Производные полисахаридов с высокой антитромботической активностью в плазме

Производные полисахаридов с высокой антитромботической активностью в плазме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Областью изобретения является приготовление сульфатированных полисахаридов с антикоагулянтной антитромботической активностью, начинающееся с полисахаридов микробиологического происхождения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Природный гепарин представляет собой полимер, имеющий структуру гликозаминогликанов с различными молекулярными массами между 3000 Да и 30000 Да, состоящий из последовательности повторяющихся дисахаридных единиц, состоящих из уроновой кислоты (L-идуроновой или D-глукуроновой) и аминосахара (глюкозамина), связанными друг с другом β-1-4-связями. Уроновая кислота может быть сульфатирована во 2-м положении и глюкозамин может быть N-ацетилирован или N-сульфатирован и 6-O-сульфатирован. Кроме того, глюкозамин может также содержать сульфатную группу в 3-м положении.

Такие замещения являются существенными для образования участка связывания с высокой аффинностью к антитромбину (ATIII) и объясняют антикоагулянтную и антитромботическую активность полимера.

Гепарин является основным антикоагулянтным и антитромботическим агентом для терапевтического применения и вплоть до настоящего времени получаемым путем экстракции из органов животных. В попытке замены этого источника поступления и, следовательно, удовлетворения растущих потребностей в материале, вместе с тем исключающих любое случайное загрязнение со стороны инфекционных агентов, преимущественно вирусов или прионов, в последние годы были разработаны различные способы получения молекул с гепарино-подобной структурой, а также подобными характеристиками, начиная с полисахаридов N-ацетилгепарозанов, имеющих бактериальное происхождение, и таким образом, имеющихся в наличии без количественного ограничения.

Полисахарид N-ацетилгепарозан, выделенный из нескольких природных или рекомбинантных штаммов бактерий Escherichia Coli К5 или из Pasteurella multocida, имеет такую же первичную структуру природного предшественника гепарина, состоящую из повторяющейся последовательности D-глукуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенных друг с другом α-1-4-связями. Связь между дисахаридными единицами является, напротив, β-1-4.

Уроновая кислота может быть сульфатирована по двум различным положениям и глюкозамин может быть N-ацетилирован или N-сульфатирован и 6-O-сульфатирован. Кроме того, глюкозамин может содержать также сульфатную группу в 3-м положении.

Полисахарид N-ацетилгепарозан, выделенный из E.Coli К5 (Vann W.F., Schmidt М.А., Jann В., Jann К. (1981) в Eur. J. Biochem 116, 359-364), химически модифицировали как описано Lormeau et al. в патенте США N 5550116 и Casu et al. (Carb. Res 263-1994-271-284) или химическим и ферментативным способом в попытке получить продукты, наделенные биологической активностью, сопоставимой с биологической активностью экстрагируемого гепарина.

Кроме того, полуискусственные продукты должны подвергаться процессу деполимеризации для снижения молекулярной массы, что делает продукт более подходящим для различных терапевтических применений, в частности, это улучшает биодоступность и снижает риск кровотечения, связанного с их применением, и другие побочные эффекты.

Химические и ферментативные модификации бактериального полисахарида описываются, например, в патенте Италии N IТ1230785, где полисахарид К5 является N-деацетилированным и N-сульфатированным, кроме того, он подвергается ферментативной C5-эпимеризации глукуроновой кислоты. Такие преобразования сопровождаются другими преобразованиями ферментативного сульфатирования как на уроновой кислоте, так и на аминосахаре.

Патентная заявка WO 92/17509 описывает способ получения гепариноподобных продуктов, начинающийся с полисахарида К5, посредством N-дезацетилирования, N-сульфатирования и ферментативной C5-эпимеризации с последующим химическим O-сульфатированием и необязательно N-сульфатированием.

Патентная заявка WO 96/14425 и патент США N 5958899 описывают способ получения производных полисахарида К5, имеющих высокое содержание идуроновой кислоты, получаемых путем N-дезацетилирования, N-сульфатирования, ферментативной эпимеризации до идуроновой кислоты более чем 50% глукуроновой кислоты с использованием модифицированных буферов для получения предельной вязкости, с последующим сульфатированием по меньшей мере некоторых из свободных гидроксильных групп уроновой кислоты и глюкоэаминных групп.

