Сфингоидные полиалкиламиновые конъюгаты для вакцинации

Сфингоидные полиалкиламиновые конъюгаты для вакцинации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к вакцинации, проводимой с использованием полиалкиламиновых конъюгатов сфинголипидов для эффективной доставки биологически активных материалов, в частности антигенных молекул.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ниже приводится перечень разного рода материалов, которые можно рассматривать как существенные для характеристики достигнутого уровня в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.

US 5334761: «Cationic lipids»;

US 2001/048939: «Cationic reagents of transfection»;

US 5659011: «Agents having high nitrоgen cоntent and high cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide or guanidine and inorganic ammonium salts»;

US 5674908: «Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids»;

US 6281371: «Lipopolyamines, and the preparation and use thereof»;

US 6075012: «Reagents for intracellular delivery of macromolecules»;

US 5783565: «Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules»;

Marc Antoniu Ilies & Alexandru T. Balaban, Expert Opin. Ther. Patents, 11(11):1729-1752 (2001);

Miller AD. Chem. Int. Ed. Eng. 37: 1768-1785 (1998);

Nakanichi T. et al., J Control Release 61: 233-240 (1999);

Brunel F. et al., Vaccine 17: 2192-2193 (1999);

Guy B, et al. Vaccine 19: 1794-1805 (2001);

Lima KM et al. Vaccine 19: 3518-3525 (2001).

Многие природные биологические молекулы и их аналоги, включая белки и полинуклеотиды, чужеродные вещества и лекарственные средства, которые способны воздействовать на клеточную функцию на субклеточном или молекулярном уровне, для проявления своего эффекта преимущественно включаются в клетку. Для таких агентов клеточная мембрана представляет селективный барьер, который непроницаем для них. Клеточная мембрана имеет сложный состав, включающий фосфолипиды, гликолипиды и холестерин, а также эндогенные и экзогенные белки, функция которых опосредуется влиянием цитоплазматических компонентов, включающих Ca⁺⁺ и ионы других металлов, анионы, АТФ, микрофиламенты, микротрубочки, ферменты и Ca⁺⁺-связывающие белки, а также внеклеточный гликокаликс (протеогликаны, гликозаминогликаны и гликопротеины). Взаимодействие между структурными и цитоплазматическими компонентами клетки и их реакция на внешние сигналы определяют важность транспортных процессов для селективности мембраны, проявляемой как в аспекте внутриклеточной среды, так и на уровне межклеточных взаимодействий.

Также предметом исследования являлась успешная доставка средств, которые в естественных условиях не захватываются клеткой и не проникают в нее. Мембранный барьер может быть преодолен комплексами, образуемыми путем связывания средств с липидными композициями, которые очень близки по липидному составу природным клеточным мембранам. Такие композиции могут сливаться с клеточными мембранами, с которыми они вступают в контакт, или, чаще, могут захватываться по механизму пиноцитоза, эндоцитоза и/или фагоцитоза. Во всех этих процессах ассоциированные вещества доставляются внутрь клеток.

Липидные комплексы могут облегчать внутриклеточный транспорт также за счет того, что они позволяют преодолеть определяемое зарядом отталкивание между клеточными поверхностями, которые чаще всего заряжены отрицательно. Липиды в таких композициях включают амфипатический липид, такой как фосфолипиды клеточных мембран, и образуют в водных системах различные слои или агрегаты, такие как мицеллы или полые липидные везикулы (липосомы). Липосомы могут использоваться для захвата веществ, вводимых внутрь липосом; в других случаях рассматриваемые лекарственные молекулы могут включаться в липидные везикулы как внутренний компонент мембраны, а не захватываться в пространство водной везикулы или электростатически присоединяться к поверхности агрегата. Однако большинство используемых фосфолипидов является либо цвиттерионами (нейтральными молекулами), либо отрицательно заряженными молекулами.

