роста человека приблизительно составляет более чем 1,0 г/л молока. Уровень продуцируемого hGH может составлять более чем приблизительно 2,0 г/л молока. Уровень продуцируемого hGH также может быть больше, чем приблизительно 3,0 г/л молока. В другом воплощении, уровень продуцируемого hGH может составлять больше, чем приблизительно 4,0 г/л молока. Однако в другом воплощении, уровень продуцируемого hGH может составлять более чем приблизительно 5,0 г/л молока. В следующем воплощении, уровень продуцируемого hGH может составлять более чем приблизительно 6,0 г/л молока. Однако в следующем воплощении, уровень продуцируемого hGH составляет приблизительно от 1,0 г/л молока приблизительно до 7,0 г/л молока. В следующем воплощении, уровень продуцируемого hGH составляет приблизительно от 2,0 г/л молока приблизительно до 6,0 г/л молока. Однако в другом воплощении, уровень продуцируемого hGH составляет приблизительно от 2,0 и приблизительно до 5,0 г/л молока.

В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к способу выделения рекомбинантного гормона роста из молока трансгенного млекопитающего, а также к исследованию указанного гормона. Способы выделения могут включать в себя хроматографию и приемы по накоплению гормона. Могут применяться различные виды хроматографии, которые включают в себя ионообменную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой, заместительную молекулярную хроматографию или аффинную хроматографию. Ионообменная хроматография может представлять собой анионообменную хроматографию. Аффинная хроматография может представлять собой иммуноаффинную хроматографию. Кроме того, может проводиться многократная хроматография.

Изобретение далее относится к способу выделения рекомбинантного гормона роста из молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, включая осветление молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, что приводит к тому, что молоко становится прозрачным, и проведение хроматографии прозрачного молока, что приводит к получению очищенного рекомбинантного гормона роста.

Изобретение далее относится к способу выделения рекомбинантного гормона роста из молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, и включающему в себя осветление молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, что приводит к тому, что молоко становится прозрачным, проведение анионообменной хроматографии осветленного молока на расширенном слое, что приводит к получению вещества после анионообменной хроматографии, проведение хроматографии с обращенной фазой после анионообменной хроматографии, что приводит к получению вещества после хроматографии с обращенной фазой, проведение после хроматографии с обращенной фазой анионообменной хроматографии, что приводит к получению вещества после анионообменной хроматографии, проведение после анионообменной хроматографии заместительной молекулярной хроматографии, что приводит к получению вещества после заместительной молекулярной хроматографии, концентрирование вещества после заместительной молекулярной хроматографии, что приводит к получению концентрированного вещества, и проведение заместительной молекулярной хроматографии концентрированного вещества, что приводит к получению очищенного рекомбинантного гормона роста.

Изобретение также относится к способу выделения рекомбинантного гормона роста из молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, и включающему в себя осветление молока, полученного от трансгенного млекопитающего, что приводит к тому, что молоко становится прозрачным, проведение иммуноаффинной хроматографии прозрачного молока, что приводит к получению вещества после иммуноаффинной хроматографии, проведение хроматографии с обращенной фазой после иммуноаффинной хроматографии, что приводит к получению вещества после хроматографии с обращенной фазой, проведение после хроматографии с обращенной фазой анионообменной хроматографии, что приводит к получению вещества после анионообменной хроматографии, проведение после анионообменной хроматографии молекулярной вытеснительной хроматографии, что приводит к получению вещества после молекулярной вытеснительной хроматографии, проведение после молекулярной вытеснительной хроматографии стадии концентрирования, что приводит к получению концентрированного материала, проведение молекулярной вытеснительной хроматографии концентрированного вещества, что приводит к очищенному рекомбинантному гормону роста.

Рекомбинантный гормон роста, описанный выше при описании способов очищения, может представлять собой, не ограничиваясь этим, гормон роста человека. Трансгенное млекопитающее может представлять собой, не ограничиваться этим, животное вида быков.

Последующие примеры иллюстрируют, без ограничения, способ и композиции согласно изобретению. Что совершенно понятно специалистам в данной области, применимы и другие подходящие модификации и адаптации различных условий и параметров, обычно встречающихся в ферментативном производстве химикалий и процедурах очистки белка, если они не выходят за рамки изобретения.

ПРИМЕР 1

Конструкция экспрессирующих плазмид

Авторы создали конструкцию, несущую большой сегмент бычьего гена промотора бета-казеина, включающий в себя 5ґ-концевой короткий фрагмент некодирующей области гена бета-казеина, слитый с кодирующей последовательностью гена гормона роста человека. Используемая в различных конструкциях область бета-казеина убывала приблизительно от 3,8 т.п.н. и приблизительно до 1,3 т.п.н. Ген hGH охватывает приблизительно от 2 до 2,2 т.п.н., в зависимости от того, включена ли в него сигнальная поли-A-последовательность.

Экспрессирующую кассету помещали в полилинкер обычного вектора клонирования типа pUC или pBS.

Этот промотор, в данном случае, такой как бета-казеин и гетерологичный hGH, обеспечивает специфику ткани и экспериментальную регуляцию экспрессии генов под его контролем.

Типичным представителем плазмиды является pRβhGH, которая несет в себе полную длину промотора бета-казеина быка, слитого с кодирующей последовательностью гена гормона роста человека.

Другие созданные конструкции получены главным образом из исходной, для улучшения селекции трансфекции клеток или улучшения эффективности интеграции ДНК в геном бычьей клетки.

На первом этапе, для того, чтобы облегчить селекцию, выполнялась ко-трансфекция с генетицин-резистентным геном, содержащим плазмиду, но на следующем этапе применяли другую конструкцию в сходном векторе, содержащем hGH-экспрессирующую кассету, несущую ген NPT для резистентности к неомицину. Примером такой плазмиды является pRNeo.

Для конститутивной экспрессии зеленого флуоресцирующего белка, была получена другая плазмида, которая включала в себя CMV-промотор, энхансер растительной природы (alfalfa) и ген зеленого флуоресцирующего белка из медузы A. victoria. Примером такой плазмиды является pRNeoGreen.

Более того, была создана другая плазмида. Она была сконструирована на основе Neo резистентной ген-содержащей плазмиды, в которую выше кодирующей области hGH была включена модифицированная короткая область промотора бета-казеина. Данной плазмидой является pVEβcashGH.

Были созданы другие конструкции, в которых область β-лактамазы была вырезана посредством рестрикции ферментом ApaLI, и после электрофореза в агарозном геле и гель-экстракции был выделен линейный фрагмент, содержащий полную экспрессирующую кассету.

Конструкции анализировали при помощи рестрикционных ферментов и определения последовательности ДНК, и их способность сопровождать экспрессию hGH была предварительно протестирована на линии клеток молочной железы посредством распознавания флуоресцентным антителом.

В качестве примера, в деталях будет описано создание плазмиды pVEβcashGH, включая генетические