Патентная заявка WO 97/433117 и патент США N 6162797 описывают приготовление производных К5 с высокими антикоагулянтными и антитромботическими активностями, полученных посредством N-деацетилирования, N-сульфатирования, ферментативной эпимеризации глукуроновой кислоты и O-суперсульфатированием и N-ресульфатированием.

Патентная заявка WO 98/42754, патент США №6197943 и Naggi A. et al. Carbohydrate Research 336 (2001) 283-290 описывают принцип получения сульфатированных гликозаминогликанов, в том числе производных полисахаридов К5, имеющих высокую антитромботическую активность in vitro, путем сольволитического десульфатирования суперсульфатированных предшественников и необязательного 6-O-ресульфатирования.

Патентные заявки WO 0172848 и WO 02/50125 описывают способ получения производных гликозаминогликанов из полисахарида К5, имеющего высокую антикоагулянтную и антитромботическую активность. Способ включает следующие стадии: а) N-деацетилирования, b) N-сульфатирования, с) ферментативной эпимеризации глукуроновой кислоты в идуроновую кислоту, d) суперсульфатирования, е) частичного химического десульфатирования, f) необязательного селективного 6-O-ресульфатирования. Способ характеризуется использованием фермента глюкуронил С5-эпимеразы в процессированной форме, в растворе или иммобилизованной. Кроме того, патентная заявка США N 09/732026 и Li et al. J. Blol. Chem, vol. 276, 213 (2001) 20069-20077 привели к открытию нового мышиного гена экспрессии фермента С5-эпимеразы, содержащего дополнительную последовательность на N-конце, которая делает возможным образование полных форм фермента, имеющих более высокое соотношение активность/стабильность относительно прежней.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ

Данное изобретение относится к способу получения сульфатированных гликозаминогликанов, получаемых из ацетил-N-гепарозана, который включает следующие стадии:

a) N-деацетилирования и N-сульфатирования полисахарида N-ацетилгепарозана, выделенного из природного или рекомбинантного бактериального источника,

b) ферментативной эпимеризации с помощью фермента глюкуронил С5-эпимеразы,

c) частичного O-сульфатирования в сочетании с частичным O-десульфатированием,

d) частичного 6-O-сульфатирования,

е) N-ресульфатирования

дополнительно включающему промежуточную контролируемую стадию деполимеризации, выполняемую альтернативно после стадии b), с) или d), и где такой способ характеризуется тем фактом, что частичное O-сульфатирование на стадии с) осуществляют с использованием молярного соотношения между сульфатирующим агентом и гидроксилами N-ацетилгепарозана, равного 5 или меньшего 5, более предпочтительно меньшего 2,5 или даже более предпочтительно меньшего 1,5, и тем фактом, что частичное 6-O-сульфатирование на стадии d) осуществляют с использованием молекулярного соотношения между сульфатирующим агентом и гидроксилами N-ацетилгепароэана, равного 2 или меньшего 2.

В соответствии с предпочтительным осуществлением промежуточную деполимеризацию выполняют после стадии эпимеризации b).

Как частичное O-сульфатирование, так и частичное 6-O-сульфатирование выполняют с помощью сульфатирующих агентов, выбранных из триэтиламина-SO₃, триметиламина-SO₃, пиридина-SO₃, в апротонном полярном растворителе, предпочтительно не являющимся донором формильных групп, таком как тетраметиленсульфон, 2,4-диметилсульфолан, N,N,-диметилацетамид или N,N,-диэтилацетамид. Необязательно способ включает стадию аффинной селекции на матриксе, несущем антитромбин III или его фрагменты.

Изобретение также относится к сульфатированным гликозаминогликанам K5OS6OSNS-epi, полученным в соответствии с описанным способом, для фармацевтического применения. Эти продукты отличаются степенью 6-O-сульфатирования, превышающей 40%, и предпочтительно от 50% до 85%, очень близкой к значениям экстрагируемого гепарина, и наличием на редуцированном конце остатка безводного маннита, предпочтительно сульфатированного в положениях 1, 3 и 6. Они также отличаются степенью сульфатирования гидроксильной группы в положении 1 и 6 безводного маннита, равной 20% или превышающей 20%, и в соответствии с предпочтительным аспектом, полным отсутствием формильных групп на аминосахаре.

В соответствии с изобретением сульфатированные гликозаминогликаны демонстрируют биологическую активность против фактора Ха в плазме, превышающую биологическую активность биотехнологических гепаринов, полученных в соответствии с предшествующим уровнем техники, и соотношение между анти-Ха-активностью и анти-IIa-активностью, равной 1 или превышающей 1, сходное с экстрагируемыми гепаринами.