Большим достижением в области изучения внутриклеточной доставки лекарственных веществ было открытие того факта, что положительно заряженный синтетический катионный липид хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA) в виде липосом или небольших везикул может спонтанно взаимодействовать с ДНК с образованием комплексов липид-ДНК, которые способны адсорбироваться на клеточных мембранах, и, захватываясь клетками либо путем слияния, либо, что более вероятно, по механизму адсорбционного эндоцитоза, приводят к экспрессии трансгена [Felgner, Р. L. et al., Prod. Nаtl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987); и U.S. Pat. No. 4897355 (Eppstein, D. et. аl.)]. В других случаях с успехом применяется аналог DOTMA 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP) в сочетании с фосфолипидом, что приводит к образованию ДНК-комплексирующих везикул. Реагент Липофектин (Lipofectin™) (Bethesda Research Laboratoriеs, Gaithersburg, MD) является эффективным средством, применяемым для доставки полинуклеотидов с высоким анионным зарядом в живые клетки в культуре ткани, которое включает положительно заряженные липосомы, состоящие из положительно заряженного липида DOTMA и нейтрального липида диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE), который выполняет функцию так называемого хелперного липида. Указанные липосомы спонтанно взаимодействуют с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами с образованием комплексов, называемых липоплексами. При использовании избыточного количества положительно заряженных липосом относительно отрицательно заряженных молекул ДНК суммарный заряд образуемых комплексов становится также положительным. Положительно заряженные комплексы, получаемые таким способом, спонтанно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям или поступают в клетки либо по механизму адсорбционного эндоцитоза, либо по механизму, опосредованному слиянием с плазматической мембраной, так, что оба процесса приводят к доставке функционального полинуклеотида внутрь, например клеток в культуре ткани. DOTMA и DOTAP являются хорошими примерами монокатионных липидов [Illis et al., 2001, ibid.].

Было показано, что сами по себе поливалентные катионы (включая полиамины, неорганические соли и комплексы, а также дегидратирующие растворители) облегчают доставку макромолекул в клетки. В частности, поливалентные катионы провоцируют распад олиго- и полианионов (молекул нуклеиновых кислот, аминокислот и т.п.) до компактных структур и облегчают сборку таких полианионов в вирусы, их включение в липосомы, транспорт в клетки и т.п. [Thomas T.J. et al., Biochemistry 38:3821-3830 (1999)]. Самыми маленькими природными поликатионами, которые способны оказывать такое воздействие по компактному преобразованию ДНК, являются полиамины спермидин и спермин. Путем присоединения гидрофобной метки через линкер к таким молекулам может быть получен новый класс векторов трансфекции, поликатионные липополимеры.

Катионные липиды и катионные полимеры вступают в электростатическое взаимодействие с анионными группами ДНК (или любой другой полианионной макромолекулы) с образованием комплексов ДНК-липид (липоплексов) или ДНК-поликатионных комплексов (полиплексов). Образование комплекса сопряжено с высвобождением противоионов липидов или полимеров, что является термодинамической движущей силой для спонтанного образования липоплекса и полиплекса. Катионные липиды могут быть разделены на четыре класса: (i) четвертичная аммониевая соль липидов (например, DOTMA (Lipofectin^TM) и DOTAP) и пары фосфоний/арсоний; (ii) липополиамины; (iii) катионные липиды, содержащие как фрагменты четвертичного аммония, так и полиаминовые фрагменты и (iv) амидиниевая, гуанидиниевая и гетероциклическая соль липидов.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий через карбамоильную связь по меньшей мере одну полиалкиламиновую цепь.

Термин «сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат» в контексте настоящего описания обозначает химическую конъюгацию (связывание) между сфингоидным основанием (что в настоящем контексте описывается также термином «сфингоидный каркас») и по меньшей мере одной полиалкиламиновой цепью. Конъюгирование между сфингоидным основанием и по меньшей мере одной полиалкиламиновой цепью осуществляется через карбамоильную связь, что ниже будет описано более подробно.

Термин «сфингоидное основание/каркас» в контексте настоящего описания включает длинноцепочечные алифатические амины, содержащие две или три гидроксильных группы, где алифатическая цепь может быть насыщенной или ненасыщенной. Другим примером ненасыщенного сфингоидного основания является основание, содержащее характерную транс-двойную связь в положении 4.

Термин «модуляция» в контексте настоящего описания обозначает любое измеряемое регуляторное или биохимическое воздействие, оказываемое биологически активным материалом, доставляемым с помощью конъюгата, на иммунный ответ субъекта, включая клеточный ответ и/или гуморальный ответ. Модуляция включает ингибирование или, наоборот, стимуляцию или усиление одного или обоих типов ответов при введении указанному субъекту сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в сочетании с биологически активными веществами. Термин «модуляция» предпочтительно используется применительно к стимуляции или усилению в два или более раз относительно уровня, выявляемого при введении биологически активной молекулы без конъюгата. Настоящее изобретение также относится к модуляции иммунного ответа в тех случаях, когда вводимый без конъюгата биологически активный материал является по существу неэффективным в плане генерирования такого ответа.

