Терапевтическое средство для заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям

Терапевтическое средство для заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается лекарственного средства для "заболеваний родственных детским хроническим артритным заболеваниям", включающего в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6). Заболевания, родственные детским хроническим артритным заболеваниям, включают собственно детские хронические артритные заболевания, болезнь Стилла и им подобные.

Уровень техники

Цитокин IL-6 называют стимулирующим В-клетки фактором-2 (BSF2) или β-интерфероном. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, ответственный за активацию лимфоидных В-клеток (Hirano Т. et al., Nature (1986) 324, 73-76). После этого было обнаружено, что он является многофункциональным цитокином, влияющим на функции различных клеток (Akira S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Сообщалось, что IL-6 индуцирует созревание лимфоидных Т-клеток (Lotz M. et al., J. Ехр. Med. (1988) 167, 1253-1258).

IL-6 осуществляет свою биологическую активность посредством двух белков на поверхности клетки. Одним из них является лигандсвязывающий белок, рецептор IL-6, молекулярный вес которого составляет около 80 кД, с которым связывается IL-6 (Taga Т. et al., J. Ехр. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki К. et al., Science (1987) 241, 825-828). Рецептор IL-6 существует не только в мембрано-связанной форме, которая пронизывает клеточную мембрану и экспрессируется на ней, но также в виде растворимого рецептора IL-6, который в основном состоит из внеклеточной части.

Другим белком является не связывающий лиганды мембранный белок gp130 с молекулярным весом около 130 кД, принимающий участие в передаче сигнала. IL-6 и рецептор IL-6 образуют комплекс IL-6/ рецептор IL-6, с которым связывается gp130, и таким образом биологическая активность IL-6 передается внутрь клетки (Taga et al., Cell (1983)58, 573-581).

Антагонисты IL-6 - это вещества, ингибирующие передачу биологических активностей IL-6. К настоящему времени известны антитела к IL-6, антитела к рецептору IL-6, антитела к gp130, перестроенный IL-6, частичные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 и т.п.

Антитела к рецептору IL-6 описаны в ряде обзоров (Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146; Huang Y.W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630; International Patent Application WO 95-09873; French Patent Application FR 2694767; United States Patent US 5216128). Гуманизированное антитело РМ-1 было получено путем введения участка комплиментарности (CDR) мышиного антитела РМ-1 (одного из антител к рецептору IL-6, Hirata et al., J. Immunology (1989), 143, 2900-2906) в антитело человека (International Patent Application WO 92-19759).

Детские хронические артритные заболевания в основном представлены хроническими артритами, возникающими до 16-летнего возраста, которые являются наиболее распространенными заболеваниями из коллагеновых заболеваний, возникающих у детей. В отличие от ревматоидного артрита (RA) у взрослых, они не считаются однородным заболеванием и представлены несколькими типами, поэтому их обычно рассматривают, как заболевания, отличающиеся от ревматоидного артрита у взрослых.

В отношении детских хронических артритных заболеваний в Японии применяется название "юношеский ревматоидный артрит" в соответствии с диагностическими критериями Соединенных Штатов, тогда как в Европе в основном применяют термин "юношеский хронический артрит". Недавно стали применять и такие термины, как идиопатический хронический артрит (ICA) и юношеский идиопатический артрит (ЛА).

Типы детских хронических артритных заболеваний классифицировали различным образом. Согласно Американской коллегии ревматологии (ACR), они, то есть артритные заболевания, возникающие у детей до 16 лет и продолжающиеся в течение 6 недель и больше, подразделяются на 3 типа: 1) системные, 2) многосуставные, 3) малосуставные (JRA Criteria Subcommittee of the Diagnostic and Therapeutic Committee of the American Rheumatism Association, Arthritis Rheum 20 (Suppl): 195, 1977). В Европе Европейская лига против ревматизма (EULAR) составила классификацию, которая хотя и отличается от вышеприведенной классификации ARA тем, что продолжительность артрита составляет 3 месяца и более, и тем, что из нее исключены артриты, вызванные псориазом, анкилозирующим спондилитом и др., однако она признает те же 3 типа заболеваний (Bulletin 4, Nomenclature and Classification of Arthritis in Children. Basel, National Zeitung AG, 1977).