Продукты, получаемые в соответствии со способами изобретения:

a) обладают способностью высвобождать ингибитор тканевого фактора (TFPI) из клеток васкулярного эндотелиума, точно также как экстрагируемые гепарины или даже сильнее,

b) являются особенно устойчивыми к деградации гидролитическим ферментом, подобным гепариназе I,

с) обладают способностью ингибировать высвобождение протеаз тромбина и фактора Ха,

d) обнаруживают низкую аффинность для фактора PF4 (4-го тромбоцитарного фактора).

В соответствии с дальнейшим аспектом изобретение относится к биотехнологическим гепаринам (модифицированным N-ацетилгепарозанам), полученным в соответствии со способом изобретения, для терапевтического применения и к фармацевтическим композициям, содержащим такие продукты в виде активных компонентов. В соответствии с последующим аспектом изобретение рассматривает применение продуктов, полученных для приготовления лекарственных средств с антитромботическими и антикоагулянтными гепариноподобными активностями, для приготовления профибринолитических и антиагрегантных лекарственных средств и для приготовления лекарственных средств для профилактики и лечения тромбоэмболитических нарушений, вызванных врожденной или приобретенной нехваткой антитромбина III.

Дальнейший аспект изобретения относится к получению O-сульфатированных промежуточных продуктов K5OSNH₂-epi и K5OS6OSNH₂-epi, несущих свободную аминогруппу аминосахаров, предпочтительно свободную от формильных групп, причем такие промежуточные продукты могут быть выделены и использованы для получения N-сульфатированных и/или N-ацетилированных производных гепарозана.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. ¹С-ЯМР спектр аномерной области полисахарида N-сульфата К5, эпимеризованного как описано в Примере 1.

Фигура 2. ¹Н-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 1.

Фигура 3. ¹Н-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 2.

Фигура 4. ¹³С-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 3.

Фигура 5. ¹³С-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 4.

Фигура 6. ¹³С-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 5.

Фигура 7. ¹³С-ЯМР спектр продукта, полученного в Примере 6.

Фигура 8. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 7.

Фигура 9. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 8.

Фигура 10. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 9.

Фигура 11. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 10.

Фигура 12. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 11.

Фигура 13. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 12.

Фигура 14. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 13.

Фигура 15. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 14.

Фигура 16. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 15.

Фигура 17. ¹³С-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 16.

Фигура 18. ¹Н-ЯМР-спектр продукта, полученного в Примере 18.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с главным аспектом настоящее изобретение относится к способу получения сульфатированных гликозаминогликанов, получаемых из N-ацетилгепарозана и названных с целью данного изобретения «биотехнологические гепарины», который включает следующие стадии:

а) N-деацетилирования и N-сульфатирования полисахарида N-ацетилгепарозана, выделенного из природного или рекомбинантного бактериального источника,

b) ферментативной эпимеризации с помощью фермента глюкуронил С5-эпимеразы,

c) частичного O-сульфатирования, в сочетании с частичным O-десульфатированием,

d) частичного селективного 6-O-сульфатирования,

e) N-ресульфатирования,

где этот способ дополнительно включает промежуточную стадию контролируемой деполимеризации, выполняемой альтернативно после стадии b), или с), или d), и где указанный способ характеризуется тем фактом, что O-сульфатирование является частичным, где на стадии с) этого достигают с использованием молярного соотношения между сульфатирующим агентом и гидроксильными группами субстрата (эпимеризованного N-ацетилгепарозана), равного 5 или меньшего 5, более предпочтительно, равного 2,5 или меньшего 2,5, или даже более предпочтительно, равного 1,5 или меньшего 1,5, и времени сульфатирования, меньшего 10 часов. Частичное 6-O-сульфатирование в соответствии со стадией d) получают с использованием молярного соотношения между сульфатирующим агентом и гидроксильными группами субстрата (эпимеризованного N-ацетилгепарозана), равного 2 или меньшего 2, или более предпочтительно, равного 1,5 или меньшего 1,5, и времени сульфатирования, меньшего 2 часов, или даже более предпочтительно, равного 90 минутам или меньшего 90 минут, или даже более предпочтительно, меньше чем 60 минут или равного 60 минутам при температуре, составляющей между 4°С и 30°С, предпочтительно между 10°С и 25°С.

