Ген, придающий устойчивость к phytophthora infestans (фитофторозу) в семействе solanaceae

Ген, придающий устойчивость к phytophthora infestans (фитофторозу) в семействе solanaceae

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Фитофтороз, вызываемый относящимся к классу оомицетов патогеном Phytophthora infestans, является распространенной по всему свету наиболее деструктивной болезнью для культивирования картофеля. Эта болезнь является также угрозой культуре томата. Настоятельность получения устойчивых сортов (культиваров) интенсифицировалась по мере быстрого возникновения вирулентных, специализированных в отношении определенных культур и устойчивых к пестицидам штаммов этого патогена.

Способом предупреждения неурожаев или уменьшенных урожаев является применение фунгицидов, которые предотвращают или излечивают инфекцию P. infestans. Однако считается, что применение этих защищающих посев агентов является нагрузкой для окружающей среды. Так в нескольких западных странах законодательство становится более ограничивающим и частично запрещающим применение специфических фунгицидов, делая более трудной химическую борьбу с данной болезнью. Альтернативным подходом является применение сортов, которые несут частичную или полную устойчивость к фитофторозу. Два типа устойчивости к фитофторозу были описаны и использованы в селекции картофеля. Один тип придается несколькими основными доминантными генами, которые делают хозяина несовместимым со специфическими расами этого патогена (раса-специфическая устойчивость). Одиннадцать таких R-генов (R1-R11) были идентифицированы, и считается, что они происходят из дикого вида картофеля Solanum demissum, который является природным в Мексике, где обнаружена наибольшая генетическая изменчивость этого патогена. Некоторые из этих R-генов были картированы на генетической карте картофеля (обзор Gebhardt and Valkonen, 2001 Annu. Rev. Phytopathol. 39: 79-102). R1 и R2 локализованы на хромосомах 5 и 4 соответственно. R3, R6 и R7 локализованы на хромосоме 11. Неизвестные R-гены, придающие раса-специфическую устойчивость к фитофторозу, были описаны также в S. tuberosum ssp. andigena и S. berthaultii (Ewing et al., 2000 Mol. Breeding 6: 25-36). Вследствие высокого уровня устойчивости и легкости переноса многие сорта содержат происходящую из S. demissum устойчивость. К сожалению, происходящая из S. demissum раса-специфическая устойчивость хотя и является почти полной, не является продолжительной. Как только заново выведенные сорта выращивают в крупном масштабе в коммерческих полях, возникают новые вирулентности в P. infestans, которые делают этот патоген способным преодолевать приобретенную интрогрессией устойчивость. Второй тип устойчивости, называемый полевой устойчивостью и часто встречающийся в природе, считается не специфическим в отношении расы и более продолжительным. Полевая устойчивость к фитофторозу может быть обнаружена в некоторых видах Solanum в Мексике и Средней и Южной Америке (Rossi et al., 1986 PNAS 95:9750-9754).

Диплоидный S. bulbocastanum из Мексики и Гватемалы является одним из имеющих клубни видов, который известен из-за его высоких уровней полевой устойчивости к фитофторозу (Niederhauser and Mills, 1953 Phytopathology 43: 456-457). Несмотря на различия в балансовых числах в эндосперме интрогрессия признака устойчивости S. bulbocastanum была успешной. Манипуляции с плоидностью и ряд трудоемких bridge-скрещиваний привели к полученной из S. bulbocastanum, P. infestans-устойчивой зародышевой плазме (Hermsen and Ramanna, 1969 Euphytica 18:27-35; 1973 Euphytica 22:457-466; Ramanna and Hermsen, 1971 Euphytica 20:470-481; Hermsen and De Boer, 1971 Euphytica 20:171-180). Однако спустя почти 40 лет после получения первых гибридов и интенсивной и непрерывной селекционной работы селекционеров, занимающихся селекцией картофеля в Нидерландах с этой зародышевой плазмой, устойчивые к фитофторозу сорта все еще не были выведены на рынок. Успешное получение соматических гибридов S. bulbocastanum и S. tuberosum также сообщалось (Thieme et al., 1997 Euphytica 97(2):189-200; Helgeson et al., 1988 Theor Appl. Genet 96:738-742). Было обнаружено, что некоторые из этих гибридов и полученная обратным скрещиванием зародышевая плазма являются высокоустойчивыми к фитофторозу, даже при экстремальной нагрузке этой болезни. Несмотря на сообщения о супрессии рекомбинации устойчивость в полученном обратным скрещиванием материале находится, по-видимому, на хромосоме 8 в интервале приблизительно 6 сМ между маркерами RFLP СР53 и СТ64 (Naess et al., 2000 Theor. Appl Genet 101:697-704). Маркер CAPS, полученный из RFLP-зонда СТ88 томатов, корасщеплялся с устойчивостью. Супрессия рекомбинации между хромосомами S. bulbocastanum и S. tuberosum образует потенциальное препятствие для успешного восстановления повторно культивируемой зародышевой плазмы картофеля до уровня, который мог бы удовлетворять стандартам для новых селекционированных сортов картофеля. Выделение генов, которые кодируют устойчивость, обнаруженную в S. bulbocastanum, и последующая трансформация существующих сортов этими генами были бы гораздо более прямым и более быстрым подходом в сравнении использующей интрогрессию селекцией.