Недавно была предпринята попытка пересмотра классификации и Международная лига Ассоциаций по ревматологии (ILAR) предложила в 1995 г. проект классификации детских идиопатических артритных заболеваний (Fink CW, Proposal for the development of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood. J. Rheumatol, 22: 1566 (1995)), а в 1997 г. этот вариант был выдвинут в качестве проекта ILAR (Southwood TR, Classifying childhood arthritis, Ann. Rheum. Dis. 56: 79 (1997)). Эта классификация предусматривает деление на 1) системный артрит, 2) RF-положительный полиартрит, 3) RF-отрицательный полиартрит, 4) олигоартрит, 5) расширенный олигоартрит, 6) артрит, связанный с энтезитом, 7) псориазный артрит и 8) другие.

Кроме того, авторы настоящего изобретения предлагали способ классификации детских хронических артритных заболеваний на:

1) первичные детские хронические артритные заболевания, в том числе:

(1) синдром SPRASH (острые приступы лихорадки, перикардит, сыпь, артрит, спленомегалия, гепатомегалия). Начинается с повышения температуры при расслаблении и появления высыпаний, наблюдается серозит и гепатомегалия с одновременным или отсроченным возникновением артрита, хотя иногда артрит и не наблюдается;

(2) идиопатические детские хронические артритные заболевания. Отсутствует основное заболевание, главная патология - артрит;

a) положительные на ревматоидный фактор (RF-положительный тип)

b) положительные на антиядерные антитела (ANA-положительный тип)

c) RF/ANA-отрицательный тип.

2) вторичные детские хронические артритные заболевания. Артрит может сопутствовать первичным наследственным или ненаследственным заболеваниям (Shunpei Yokota, "Advances in recent therapeutic methods for chronic arthritides diseases of childhood", Rheumatism, 39:860 (1999).

Сообщалось, что в детских хронических артритных заболеваниях играют роль различные цитокины. В частности, полагают, что с этим заболеванием связаны нарушения баланса воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α и противовоспалительных цитокинов IL-1ra (антагонист рецептора IL-1), IL-10, IL-13, sTNFR (растворимый рецептор TNF).

Для лечения детских хронических артритных заболеваний применялись нестероидные противовоспалительные средства, кортикостероиды, противоревматические средства (соединения золота и др.), иммунодепрессанты, метотрексат (МТХ и др.). Однако, поскольку лечебные эффекты отличаются от пациента к пациенту, следует ожидать разработки более эффективных терапевтических схем.

Болезнь Стилла, впервые описанная британским педиатром Стиллом в 1897 г., имеет клиническую картину, четко отличающуюся от ревматоидного артрита у взрослых, и представляет собой заболевание, встречающееся и у детей, и у взрослых (особенно у подростков), при этом основные симптомы - лихорадка, эритема, артрит, серозит и т.п. Возникающий у взрослых тип называют взрослой формой болезни Стилла. При болезни Стилла анализ на ревматоидный фактор обычно отрицательный.

У детей болезнь Стилла является другим наименованием юношеского ревматоидного артрита системного типа (он же юношеский ревматоидный артрит (JRA), юношеский хронический артрит (JCA), юношеский идиопатический артрит (JIА)), который представляет собой хронический артрит, возникающий у детей до 16 лет. В качестве причин болезни Стилла называли такие экологические факторы, как вирусы, такие факторы организма, как антигены HLA, и иммунологические расстройства, однако этиология все еще остается неясной.

Болезнь Стилла у взрослых и болезнь Стилла у детей считаются почти одинаковыми заболеваниями, хотя и наблюдаются небольшие отличия в клинической картине, наряду с возрастом возникновения болезни. Болезнь Стилла у детей означает JRA системного типа, как описано выше. Однако JRA и ревматоидный артрит (RA) у взрослых отличаются клинически по многим признакам и рассматриваются как разные заболевания, поэтому болезнь Стилла у взрослых часто рассматривается как особое независимое заболевание среди ревматических болезней.