Частичное O-сульфатирование в соответствии со стадией с) и частичное 6-O-сульфатирование в соответствии с этапом d) выполняют с использованием известных сульфатирующих агентов в апротонном полярном растворителе, предпочтительно не являющемся донором формильных групп, более предпочтительно выбранного из N,N,-диалкилацетамида (более предпочтительно N,N,-диметилацетамида или N,N,-диэтилацетамида) и сульфоланов (предпочтительно тетраметиленсульфона или 2,4-диметилсульфолана).

Использование органического растворителя, не являющегося донором формильных групп, связанное с условиями частичного сульфатирования, приводит к продуктам, отличающимся отсутствием формильных групп или их производных на аминосахаре, и к распределению сульфатных групп, сходному с распределением экстрагируемых гепаринов.

В соответствии со способом настоящего изобретения контролируемую деполимеризацию выполняют в качестве промежуточной стадии, которую вводят альтернативно после стадии b), с) или d), a не в финальной фазе как описано в известном уровне техники. Контролируемую деполимеризацию предпочтительно выполняют на эпимеризованном полисахариде N-сульфатгепарозане до или после стадии с) частичного O-сульфатирования. Контролируемая деполимеризация может быть выполнена физическими методами, в том числе обработкой гамма-лучами, или химическими способами, в том числе бета-гамма воздействием с азотистой кислотой или ее солями или обработкой солями йодной кислоты или воздействием свободными радикалами. В соответствии с предпочтительным аспектом деполимеризующим агентом является азотистая кислота, и полисахарид используют в количестве, составляющем от 1 до 100 мг соли/г полисахарида. Реакцию осуществляют при температуре, составляющей от 4 до 10°С. Более предпочтительно, контролируемую полимеризацию осуществляют в течение менее 30 минут в присутствии нитрита натрия и ее завершают прибавлением молярного избытка боргидрида натрия.

Промежуточная деполимеризация делает возможным получение низкомолекулярного продукта, предпочтительно с молекулярной массой, меньшей 15000 Да или равной 15000 Да, более предпочтительно составляющей от 3000 до 9000 Да, несущем остаток ангидроманнита на редуцированном конце, который обнаруживает, кроме того, сульфатирование гидроксила в 6-м положении, аналогично экстрагируемым гепаринам, сульфатирование гидроксилов в положении 1 и 3.

Однако способ является совместимым также с дальнейшей деполимеризацией, выполняемой в конце процесса. Заметили, что при проведении деполимеризации в промежуточной фазе конечные продукты имеют антикоагулянтную и антитромботическую активность и соотношение между анти-Ха и анти-IIа неожиданно выше, чем соотношение, обнаруженное в продуктах с такой же молекулярной массой, но полученных после деполимеризации, выполненной после стадий сульфатирования/десульфатирования и 6-O-сульфатирования, как продемонстрировано данными, представленными в Таблице 1.

В соответствии с предпочтительным способом осуществления изобретения полисахарид N-ацетилгепарозан предпочтительно получают из E.coli K5.

Способ может дополнительно и необязательно включать конечную стадию обогащения продуктов, полученных в результате стадий а)-е), состоящей из аффинной хроматографии на антитромбине III, как описано в Hook et al. FEBS Lett 1976, 66: 90-93.

N-деацетилирование и N-сульфатирование выполняют в соответствии со способами, известными в данной области, которые включают щелочной гидролиз, выполняемый при температуре, составляющей от 30 до 80°С, предпочтительно от 40 до 60°С, в течение периода времени, составляющего между 10 и 30 часами, предпочтительно между 15 и 20 часами, с последующей обработкой в течение периода времени вплоть до 12 часов при 20-65°С сульфатирующим агентом, предпочтительно пиридинсульфотриоксидом, в углекислом натрие.

Эпимеризацию на стадии b) выполняют с помощью природного или рекомбинантного фермента глюкоронил-С5-эпимеразы, предпочтительно в иммобилизованной форме.

Фермент является предпочтительно рекомбинантным ферментом, описанным в заявке WO 98/48006, или даже более предпочтительно ферментом, описанным в патенте США №09/732026, и предпочтительно экспрессированным и очищенным из клеток насекомых или из дрожжевых штаммов, таких как, например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Saccharomyces pombe, Kluyveromices lactis, Kluyveromices fragilis.