Кроме того, термин «модуляция» относится к ингибированию или супрессии иммунного ответа у субъекта, например, при лечении аутоиммунных заболеваний, а также при лечении аллергии.

Таким образом, термин «биологически активная молекула» в контексте настоящего описания обозначает любое вещество, которое при введении в сочетании со сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом оказывает воздействие на иммунную систему субъекта. Биологически активный материал предпочтительно является антигенным белком, антигенным пептидом, антигенным полипептидом или антигенным углеводом.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему введение указанному субъекту сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активной молекулой, где данный сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий присоединенную через карбамоильную связь по меньшей мере одну полиалкиламиновую цепь.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта, где указанная композиция содержит (i) по меньшей мере один сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и (ii) по меньшей мере одну биологически активную молекулу, ассоциированную с данным конъюгатом.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к комплексу, включающему (i) сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и (ii) биологически активный материал, способный модулировать иммунный ответ у субъекта.

И, наконец, настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата, определенного выше, в качестве средства, удерживающего биологически активные молекулы (например, антигенные молекулы). В данном контексте сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может представлять собой часть набора, используемого для захвата/удерживания биологически активных молекул, предпочтительно антигенных молекул и/или иммуностимуляторов и/или иммуносупрессоров, где данный набор включает, в дополнение к указанному конъюгату, инструкцию по его использованию для захвата/удерживания биологически активных молекул. Конъюгат в данном наборе может иметь форму сухого продукта, и в этом случае набор может также включать подходящую жидкость, с которой конъюгат смешивают перед использованием с получением суспензии или эмульсии, или раствора, или данный конъюгат уже может иметь жидкую форму (суспензии, эмульсии, раствора и т.п.). Данный набор может иметь множество применений. Так, например, набор может использоваться для исследования функций различных иммуномодулирующих молекул с точки зрения модуляции иммунных ответов, в процессах выделения биологически активных молекул и их идентификации. Специалистам в данной области известно, для каких целей может применяться такой удерживающее средство, в частности в исследовательских целях.

Термин «удерживающее средство» в контексте настоящего описания относится к конъюгату, способному к ассоциации с биологически активными молекулами, где последние несут отрицательный заряд, представляют собой отрицательный диполь или имеют локальный отрицательный заряд (площадь на молекуле, несущей суммарный отрицательный заряд) за счет поликатионной структуры конъюгата. Процесс захвата/удерживания per se включает электростатическое взаимодействие между захватываемой/удерживаемой молекулой, которая имеет такой отрицательный заряд, представляет собой отрицательный диполь или несет локальный отрицательный заряд, и положительно заряженным конъюгатом по настоящему изобретению.

Конъюгат по настоящему изобретению может также использоваться в качестве носителя для доставки путем переноса биологически активных молекул, осуществляемого по механизму захвата, в сайт-мишень и в целевую клетку.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для пояснения настоящего изобретения и для более наглядной демонстрации путей его практической реализации ниже описываются некоторые варианты его осуществлени с помощью неограничивающих примеров и со ссылкой на сопровождающие описание чертежи.

На фиг. 1А-1D показаны некоторые возможные химические структуры, «линейные», «разветвленные» или «циклические» липидоподобные катионные соединения (LLC), которые охватываются общим определением сфингоид-полиалкиламинового конъюгата (I), где фиг.1А представляет иллюстрацию каркаса (церамида), присоединенного к одной полиалкиламиновой цепи, на фиг.1В и фиг.1С показан тот же самый каркас, присоединенный к двум полиалкиламиновым цепям, а на фиг.1D снова показан тот же самый каркас, однако в данном случае единственная полиалкиламиновая цепь присоединяется посредством двух гидроксильных фрагментов с образованием циклического полиалкиламинового конъюгата.

На фиг. 2A-2F показаны биологическое распределение и картина фармакокинетики различных флуоресцентно меченых липидных композиций в желудочно-кишечном тракте - ■-, в легких - ♦- или селезенке ---, не выявляемых -♦-; на фиг.2А показано распределение пустых структур DMPC:DMPG (молярное соотношение 9:1); на фиг.2В показано распределение DMPC:DMPG:HN; на фиг.2С показано распределение пустых структур DOTAP:холестерин; на фиг.2D показано распределение структур DOTAP:холестерин:HN; на фиг.2E показано распределение пустых структур CCS:холестерин и, наконец, на фиг.2F показано распределение структур CCS-холестерин:HN.