Диагностические критерии болезни Стилла у взрослых известны в изложении Yamaguchi (Journal of Rheumatology 19(3): 424-30, 1992), Reginato (Seminars in Arthritis & Rheumatism 17(1): 39-57, 1987), Cush (Rheumatology Grand Rounds, University of Pittsburgh Medical Center; Jan. 30, 1984), Goldman (Southern Medical Journal 73: 555-563, 1980) и др.

Что касается взаимоотношений между болезнью Стилла и цитокинами, то были сообщения о связи с такими цитокинами, как IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-γ, a такие воспалительные цитокины, как IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, считаются вовлеченными в патологию болезни Стилла.

В отношении IL-6 было сообщение de Benedetti et аl. о том, что уровень IL-6 повышается при болезни Стилла у детей (Arthritis Rheum. 34: 1158, 1991), а в сыворотке детей, страдающих болезнью Стилла, обнаружено высокое содержание комплекса IL-6/ растворимый рецептор IL-6 (sIL-6R) и наблюдается корреляция между уровнем этого комплекса и уровнем С-реактивного белка (CRP) (J. Clin. Invest. 93: 2114, 1994). Кроме того, Rooney et аl. сообщали, что уровни IL-6 и TNF-α в плазме повышаются у детей, страдающих болезнью Стилла (Br. J. Rheumatol. 34: 454, 1995).

В качестве способа лечения болезни Стилла применялись нестероидные противовоспалительные средства, кортикостероиды, противоревматические средства, (соединения золота и др.), иммунодепрессанты, композиции γ-глобулина, метотрексат (МТХ и др.). Однако, поскольку лечебные эффекты отличаются от пациента к пациенту, следует продолжить разработку более эффективных терапевтических схем.

Сущность изобретения

Итак, настоящее изобретение предусматривает новое терапевтическое средство для заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям, причем данное средство принадлежит к другому типу, чем традиционные терапевтические средства для заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям. В соответствии с настоящим изобретением заболевания, родственные детским хроническим артритным заболеваниям, включают собственно детские хронические артритные заболевания и болезнь Стилла.

После интенсивного и всестороннего исследования этих проблем авторы настоящего изобретения обнаружили, что антагонист интерлейкина-6 (IL-6) обладает лечебным эффектом при заболеваниях, родственных детским хроническим артритным заболеваниям, и совершили настоящее изобретение.

Итак, настоящее изобретение предусматривает терапевтическое средство для заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям, включающее антагонист интерлейкина-6 (IL-6) в качестве активного ингредиента.

В частности, настоящее изобретение предусматривает терапевтическое средство для детских хронических артритных заболеваний, включающее антагонист интерлейкина-6 (IL-6) в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение также предусматривает терапевтическое средство для болезни Стилла, включающее антагонист интерлейкина-6 (IL-6) в качестве активного ингредиента.

Раскрытие сущности изобретения

Вышеупомянутый антагонист IL-6 предпочтительно представляет собой антитело к рецептору IL-6, предпочтительно моноклональное антитело к рецептору IL-6 человека или моноклональное антитело к рецептору IL-6 мыши. В качестве примера моноклонального антитела к рецептору IL-6 человека можно привести антитело РМ-1, а в качестве моноклонального антитела к рецептору IL-6 мыши можно привести антитело MR 16-1.

Указанное антитело предпочтительно представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, например гуманизированное антитело РМ-1.