Иммобилизацию фермента предпочтительно выполняют на смолах CNBr Sepharose 4B (Pharmacia) или на полиметакриловых или на полистирольных смолах с эпоксидными группами или диоловыми группами, активированных с использованием CNBr, в буфере 100-300 мМ NaНСО₃ или в 10-50 мМ фосфатном буфере при рН 7,0-8,3, более предпочтительно при рН 7,2-7,8, при температуре 4-25°С в течение 12-72 часов.

В соответствии с более предпочтительным аспектом реакцию эпимеризации проводят при температуре, не превышающей 35°С, предпочтительно при температуре, составляющей от 15 до 30°С, более предпочтительно, составляющей от 20 до 25°С.

Эпимеризацию выполняют в соответствии с известными способами, например, способом, описанным в заявке WO 01/72848, предпочтительно при температуре не выше, чем 35°С, более предпочтительно между 15 и 30°С, или даже более предпочтительно, между 20 и 25°С.

Буфером для эпимериэации предпочтительно является раствор HEPES (предпочтительно в концентрации 25 мМ) с рН, составляющим между 5,5-8,0, более предпочтительно между рН 6,5-7,0, и кроме того буфер содержит N-деацетилированный и N-сульфатированный полисахарид, 10-30 мМ ЭДТА, предпочтительно 15-25 мМ, CaCl₂ (или альтернативно соли других двухвалентных катионов, например, Zn²⁺, Ва²⁺, Мg²⁺, Мn²⁺) в концентрации, составляющей между 70 и 150 мМ, более предпочтительно между 75-100 мМ. Раствор термостатируют при температуре, составляющей между 15° и 30°С (предпочтительно 20-25°С), предпочтительно рециркулируют при скорости потока 30-240 мл/час в течение периода времени между 1 и 24 часами. Колонка содержит предпочтительно от 1,2×10⁷ до 3×10¹¹ частей на миллион эквивалентов иммобилизованного фермента на инертном термостатированном носителе.

Приведенные выше определенные рабочие условия, в частности предварительно установленная температура, стабилизируют фермент C5-эпимеразу в течение тысячи часов, делая возможным заметное сохранение времени и реактивов для получения колонки для эпимеризации.

Частичное O-сульфатирование в способе (стадия с) выполняют путем использования известных сульфатирующих агентов, таких как триэтиламин-SO₃, триметиламин-SO₃, пиридин-SO₃, в апротонном полярном растворителе, предпочтительно не являющимся донором формильных групп. Реакцию осуществляют с использованием молярного соотношения между сульфатирующим агентом и гидроксильными группами субстратов, равного 5 или меньшего 5, или предпочтительно равного 2,5 или меньшего 2,5, или более предпочтительно меньшего 1,5, в течение периода времени, равного 10 или меньшего 10 часов, более предпочтительно, равного 8 или меньшего 8 часов, предпочтительно составляющем от 1 до 6 часов, при температуре от 20°С до 70°С, предпочтительно от 30°С до 60°С.

Частичное O-сульфатирование с последующим частичным десульфатированием осуществляют путем воздействия с использованием десульфатирующего агента, такого как ДМСО, в метаноле в течение периода времени, составляющего от 10 до 240 минут, при температуре, составляющей от 45 до 90°С.

Каждая стадия способа может также включать осаждение и/или обессоливание промежуточного полисахарида в соответствии с известными методами.

Частичное 6-O-сульфатирование (стадия d) получают прибавлением сульфатирующего агента в молярном соотношении с гидроксильными группами субстратов, равным 2 или меньшем 2, или предпочтительно меньшем 1,5, в течение периода времени, равного 2 или меньшего 2 часов, или предпочтительно равного 90 или меньшего 90 минут, даже более предпочтительно между 4°С и 30°С, предпочтительно от 10°С и 25°С, в растворе с апротонным полярным растворителем, предпочтительно не являющимся донором формильных групп. В соответствии с альтернативным вариантом способа изобретения частичное 6-O-сульфатирование (стадия d) осуществляют после N-ресульфатирования, и стадии d) и е) выполняют в обратном порядке.

N-ресульфатирование (стадия е) предпочтительно осуществляют в карбонатном буфере прибавлением известного сульфатирующего агента, например, триэтиламина-SO₃, триметиламина-SO₃, пиридина-SO₃.

В заключение необходимо отметить, что способ изобретения демонстрирует следующие инновационные элементы: частичное O-сульфатирование (O-сульфатирование и 6-O-сульфатирование), деполимеризацию, осуществляемую на промежуточной стадии, а не в качестве конечной стадии, и, кроме того, частичное O-сульфатирование и 6-O-сульфатирование осуществляют в апротонном полярном органическом растворителе, предпочтительно не являющимся донором формильных групп.