На фиг. 3A-3D показано биологическое распределение различных композиций липидных структур, содержащих ¹²⁵I-HN в желудочно-кишечном тракте - ■-, в легких - ♦- или селезенке -◊-, не выявляемых -х-, и, в частности, на фиг.3А проиллюстрировано биологическое распределение свободного ¹²⁵I-HN; на фиг.3В показана содержащая ¹²⁵I-HN липидная структура, которая состоит из DOTAP:холестерина; на фиг.3С показана содержащая ¹²⁵I-HN липидная структура, которая состоит из DMPC:DMPG, и на фиг.3D показана содержащая ¹²⁵I-HN липидная структура, которая состоит из CCS:холестерина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламиновых конъюгатов в качестве удерживающих средств для переноса биологически активных молекул, которые обладают эффективностью в модуляции иммунного ответа у субъекта.

Сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты являются липидоподобными катионными соединениями (LLC), которые могут быть синтезированы указанным ниже способом. Длинные цепочки с N-замещенными основаниями, в частности N-замещенными сфингоидами, или сфингоидные основания связываются с различными полиалкиламинами или их производными с образованием полиалкиламин-сфингоидной структуры, которая может использоваться в качестве таковой или может быть далее алкилирована.

Протонирование при соответствующем pH или алкилирование образованной полиалкиламин-сфингоидной структуры придает липидоподобным соединениям желательный положительный заряд, нужный для взаимодействия с биологически активными молекулами, доставляемыми в целевую клетку, и с целевыми клетками. Сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты эффективно ассоциируют с биологически активными молекулами благодаря электростатическим взаимодействиям между биологически активными молекулами, имеющими анионный характер, и полиалкиламиновыми фрагментами конъюгата с образованием комплексов (липоплексов).

Альтернативно, сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты могут формировать структуры, включающие биологически активные молекулы.

Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может иметь вид отдельных липидоподобных молекул или может представлять собой объединенную структуру. Один пример подходящей объединенной структуры включает образование мицелл везикул и, в частности, липосом. Другие примеры таких объединенных структур включают образование мицелл, инвертных фаз, фаз из кубических форм и т.п. Очевидно, что сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может находиться в объединенной везикулярной/мицеллярной форме или в составе другого рода объединенных структур.

«Объединенная липидная структура» в контексте настоящего описания обозначает организованное образование липидных молекул, образующих, в частности, мицеллы и липосомы. Объединенные липидные структуры предпочтительно представляют собой стабильные объединенные липидные структуры. «Стабильная объединенная липидная структура» в контексте настоящего описания обозначает такую объединенную структуру, которая является химически и физически стабильной в условиях хранения (4°С, в физиологической среде) по меньшей мере в течение одного месяца.

В том случае, когда данные объединенные структуры имеют вид везикул (например, липосом), биологически активные молекулы могут быть инкапсулированы внутри таких везикул, частично в липидный бислой, или могут быть адсорбированы на поверхности везикул (или может иметь место любое сочетание указанных трех вариантов). Когда указанные объединенные структуры представляют собой мицеллы, биологически активные молекулы могут быть включены в амфифильные соединения, образующие мицеллы, и/или могут быть ассоциированы с ними в стабильном режиме за счет электростатического взаимодействия.

Таким образом, в контексте настоящего описания термины «инкапсулированные в», «содержащиеся в», «включенные в» или «ассоциированные с» указывают на физическое соединение, имеющееся между конъюгатом и биологически активной молекулой. Физическое соединение может представлять собой включение данной молекулы или ее захват в объединенные структуры (например, в везикулы, мицеллы или другие структуры), образованные из конъюгата; нековалентное связывание биологической молекулы с поверхностью таких объединенных структур или погружение биологической молекулы в пространство между сфингоид-полиалкиламиновыми конъюгатами, образующими такие объединенные структуры. Следует отметить, что в связи с положительным зарядом или положительным диполем сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в физиологических условиях предпочтительная ассоциация между конъюгатом и биологически активным материалом осуществляется за счет электростатического, дипольного или кислотно-щелочного взаимодействия.

Несмотря на вышесказанное, настоящее изобретение не ограничивается конкретным типом ассоциации, возникающей между сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом и биологически активной молекулой. Таким образом, ассоциация означает любое взаимодействие между конъюгатом или образованной на его основе объединенной структурой и биологически активным материалом, которое способно привести к достижению желательного терапевтического эффекта.