К детским хроническим артритным заболеваниям, являющимся предметом лечения с помощью терапевтического средства настоящего изобретения, относятся все заболевания в вышеприведенных классификациях ARA, EULAR и ILAR, а также в классификации авторов настоящего изобретения. С дальнейшим прогрессом в методах серологической диагностики и прогрессом в методах терапии классификация типов детских хронических артритных заболеваний сейчас подвергается пересмотру во всем мире, можно сказать, она находится в состоянии неопределенности. Предпочтительными предметами лечения с помощью терапевтического средства настоящего изобретения являются: по классификации ARA - системные, многосуставные и малосуставные; по классификации EULAR - системные, многосуставные и олигосуставные; по классификации ILAR - системные, многосуставные (RF-положительные), многосуставные (RF-отрицательные), олигоартрит и расширенный олигоартрит; по классификации авторов настоящего изобретения - первичные детские хронические артритные заболевания (синдром SPRASH, идиопатические детские хронические артритные заболевания - а) положительные на ревматоидный фактор (RF-положительный тип), b) положительные на антиядерные антитела (ANA-положительный тип), с) RF/ANA-отрицательный тип); а наиболее предпочтительными предметами лечения являются: по классификации ARA - системные и многосуставные; по классификации EULAR - системные и многосуставные; по классификации ILAR - системные, многосуставные (RF-положительные), многосуставные (RF-отрИцательные) и расширенный олигоартрит; по классификации авторов настоящего изобретения - первичные детские хронические артритные заболевания (синдром SPRASH, идиопатические детские хронические артритные заболевания - а) RF-положительный тип, b) ANA-положительный тип). Еще более предпочтительными предметами лечения являются: по классификации ARA - системные и многосуставные; по классификации EULAR - системные и многосуставные; по классификации ILAR - системные, многосуставные (RF-положительные) и расширенный олигоартрит; а по классификации авторов настоящего изобретения - первичные детские хронические артритные заболевания (синдром SPRASH, идиопатические детские хронические артритные заболевания - а) RF-положительный тип).

Антагонисты IL-6 для настоящего изобретения могут быть любого происхождения, любого типа и любого вида, если только они обладают терапевтическим эффектом на заболевания, родственные детским хроническим артритным заболеваниям.

Антагонисты IL-6 - это вещества, которые блокируют передачу сигнала от IL-6 и ингибируют биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 - это вещества, которые предпочтительно обладают ингибирующим действием на связывание самого IL-6, связывание с рецептором IL-6 или с gp130. В качестве примера антагонистов IL-6 можно привести антитела к IL-6, антитела к рецептору IL-6, антитела к gp130, перестроенный IL-6, растворимый перестроенный рецептор IL-6, частичные пептиды IL-6 или рецептора IL-6, а также низкомолекулярные вещества, обладающие сходной активностью.

Антитела к IL-6 для настоящего изобретения можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител, используя один из известных методов. В качестве антител к IL-6 для настоящего изобретения предпочтительны моноклональные антитела, особенно происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, полученные в гибридоме, и антитела, полученные методами генной инженерии в организме хозяина, трансформированного экспрессионным вектором, содержащим ген антитела. Такие антитела, посредством связывания IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и тем самым блокируют распространение биологической активности IL-6 в клетке.

Примеры таких антител включают антитело МН166 (Matsuda et al., Eur. J. Immunology (1998) 18, 951-956), или антитело SK2 (Sato et al., The 21st General Meeting of the Japanese Society for Immunology, Gakujutu Kiroku (1991) 21, 166) и др.

Гибридому, продуцирующую антитела к IL-6, по существу можно создать одним из известных методов, как описано ниже. Так, IL-6 используют в качестве сенситизирующего антигена для проведения иммунизации стандартным методом иммунизации, а полученные при этом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками стандартным методом слияния клеток, после чего скринируют клетки, продуцирующие моноклональное антитело, стандартным методом скринирования.

В частности, антитела к IL-6 можно получить следующим образом. Например, IL-6 человека, используемый в качестве сенситизирующего антигена для получения антител, можно получить с помощью гена или аминокислотной последовательности IL-6, которые описаны в Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541; Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

После введения последовательности гена IL-6 в известный экспрессионный вектор и трансформации подходящих клеток хозяина белок IL-6 можно выделить из клеток хозяина или из супернатанта его культуры одним из известных методов и использовать очищенный белок IL-6 в качестве сенситизирующего антигена. В качестве альтернативы можно использовать слитый белок, состоящий из белка IL-6 и еще одного белка, в качестве сенситизирующего антигена.

Антитела к рецептору IL-6 для настоящего изобретения можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител, используя один из известных методов. В качестве антител к рецептору IL-6 для настоящего изобретения предпочтительны моноклональные антитела, особенно происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, полученные в гибридоме, и антитела, полученные методами генной инженерии в организме хозяина, трансформированного экспрессионным вектором, содержащим ген антитела. Такие антитела, посредством связывания IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и тем самым блокируют распространение биологической активности IL-6 в клетке.

Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), антитело РМ-1 (Hirata Y. et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906), антитело AUK12-20, AUK64-7 или AUK146-15 (International Patent Application WO 92-19759) и др. Из них наиболее предпочтительно антитело РМ-1.