Производные N-ацетилгепарозана, полученные способом настоящего изобретения, обнаруживают характерную структуру и биологические отличия по отношению к биотехнологическим гепаринам, полученным в соответствии с хорошо известными в данной области способами.

С химической точки зрения полисахариды настоящего изобретения определяют как смесь полисахаридных цепей, представленных следующей общей формулой (I),

где n имеет пределы от 3 до 150, R1 может быть водородом, SO₃-группой или ацетильной группой. R1 не представляет собой другие функциональные группы, такие как формильные группы. R2, R3, R4 и R5 могут быть водородом или SO₃-группой, причем предпочтительно R1, R2, R3, R4, R5 являются замещенными как указано ниже:

- R1 от 85 до 97% SO₃-группами, и/или от 3 до 15% ацетильными группами, и/или от 0 до 12% H⁺

- R2 от 15 до 60% SO₃ ^-

- R3 SO₃ ^- - группами до по меньшей мере 40%, предпочтительно от 50% до 85%

- по меньшей мере 20% единиц глукуроновой кислоты не являются сульфатированными в положениях R4 и R5.

В частности, деполимеризованные полисахариды в соответствии со способом изобретения демонстрируют на их редуцированном конце остаток ангидроманнита с одним или несколькими сульфатированными гидроксилами.

Это происходит при осуществлении деполимеризации в присутствии азотистой кислоты или ее производных, например, нитрита натрия, с последующим воздействием боргидридом натрия для получения соединений в соответствии с нижеследующей структурой (II),

где R1, R2, R3 могут быть водородом или SO₃ ^--группой и где предпочтительно:

- R1 колеблется от 0 до 100% SO₃ ^-

- Р2 от 0 до 100% SO₃ ^-

- R3 от 0 до 100% SO₃ ^-

Предпочтительно R1 и R3 содержат от 20% до 85% SO₃ ^-, и R2 - от 15 до 60% SO₃ ^-.

Предпочтительными продуктами являются продукты с молекулярной массой, меньшей или равной 15000 Да, или предпочтительно составляющей от 1500 до 15000 Да, даже более предпочтительно от 3000 до 9000 Да.

Продукты, полученные в соответствии с изобретением, являются различными с точки зрения структуры по сравнению с продуктами предшествующего уровня техники, исходя из наличия множественных сигналов в области ¹³С ЯМР-спектра, составляющей от 79 до 89 импульсов в минуту, в частности от 80 до 86 импульсов в минуту, которые присутствуют в избытке по отношению к характерным сигналам ангидроманнита (см. фиг.10), которая показывает ¹³С ЯМР-спектр пробы при высоком разрешении, приготовленной в примере 9, и которые указывают на наличие сульфатированного в различной степени ангидроманнита, в частности, на гидроксилах в положении 1 и 6, в низкомолекулярных продуктах, приготовленных в соответствии со способом изобретения с использованием промежуточной деполимеризации.

Более конкретно, продукты, полученные в соответствии со способами изобретения, являются различными вследствие сульфатирования гидроксилов в положении 1 ангидроманнита, как показано усилением сигнала в области при 67-68 импульсов в минуту, и уменьшением исчезновения сигнала в области при 61-63 импульсов в минуту в спектре ¹³С ЯМР.

Различия обнаружены путем сравнения спектра на Фигуре 11 (соответствующего полисахариду, полученному как описано в примере 10) и спектра, показанного на Фигуре 9 (полисахарид, полученный как описано в примере 8). Эти различия являются более очевидными в форме двумерного ЯМР в соответствии со способом, описанным у Guerrini et al. Seminars in Thrombosis and Hermostasis, vol 27, 5, 473-482, 2001.

Главная характеристика этих участков является результатом частичного или полного сульфатирования имеющихся гидроксильных групп ангидроманнита, которые образуются на редуцированном конце полисахарида во время деполимеризации, при ее выполнении перед стадией сульфатирования и, в частности, сульфатированием гидроксилов в положении 1 и 6.