Ассоциация биологически активных молекул и конъюгата может быть достигнута с использованием любого способа, известного в данной области. Такой способ включает, без ограничения, пост- или совместную лиофилизацию конъюгата с биологически активной молекулой или простое смешивание предварительного сформированного сфингоид-полиалкиламинового конъюгата с биологической молекулой. Способ совместной лиофилизации описан, в частности, в патентах США №№ 6156337 и 6066331, а способы пост-инкапсулирования описаны, например, в WO 03/000227, и все указанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Таким образом, настоящее изобретение в соответствии с первым из его аспектов относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта, где указанный сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий присоединенные через карбамоильную связь по меньшей мере одну, и предпочтительно одну или две полиалкиламиновых цепи.

Как указывалось выше, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает связь сфингоидного каркаса по меньшей мере с одной полиалкиламиновой цепью, где указанная связь осуществлена посредством соответствующих карбамоильных связей. Более предпочтительно, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат имеет общую формулу (I):

где R₁ означает водород, разветвленный или линейный алкил, арил, алкиламин или группу -C(O)R₅;

R₂ и R₅ независимо друг от друга означают разветвленные или линейные C₁₀-C₂₄алкильные, алкенильные или полиенильные группы;

R₃ и R₄ независимо друг от друга означают группу -C(O)-NR₆R₇, где R₆ и R₇, которые могут быть такими же как R₃ и R₄ или отличаться от них, и независимо друг от друга означают водород или насыщенный, или ненасыщенный, разветвленный или линейный полиалкиламин, причем одна или несколько аминных единиц в указанном полиалкиламине может представлять собой четвертичный аммоний; или

R₃ означает водород; или

R₃ и R₄ формируют вместе с атомами кислорода, к которым они присоединены, гетероциклическое кольцо, включающее -C(O)-NR₉-[R₈-NR₉]_m-C(O)-, R₈ означает насыщенный или ненасыщенный C₁-C₄алкил и R₉ означает водород или полиалкиламин формулы -[R₈-NR₉]_n-, где указанные R₉ или каждая алкиламиновая единица R₈NR₉ может быть той же самой или различаться в указанном полиалкиламине; и

n и m независимо являются целым числом от 1 до 10, предпочтительно от 3 до 6;

W означает группу, выбранную из -CH=CH-, CH₂-CH(OH)- или -CH₂-CH₂-.

Неограничивающие примеры сфингоидов или сфингоидных оснований, которые могут использоваться в более частном варианте осуществления настоящего изобретения, включают сфингозины, дигидросфингозины, фитосфингозины, дегидрофитосфингозин и их производные. Неограничивающие примеры таких производных включают ацильные производные, такие как церамид (N-ацилсфингозин), дигидроцерамиды, фитоцерамиды и дигидрофитоцерамиды, соответственно, а также церамины (N-алкилсфингозин) и соответствующие производные (например, дигидроцерамин, фитоцерамин и т.п.). Соответствующим образом N-замещенные сфингоиды или сфингоидные основания содержат две гидроксильные группы, которые активируются и впоследствии вступают в реакцию с полиалкиламином с образованием полиалкиламин-сфингоидной структуры. Неограничивающие примеры активирующих агентов включают N,N'-дисукцинимидилкарбонат, ди- или три-фосгеновые или имидазольные производные. Взаимодействие указанных активирующих агентов со сфингоидами или сфингоидными основаниями приводит к образованию сукцинимидилоксикарбонил-, хлорформиат- или имидазол-карбамата, соответственно по одному или обоим гидроксилам. Реакция активирования сфингоидов полиалкиламинами может приводить к образованию разветвленных, линейных (неразветвленных) или циклических конъюгатов, как показано на фиг.1.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения сфингоидный каркас представляет собой церамид, присоединенный к одной (фиг.1A) или двум (фиг.1B или 1C) полиалкиламиновым цепям, или указанное присоединение происходит вовлечением двух гидроксильных фрагментов, приводя к образованию циклического полиалкиламинового фрагмента (фиг.1D).