Кстати, линия клеток гибридомы, продуцирующей антитело РМ-1, была сдана 12 июля 1988 г. на международное хранение по условиям Будапештского договора в виде РМ-1 в Международный депозитарий патентуемых организмов в Национальном институте промышленной науки и технологии (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japan) как FERM BP-2998. Также и линия клеток гибридомы, продуцирующей антитело MR16-1, была сдана 13 марта 1997 г. на международное хранение по условиям Будапештского договора в виде гибридомы крыса/мышь MR16-1 в Международный депозитарий патентуемых организмов в Национальном институте промышленной науки и технологии (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japan) как FERM BP-5875.

Гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к рецептору IL-6, по существу можно создать одним из известных методов, как описано ниже. Так, рецептор IL-6 используют в качестве сенситизирующего антигена для проведения иммунизации стандартным методом иммунизации, а полученные при этом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками стандартным методом слияния клеток, после чего скринируют клетки, продуцирующие моноклональное антитело, стандартным методом скринирования.

В частности, антитела к рецептору IL-6 можно получить следующим образом. Например, рецептор IL-6 человека, используемый в качестве сенситизирующего антигена для получения антител, можно получить с помощью гена или аминокислотной последовательности рецептора IL-6, описанных в European Patent Application No. EP 325474, а рецептор IL-6 мыши можно получить с помощью гена или аминокислотной последовательности рецептора IL-6, описанных в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-155795.

Существует 2 типа рецепторов IL-6: рецептор IL-6, экспрессируемый на клеточной мембране, и IL-6, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6, Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 в основном состоит из внеклеточной части рецептора IL-6, связанного с клеточной мембраной, и отличается от мембрано-связанного рецептора IL-6 тем, что у него отсутствует трансмембранная часть либо и трансмембранная часть, и внутриклеточная часть. Белок рецептора IL-6 может быть любым из рецепторов IL-6, лишь бы его можно было использовать в качестве сенситизирующего антигена для получения антител к рецептору IL-6 для настоящего изобретения.

После введения гена, кодирующего рецептор IL-6, в известный экспрессионный вектор и трансформации подходящих клеток хозяина требуемый белок рецептора IL-6 можно выделить из клеток хозяина или из супернатанта его культуры одним из известных методов и использовать очищенный при этом белок рецептора IL-6 в качестве сенситизирующего антигена. В качестве альтернативы можно использовать клетки, экспрессирующие белок рецептора IL-6, или слитый белок, состоящий из белка рецептора IL-6 и еще одного белка, в качестве сенситизирующего антигена.

Клетки Escherichia coli (E. coli), содержащие плазмиду pIBIBSF2R, несущую кДНК, кодирующую рецептор IL-6 человека, были сданы 9 января 1989 г. на международное хранение по условиям Будапештского договора в виде НВ 101-pIBIBSF2R в Международный депозитарий патентуемых организмов в Национальном институте промышленной науки и технологии (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japan) как FERM BP-2232.

Антитела к gp130 для настоящего изобретения можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител, используя один из известных методов. В качестве антител к gp130 для настоящего изобретения предпочтительны моноклональные антитела, особенно происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих, включают антитела, полученные в гибридоме, и антитела, полученные методами генной инженерии в организме хозяина, трансформированного экспрессионным вектором, содержащим ген антитела. Такие антитела, посредством связывания gp130, блокируют связывание gp130 с комплексом IL-6/ рецептор IL-6 и тем самым блокируют распространение биологической активности IL-6 в клетке.

Примеры таких антител включают антитело АМ64 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (US 5571513), антитело B-S12 и антитело В-Р8 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 8-291199) и др.

Гибридому, продуцирующую антитела к gp130, по существу можно создать одним из известных методов, как описано ниже. Так, gp130 используют в качестве сенситизирующего антигена для проведения иммунизации стандартным методом иммунизации, а полученные при этом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками стандартным методом слияния клеток, после чего скринируют клетки, продуцирующие моноклональное антитело, стандартным методом скринирования.