Дополнительной особенностью продуктов изобретения по отношению к продуктам и способу предшествующего уровня техники (например, особенностям, продемонстрированным в экспериментальном примере 6 и 7 относительно данной заявки) является отсутствие сигналов при 7-9,5 импульсов в минуту в спектре ¹Н ЯМР и при 51 и 165 импульсов в минуту в спектре ¹³С ЯМР, что указывает на отсутствие химических групп, отличных от свободной аминогруппы или от ацетильной группы или от сульфатной группы, на глюкозамине во всех продуктах, полученных с низкой или высокой молекулярной массой.

И, наоборот, эти сигналы обычно присутствуют в продуктах, полученных способами, при которых осуществляют сульфатирование N-ацетилгепарозана в органических растворителях, донорах формильных групп, таких как N,N-диалкилформамиды.

Сульфатированные гликозаминогликаны, полученные в соответствии с данным изобретением, обнаруживают антикоагулянтную активность, измерянную в виде активности против фактора Ха в присутствии плазмы, выше чем антикоагулянтная активность биотехнологических гепаринов, полученных в соответствии с известными способами модификации. Кроме того, они обнаруживают соотношение между анти-Ха- и анти-IIа-активностями, равное или превышающее 1, очень сходное с соотношением экстрагируемых гепаринов.

В частности новые продукты демонстрируют:

a) ингибирующую фактор Ха активность выше, чем 50 МЕ/мг, более предпочтительно выше, чем 70 МЕ/мг в тестах, выполненных в присутствии плазмы крови человека. Активность против фактора Ха предпочтительно определяют как описано у Ten Gate H et al. Clin. Chem 3, 860-864 (1984) или в European Pharmacopoeia 1997 3^rd edition. В присутствии плазмы эта биологическая активность является поразительно выше, чем активность биотехнологических гепаринов, полученных с использованием способов предшествующего уровня техники, и является сходной с активностью, определенной для экстрагируемых гепаринов с высокой или низкой молекулярной массой,

b) способность к активации TFPI (ингибитора пути тканевого фактора, описанного Bronze GJ Jr et al. Blood 71, 335-343, 1988), равную или превышающую способность к активации TFPI экстрагируемых гепаринов,

c) соотношение между анти-Ха- и анти-IIа-активностями, равное 1 или превышающее 1, при сопоставимой молекулярной массе. Более предпочтительно, соотношение является выше, чем 1,5.

d) устойчивость к перевариванию гепариназой I, равную или превышающую устойчивость экстрагируемых гепаринов,

e) способность к ингибированию высвобождения протеаз тромбина и фактора Ха,

f) низкую аффиность к фактору PF4 (фактор тромбоцитов-4).

Способность к активированию TFPI из сосудистых эндотелиальных клеток усиливает антитромботическую и противовоспалительную активность этих продуктов и расширяет и улучшает терапевтические показания для тромбоза глубоких вен при хирургических процедурах, ишемических осложнений нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда и случаев ишемии.

Способность к ингибированию образования протеазы, объединенная с повышенным образованием TFPI, делает возможным дальнейшее распространение терапевтических показаний этих продуктов для лечения сепсиса и его осложнений, таких как синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (CID) и для лечения заболеваний, вызванных врожденным или приобретенным отсутствием антитромбина III.

Определение активности фактора TFPI после лечения с использованием продуктов настоящего изобретения выполняют, например, in vitro на клетках HUVEC в соответствии со способом, описанным Gory AM et al. Thromb. Haemostasis: 81: 589-593 (1999).

Производные N-ацетилгепарозана, полученные в соответствии с настоящим изобретением, (биотехнологические гепарины) являются особенно устойчивыми к деградации гидролитическими ферментами, такими как гепариназа I. Эта особенность вместе с возможностью получения продуктов с низкой молекулярной массой, которые сами по себе повышают биодоступность и снижают риск геморрагии, связанный с их применением, и коллатеральные эффекты по отношению к высокомолекулярным гепаринам, вместе с высокой активностью против фактора Ха и с низкой степенью сульфатирования, делает возможным их использование не только для парентерального, но также для перорального введения.

Как указано выше, продукт, полученный способом изобретения, обнаруживает способность ингибирования образования протеазы тромбина и фактора Ха.

Ингибирование образования протеаз предпочтительно выполняют в истощенной в отношении фибриноген плазме. Ингибирование образования как тромбина (фактора II), так и фактора Ха является предпочтительно измеряемым с использованием амидолитического метода как для внутренней, так и для наружной систем коагуляции.