Сформированные сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты могут дальше вступать в реакцию с метилирующими агентами, образуя четвертичные амины. Полученные соединения несут положительный заряд разной величины, определяемый соотношением между четвертичными, первичными и/или вторичными аминами в составе сформированных конъюгатов. Как таковой, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат существует в виде кватернизованной азотной соли, включающей, без ограничения перечисленными, четвертичный хлорид аммония, четвертичный иодид аммония, четвертичный фторид аммония, четвертичный бромид аммония, четвертичный оксианион аммония и их сочетание.

Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат предпочтительно используют в сочетании с биологически активной молекулой. Биологически активный материал представляет собой любой молекулу, которая при введении вместе со сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом оказывает воздействие на иммунную систему субъекта, и в соответствии с одним из вариантов изобретения это может быть стимулирующее или усиливающее воздействие. Предпочтительно, данное воздействие представляет собой в два или более раза усиленное воздействие относительно воздействия биологически активной молекулы при введении ее субъекту без данного конъюгата.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения биологически активный материал представляет собой белок, полипептид, пептид или углевод. Конкретно, биологически активная молекула может представлять собой иммуномодулятор, включающий антигенный белок или антигенный пептид, иммуностимуляторы и/или иммуносупрессоры. Антигенные белки и пептиды, иммуностимуляторы и иммуносупрессоры хорошо известны в данной области. Предпочтительно, биологически активный белок, пептид или углевод имеет при физиологическом значении pH суммарный отрицательный дипольный момент или суммарный отрицательный заряд, или содержит по меньшей мере один участок, характеризующийся суммарным отрицательным зарядом.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения биологически активный материал представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, такую как олигодезоксинуклеотиды (ОДН).

Предпочтительное массовое соотношение между сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом и биологически активным материалом составляет от 1000:1 до 1:1.

Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может быть также объединен с другими активными веществами, в отношении которых известно, что они могут использоваться в сочетании с антигенными молекулами. Такие вещества включают, например, иммуностимулирующие средства (известные также под названием «иммуностимулятор» или «адъювант»). Такие средства включают любое вещество, которое при добавлении к вакцине повышает иммунный ответ, так что при использовании меньшего количества вакцины можно добиться более выраженного ответа. Иммуностимулирующее средство может вводиться вместе с конъюгатом/биологически активным материалом или в течение определенного интервала времени (например, от нескольких часов или дней до или после введения конъюгата/биологически активной молекулы).

Предпочтительные иммуностимулирующие средства включают, без ограничения перечисленными, цитокины, такие как интерлейкины (IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18), интерфероны (IFN альфа, бета, гамма), олигодезоксинуклеотиды (ОДН), токсины (например, холерный токсин (СТ), стафилококковый энтеротоксин В (SEB)), термолабильный энтеротоксин E. coli (HLT), а также любые другие известные в данной области адъюванты, используемые для усиления или стимуляции иммунного ответа на антигенную молекулу.

Объединенные структуры могут включать сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат (неметилированный или метилированный) в качестве единственного липидоподобного ингредиента или могут быть объединены с другими хелперными липидными веществами. Такие хелперные липидные вещества могут включать некатионные липиды типа DOPE, DOPC, DMPC, холестерина, олеиновой кислоты или других веществ, в разных молярных соотношениях относительно липидоподобного соединения. Холестерин представляет собой одно такое предпочтительное для применения in vivo дополнительное вещество, тогда как DOPE может быть предпочтительным хелперным липидом для случаев применения in vitro. В данном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения коэффициент молярного отношения холестерина к катионному липиду находится в диапазоне от 0,01 до 1,0 и предпочтительно от 0,1 до 0,4.

В объединенную структуру могут быть также включены энхансеры (известные в данной области, такие как СaCl₂) и растворимые полиалкиламины.

Другие компоненты, которые могут быть включены в липидную структуру и которые используются в подобного рода структурах, включают стерические стабилизаторы. Один пример таких часто используемых стерических стабилизаторов включает представителей семейства липополимеров, например липиды, дериватизированные полиэтиленгликолем (ПЭГ-липидный конъюгат). Известно, что указанное семейство соединений, в частности, повышает (увеличивает) время циркуляции липидов в крови.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения образованные липосомы могут иметь вид несортированных гетерогенных и гетерослойных везикул (UHV) с диаметром примерно от 50 до 5000 нм. Далее полученные UHV могут быть отсортированы и преобразованы путем дальнейшего процессинга в крупные (более гомогенные) однослойные везикулы (LUV) с диаметром примерно 50-100 нм. Структура и размеры везикул, такие как их форма и размер, могут оказывать выраженное влияние на их эффективность как везикул, осуществляющих доставку активных биологических структур к мишени, то есть являются параметрами, определяющими их способность осуществлять доставку.