В частности, антитела к рецептору IL-6 можно получить следующим образом. Например, gp130, используемый в качестве сенситизирующего антигена для получения антител, можно получить с помощью гена или аминокислотной последовательности gp130, описанных в Европейской патентной заявке №ЕР 411946.

Последовательность гена gp130 можно встроить в известный экспрессионный вектор и использовать этот вектор для трансформации подходящих клеток хозяина. Из клеток хозяина или из супернатанта его культуры можно выделить белок gp130 одним из известных методов и использовать очищенный белок IL-6 в качестве сенситизирующего антигена. В качестве альтернативы можно использовать клетки, экспрессирующие gp130, или слитый белок, состоящий из белка gp130 и еще одного белка, в качестве сенситизирующего антигена.

Предпочтительно млекопитающих для иммунизации сенситизирующим антигеном выбирают с учетом их совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток, и обычно к ним относятся такие грызуны, как мыши, крысы и хомяки, не ограничиваясь только ими.

Иммунизацию животных сенситизирующим антигеном проводят известными методами. Например, общепринятый метод включает внутрибрюшинное или подкожное введение сенситизирующего антигена млекопитающему. В частности, сенситизирующий антиген, разбавленный и суспендированный в надлежащем объеме фосфатного буфера (PBS) или физраствора и т.д., смешивают с соответствующим количеством распространенного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда. После эмульгирования его предпочтительно вводят млекопитающему несколько раз через каждые 4-21 дня. Кроме того, можно использовать подходящий носитель при иммунизации сенситизирующим антигеном.

После иммунизации и подтверждения повышения уровня требуемых антител в сыворотке соответствующим методом выделяют иммунные клетки из животного и подвергают слиянию. В качестве предпочтительного примера иммунных клеток, подвергаемых слиянию, можно отметить клетки селезенки.

Родительские клетки, с которыми проводят слияние вышеуказанных иммунных клеток, - это клетки миеломы млекопитающих, к которым предпочтительно относятся различные известные клеточные линии, такие как P3×63Ag8.653 (Kearney J.F. et al., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3×63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler G. and Milstein С., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), МРС-11 (Margulies D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre G. et al.. Nature (1979) 217, 131-133) и др., которые можно использовать при необходимости.

Слияние между вышеуказанными иммунными клетками и клетками миеломы по сути можно проводить в соответствии с одним из известных методов, например, описанным в Milstein et al. (Kohler G. and Milstein С., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) и др.

В частности, слияние указанных клеток проводят в стандартной питательной среде в присутствии, к примеру, ускорителя слияния клеток. В качестве ускорителя слияния клеток можно использовать, к примеру, полиэтиленгликоль (PEG), вирус Сендай (HVJ) и др., и можно добавить адъювант типа диметилсульфоксида для повышения эффективности слияния.

Предпочтительно соотношение между иммунными клетками и клетками миеломы составляет, к примеру, в 1-10 раз больше иммунных клеток, чем клеток миеломы. Примеры культуральных сред для слияния указанных клеток включают, к примеру, среду RPMI 1640 и культуральную среду MEM, которые пригодны для выращивания указанных клеточных линий миеломы, а также стандартные культуральные среды, применяемые для культивирования клеток этого типа, с добавлением сыворотки, например, эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).

При слиянии клеток заданные количества указанных иммунных клеток и клеток миеломы тщательно смешивают в указанной культуральной среде, в которую добавлен раствор PEG, заранее подогретый примерно до 37°С, например, раствор PEG со средним молекулярным весом от 1000 до 6000, в концентрации от 30 до 60% (вес./об.), и перемешивают для получения требуемых слитых клеток (гибридом). Затем, повторяя поочередно добавление соответствующей культуральной среды и центрифугирование с удалением супернатанта, можно устранить те средства для слияния клеток, которые нежелательны для роста гибридомы.

Гибридому подвергают селекции путем культивирования в стандартной селективной среде, например, культуральной среде HAT (она содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT обычно продолжают в течение времени, достаточного для гибели всех клеток, кроме требуемой гибридомы (то есть не слившихся клеток), обычно от нескольких дней до нескольких недель. Выполняется стандартный метод предельного разведения, при этом проводится скринирование и клонирование гибридом, продуцирующих нужное антитело.