В соответствии с обоими способами в обоих использованных системах, продукты, полученные по изобретению, демонстрируют сильную ингибирующую активность как для тромбина, так и для фактора Ха, и это свойство улучшает антитромбиновый профиль этих продуктов. Продукты, полученные в соответствии со способом изобретения, кроме того, являются наделенными низкой аффиностью к фактору PF4 (фактору тромбоцитов 4), которая может быть измерена в плазме в виде остаточной активности против фактора Ха после добавления фиксированного количества фактора PF4 в растворе, содержащем биотехнологические гепарины.

Остаточная активность против фактора Ха, определенная в виде процента относительно исходной активности, является выше, чем активность, полученная с экстрагируемыми гепаринами или с низкомолекулярными экстрагируемыми гепаринами, что указывает на более низкую аффинность к PF4.

Такая более низкая аффинность связывания улучшает клиническую характеристику продуктов, полученных в соответствии с настоящим изобретением, так как она снижает риск появления гепарин-индуцированной тромбоцитопении (HIT). Даже если предпочтительная молекулярная масса получаемого продукта является ниже чем 15000 Да, или более предпочтительно составляет от 3000 до 9000 Да, молекулярная масса продуктов > 15000 Да является легкодостижимой путем изменения условий деполимеризации, тем не менее поддерживающих их биологические свойства, например, высокую активность против фактора Ха, устойчивость к гепариназе и высвобождение фактора TFPI.

В заключение, биотехнологические гепарины, произведенные в соответствии с настоящим изобретением, обнаруживают следующие основные свойства:

- участок, охватывающий от 79 до 89 импульсов в минуту, или более точно, охватывающий от 80 до 86 импульсов в минуту ¹³С ЯМР, который отличается наличием избыточных многочисленных сигналов относительно характерных сигналов ангидроманнита и усилением сигнала при 67-68 импульсов в минуту и/или ослаблением сигнала или даже исчезновением при 61-62 импульсов в минуту у ¹³С ЯМР. Эти сигналы указывают на присутствие различно сульфатированного ангидроманнита, в частности сульфатированного в положении 1, 3 и 6 и даже более конкретно, сульфатированного по гидроксилу в положении 1, как подчеркнуто в сравнении между спектрами фигуры 11 и фигуры 9.

- предпочтительное отсутствие сигналов при 7-9,5 импульсах в минуту в спектре ¹Н ЯМР и отсутствие сигнала при 51 и 165 импульсах в минуту в спектре ¹³С ЯМР, что указывает на отсутствие формильных групп.

- активность против фактора Ха (антикоагулянтную) в плазме, которая выше, чем антикоагулянтная активность биотехнологических гепаринов, полученных в соответствии со способами предшествующего уровня техники.

- соотношение анти-Ха-факторная активность/анти-IIa-факторная активность, которое равно или превышает таковое для биотехнологических гепаринов, полученных в соответствии со способами предшествующего уровня техники, предпочтительно выше или равно 1, или значительно более предпочтительно выше или равно 1,5.

- устойчивость к гепариназе, которая равна или выше чем у экстрагируемых гепаринов;

- способность к ингибированию образования тромбина и фактора Ха

- низкую аффинность к PF4.

Биологические активности вновь образованных биотехнологических гепаринов являются специфичными: в частности, соотношение между активностью против фактора Ха и активностью против фактора IIа равно 1 или выше чем 1, обычно соотношение в продуктах, полученных в соответствии с предшествующим уровнем техники, является ниже чем 1, что указывает на оптимальное соотношение между антитромботической и антикоагулянтной активностями, которое образуется из значениий АРТТ. Такое соотношение является сходным с соотношением экстрагируемых гепаринов.

Также оптимальным свойством по отношению к экстрагируемым гепаринам, оцениваемым из высоких значений HCII, является лучшее прямое ингибирование тромбина, что предполагает возможность применения продуктов изобретения при тромбоэмболитических и/или васкулярных нарушениях, вызываемых тромбином, и при приобретенном и при врожденном дефиците антитромбина III.

В соответствии с дальнейшим аспектом настоящее изобретение относится к применению продуктов, полученных в соответствии с описанными способами, в чистом виде или приготовленных в композиции с подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями или растворителями, для антикоагулянтного и антитромботического лечения или профилактики взамен экстрагируемых гепаринов и для получения лекарственных веществ с профибринолитической и антиагрегационной активностью.

Особенно подходящим является применение продуктов настоящего изобретения или композиций, содержащих такие продукты, в качестве активных ингредиентов для профилактики и лечения нестабильной с