Предпочтительная группа полиалкиламиновых цепей, формирующих часть сфингоид-полиалкиламинового конъюгата, была структурно определена выше применительно к формуле (I). В соответствии с данным вариантом осуществления изобретения полиалкиламиновые цепи, которые могут быть одинаковыми или разными в конъюгате формулы (I), выбирают из спермина, спермидина, полиалкиламинового аналога или их сочетания. Термин «полиалкиламиновый аналог» используется для обозначения любой полиалкиламиновой цепи и в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения обозначает полиалкиламин, включающий от 1 до 10 аминогрупп, предпочтительно от 3 до 6 аминогрупп и более предпочтительно 3 или 4 аминогруппы. Алкиламины в составе полиалкиламиновой цепи могут быть одинаковыми или разными и каждый из них может представлять собой первичный, вторичный, третичный или четвертичный амин.

Алкильные фрагменты могут быть одинаковыми или разными в полиалкиламиновой цепи и каждый из них представляет предпочтительно С₁-С₆алифатическую повторяющуюся единицу. Некоторые неограничивающие примеры полиалкиламинов включают спермидин, N-(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамин, 3,3'-иминобиспропиламин, спермин и бис(этильные) производные спермина, полиэтиленимин.

Наиболее предпочтительным сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом по настоящему изобретению является N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS). Данный конъюгат включает церамид, присоединенный через карбамоильную связь к спермину.

Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат по настоящему изобретению предпочтительно используется для приготовления вакцины.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и предпочтительно ССS используется для приготовления противогриппозной вакцины. В данном варианте биологически активный материал получают из вируса гриппа или из биологически активного аналога молекулы, полученного из вируса гриппа. Такие аналоги включают любое вещество, которое входит в состав антигенного фрагмента, полученного из вируса гриппа, и которое вызывает иммунный ответ.

Конкретным антигенным материалом, полученным из вируса гриппа, являются молекулы гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA), сочетание которых обозначается как NH.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, где данный способ включает лечение указанного субъекта сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом в сочетании с биологически активным материалом.

Комбинированное лечение включает введение сфингоид-полиалкиламинового конъюгата и биологически активного материала либо вместе, либо в течение заданного периода времени, такого как несколько часов или несколько дней (необязательно в сочетании с иммуностимулирующим средством). Однако в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, конъюгат и биологически активный материал смешивают друг с другом перед введением субъекту.

Введение сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активным материалом относится к другому аспекту настоящего изобретения. Соответственно, предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит физиологически приемлемый носитель и эффективное количество сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активным материалом. Фармацевтическая композиция необязательно содержит иммуностимулирующее средство.

При введении сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в сочетании с биологически активным материалом его доза может быть подобрана в соответствии с результатами его практического применения в медицине с учетом клинического состояния индивидуума, места и способа введения, режима введения, возраста пациента, его пола, веса тела и других существенных факторов, известных в медицинской практике.

Термин «эффективное количество» в контексте настоящего описания обозначает то количество, которое является эффективным для модуляции (усиления или стимуляции, в соответствии с данным выше определением) иммунного ответа у субъекта относительно эффекта, достигаемого в том случае, когда биологически активный материал вводят субъекту без сфингоид-полиалкиламинового конъюгата. Предпочтительно данное количество эффективно для иммунизации субъекта применительно к определенному заболеванию или расстройству.

Независимо от вышесказанного, данное количество может быть эффективным для достижения супрессии или ингибирования иммунного ответа, например, с целью лечения аллергии или аутоиммунных реакций.

Композиция по настоящему изобретению, содержащая сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат в сочетании с биологически активным материалом, может вводиться различными способами. Неограничивающие примеры способов введения включают пероральный, подкожный (п/к), парентеральный, включая внутривенный (в/в), внутриартериальный (в/а), внутримышечный (в/м), внутрибрюшинный (в/б), интраректальный (и/р) и интраназальный (и/н) пути введения, а также методы инфузии для введения в область глаза, интраокулярное введение. Предпочтительные способы введения включают интраназальное или внутримышечное введение.

Физиологически приемлемый носитель по настоящему изобретению в основном относится к инертным, нетоксичным, твердым или жидким веществам, предпочтительно не вступающим во взаимодействие с биологически активным материалом или с конъюгатом и который требуется для эфф