Наряду с получением гибридомы путем иммунизации животного (не человека) антигеном, также возможно сенситизировать лимфоциты человека in vitro с помощью нужного антигенного белка или антиген-экспрессирующих клеток и получить сенситизированные В-лимфоциты, затем провести слияние их с клетками миеломы, например, линии U266, обладающей способностью к постоянному делению, и получить гибридому, продуцирующую нужное антитело человека, обладающее способностью к связыванию с требуемым антигеном или антиген-экспрессирующими клетками (Japanese Post-examined Patent Publication (Kokoku) 1-59878). Кроме того, трансгенное животное с репертуаром генов антител человека можно иммунизировать антигеном или антиген-экспрессирующими клетками и получить нужное антитело человека в соответствии с указанным методом (см. International Patent Applications WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).

Полученные таким образом гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, можно подрастить в стандартной культуральной среде или хранить в течение длительного времени в жидком азоте.

Для того чтобы получить моноклональные антитела из гибридомы, можно применить метод, в котором гибридому культивируют стандартным методом и получают антитела в виде супернатанта, или метод, в котором гибридому имплантируют млекопитающему, совместимому с данной гибридомой, и выращивают в нем, а антитела получают в виде асцитов. Первый метод пригоден для получения антител высокой степени чистоты, тогда как второй подходит для широкомасштабной продукции антител.

Например, из гибридомы, продуцирующей антитело к рецептору IL-6, можно получить полипептид способом, раскрытым в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-139293. Можно воспользоваться способом, в котором гибридому, продуцирующую антитело РМ-1, которая была сдана 12 июля 1988 г. на международное хранение по условиям Будапештского договора в Международный депозитарий патентуемых организмов в Национальном институте промышленной науки и технологии (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japan) как FERM BP-2998, вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c для получения асцитов, из которых можно выделить антитело РМ-1, или способом, в котором гибридому культивируют в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5% BM-Codimed H1 (фирмы Boehringer Mannheim), или в среде SFM для гибридом (фирмы Gibco BRL), среде PFHM-II (фирмы Gibco BRL) и т.п., из супернатанта которой можно выделить антитело РМ-1.

В соответствии с настоящим изобретением в качестве моноклонального антитела можно использовать рекомбинантное антитело, полученное путем клонирования гена антитела из гибридомы, встраивания этого гена в соответствующий вектор, который вводится в организм хозяина для получения рекомбинантного антитела методами генной инженерии (например, см. Borrebaeck C.A.K. and Larrick J.W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd. 1990).

В частности, можно выделить мРНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела, из клеток, продуцирующих данное антитело, например, гибридомы. Выделение мРНК проводится путем получения тотальной РНК одним из известных методов, например, гуанидиновым методом с ультрацентрифугированием (Chirgwin J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), методом AGPC (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), после чего из тотальной РНК очищают мРНК с помощью набора для очистки мРНК (фирмы Pharmacia) и т.п. С другой стороны, можно сразу получить мРНК с помощью набора для очистки мРНК Quick Prep (фирмы Pharmacia).

Из полученной таким образом мРНК можно синтезировать кДНК V-области антитела с помощью обратной транскриптазы. Синтезировать кДНК можно с помощью набора для синтеза первой нити кДНК с обратной транскриптазой AMV и т.п. С другой стороны, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор 5′-Ampli Finder RACE (фирмы Clontech) и метод 5′-RACE (Frohman M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), в котором применяется ПЦР. Нужный фрагмент ДНК очищают из полученного продукта ПЦР и лигируют с ДНК вектором. Кроме того, из него конструируют рекомбинантный вектор и вводят его в Е. coli, колонии которых подвергают селекции для получения нужного рекомбинантного вектора. Последовательность оснований данной ДНК можно установить известным методом, например методом дидезоксиоснований.

После получения ДНК, кодирующей V-область требуемого антитела, ее можно лигировать с ДНК, кодирующей константную область (С-область) требуемого антитела, а затем встроить в экспрессионный вектор. С другой стороны, кодирующую V-область антитела ДНК можно встроить в экспрессионный вектор, уже содержащий ДНК, кодирующую С-область антитела.

Для того чтобы получить антитело для использования в настоящем изобретении, ген антитела встраивают в экспрессионный вектор так, чтобы он экспрессировался под управлением особого регуляторного участка, например энхансера и/или промотора. После этого экспрессионный вектор вводят путем трансформации в клетки хозяина, которые могут экспрессировать антитело.

В соответствии с настоящим изобретением, с целью уменьшения гетерологичной антигенности в отношении человека, могут применяться искусственно модифицированные рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. Такие модифицированные антитела можно получить известными методами.

Химерные антитела можно получить путем лидирования уже полученной ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, а затем встроить в экспрессионный вектор и ввести в клетки хозяина для выработки в них антител (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Application WO 92-19759). При помощи этого известного метода можно получить химерные антитела, применимые в настоящем изобретении.

Плазмиды, содержащие V-область L-цепи или V-область Н-цепи химерного антитела РМ-1, получили наименования pPM-k3 и pPM-h1, соответственно, и клетки Е. coli, содержащие соответствующие плазмиды, были сданы 11 февраля 1991 г. на международное хранение по условиям Будапештского договора как NCIMB40366 и NCIMB40362 в Национальную коллекцию промышленных и морских бактерий (NCIMB Limited).

Гуманизированные антитела, которые также называют перестроенными антителами человека, получают путем пересадки участка комплементарности (CDR) из антитела млекопитающего (не человека), к примеру, антитела мыши, в CDR антитела человека. Общая технология рекомбинантной ДНК для получения таких антител также известна (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Application WO 92-19759).

В частности, последовательность ДНК, предназначенную для лигирования CDR антитела мыши с каркасным участком (FR) антитела человека, синтезируют из нескольких отдельных олигонуклеотидов, которые частично перекрывают друг друга на концах. Полученную при этом ДНК лигируют с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, а затем встраивают в экспрессионный вектор, который вводят в клетки хозяина для получения антител (см. European Patent Application EP 239400 и International Patent Application WO 92-19759).

Для лигирования FR антитела человека с CDR выбирают такой CDR, который имеет подходящий антигенсвязывающий сайт. При желании можно заменить аминокислоты в участке FR V-области антитела с тем, чтобы CDR гуманизированного антитела мог образовать соответствующий антигенсвязывающий сайт (Sato К. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

В качестве С-области антитела человека можно использовать, к примеру, Cγ1, Cγ2, Сγ3 или Сγ4. С-область антитела человека также можно модифицировать для того, чтобы улучшить стабильность антитела и его выработку.

Химерные антитела состоят из V-области антитела, происходящего не из человека, и С-области антитела человека, а гуманизированные антитела состоят из участка комплементарности (CDR) антитела, происходящего не из человека, и каркасного участка (FR) антитела человека, при этом их антигенность в организме человека уменьшается, поэтому они применимы в качестве антител для настоящего изобретения.

В качестве предпочтительного воплощения гуманизированного антитела для настоящего изобретения можно отметить гуманизированное антитело РМ-1 (см. International Patent Application WO 92-19759).

В качестве метода получения антител человека, наряду с описанными выше, известен метод получения антител человека посредством "кадрирования". Например, вариабельную область антитела человека экспрессируют на поверхности фага методом фагового дисплея в виде одноцепочечного антитела (scFv) и проводят селекцию фага, связывающего антиген. Анализируя ген отобранного фага, можно идентифицировать последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела человека, которая связывается с антигеном. После выяснения последовательности ДНК того scFv, которое связывается с антигеном, эту последовательность можно использовать для создания соответствующего экспрессионного вектора и получения антитела человека. Такие методы уже известны и их можно найти в WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.

Гены антител, созданные как изложено выше, могут быть экспрессированы и получены одним из известных способов. В случае клеток млекопитающих экспрессия может осуществляться с помощью ДНК, в которой функционально связаны один из общеупотребительных промоторов, экспрессируемый ген антитела и сигнал полиА по 3′-сторону от него, либо с помощью содержащего ее вектора. В качестве промотора/ энхансера можно отметить, к примеру, самый ранний промотор/ энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, в качестве промотора/энхансера, который можно использовать для экспрессии антитела для настоящего изобретения, можно отметить промоторы/ энхансеры таких вирусов, как ретровирусы, вирусы полиомы, адено