Клонирование и молекулярная характеристика многочисленных генов R растений, придающих устойчивость к болезням, вызываемым бактериями, грибами, вирусами, нематодами и насекомыми, идентифицировали несколько структурных признаков, характерных для генов R растений (обзор Dangl and Jones, 2001 Nature 411, 826-833). Большинство из них являются членами тесно связанных мультигенных семейств, и все гены R, охарактеризованные до сих пор, за исключением Pto, кодируют богатые лейцином повторы (LRR), структуры, которые, как было показано, участвуют в межбелковых взаимодействиях. LRR-содержащие гены R могут быть подразделены на два класса на основе присутствия предположительного состоящего из трех частей нуклеотидсвязывающего сайта (NBS). Гены R класса NBS-LRR содержат мотивы, которые являются общими с регуляторными белками апоптоза животных (van der Biezen et al., 1998 Curr. Biol. 8, 226-227; Aravind et al., 1999 Trends Biochem. Sci. 24, 47-53) и могут быть подразделены на две подгруппы на основе N-концевого домена, который либо проявляет сходство последовательности с белком Toll Drosophila и доменом рецептора интерлейкина-1 млекопитающего (TIR-NBS-LRR), либо содержит потенциальную лейциновую молнию или домен скрученной спирали (СС-NBS-LRR; Pan et al., 2000 Genetics, 155:309-22). Гены LRR-R без NBS кодируют трансмембранные белки, внеклеточный N-концевой район которых состоит из LRR (Jones et al., 1994 Adv. Bot. Res. 24, 89-167). Эти гены могут быть подразделены на две подгруппы на основе присутствия цитозольного домена серин/треонинкиназы (Song et al., 1995 Science, 270, 1804-1806). В настоящее время были клонированы четыре гена R из картофеля. Все четыре, в том числе полученный из S. demissum ген R1, придающий раса-специфическую устойчивость к фитофторозу, принадлежат к классу СС-NBS-LRR генов R растений (Bendahmane et al., 1999 Plant Cell 11, 781-791; Bendahmane et al., 2000 Plant J. 21, 73-81; van der Vossen et al., 2000 Plant Journal 23, 567-576; Ballvora et al., 2002 Plant Journal 30, 361-371).

Данное изобретение обеспечивает выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность фиг.8, или ее функциональный фрагмент или гомолог. Белок с указанной аминокислотой был обнаружен в качестве члена семейства белков, кодируемых кластером генов, идентифицируемых анализом филогенетического дерева, которое до сих пор состоит из белков, кодируемых Rpi-blb, RGC1-blb, RGC3-blb и RGC4-blb (далее называемыми кластером генов Rpi-blb) фиг.9.

Анализ филогенетического дерева проводят следующим образом. Сначала выполняют сопоставление множественных последовательностей - последовательностей нуклеиновых кислот и/или предпочтительно расшифрованных аминокислотных последовательностей генов, которые должны быть анализированы, с использованием программы CLUSTALW (http://www2.ebi.ac.uk/clustalw), которая рутинно используется в данной области. ClustalW дает.dnd file, который может быть прочтен с использованием программы TREEVIEW (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html). Филогенетическое дерево, изображенное на фиг.9А, является филограммой.

Филогенетические исследования расшифрованных аминокислотных последовательностей Rpi-blb, RGC1-blb, RGC3-blb и RGC4-blb и последовательностей большинства сходных генов из данной области (определенных с использованием BLASTX), полученных из отличающихся видов, с использованием способа Neighbour-Joining Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), показывает, что соответствующие гены или их функциональные фрагменты кластера генов Rpi-blb могут быть помещены в отдельную ветвь (фиг.9А).

Сравнение последовательностей между четырьмя членами кластера генов Rpi-blb, идентифицированными на ВАС-клоне 8005-8 SPB-4, показывает, что гомология последовательностей в кластере генов Rpi-blb варьируется между 70% и 81% на уровне последовательностей аминокислот. Расшифрованная аминокислотная последовательность Rpi-blb имеет наивысшую общую гомологию с RGC3-blb (81% идентичность аминокислотной последовательности; таблица 4). При сравнении различных доменов видно, что эффекторные домены, присутствующие в N-концевых половинах этих белков (домены скрученных спиралей и NBS-ARC), имеют более высокую степень гомологии (91% идентичность последовательности), чем С-концевые половины этих белков, которые, как считается, содержат домены узнавания (LRR; 71% идентичность последовательности). Сравнение всех четырех аминокислотных последовательностей выявило в целом 104 Rpi-blb-специфических аминокислотных остатков (фиг.10). Большинство из них локализованы в LRR-районе (80/104). В этом последнем районе эти специфические остатки сконцентрированы в LRR-субдомене xxLxLxxxx. Относительная частота этих специфических аминокислотных остатков в этом LRR-субдомене является более, чем в 2 раза, более высокой (28,3%), чем частота, наблюдаемая в остальной части LRR-домена (12,3%). Считается, что остатки, расположенные около этих двух консервативных остатков лейцина в консенсусе xxLxLxxxx, экспонированы (обнажены) растворителем и, следовательно, участвуют, по-видимому, в создании/поддержании специфичности узнавания этого белка устойчивости.

Последовательности дополнительных членов кластера генов Rpi-blb могут быть получены скринингом библиотек геномной ДНК или инсертов, например, ВАС-библиотек, праймерами на основе сигнатурных последовательностей гена Rpi-blb. Скрининг различных ВАС-библиотек Solanum наборами праймеров А и/или В (таблица 2 и фиг.7) идентифицировал многочисленные гомологи Rpi-blb, полученные из различных видов Solanum. Сопоставление этих дополнительных последовательностей с последовательностями, представленными на фиг.10, поможет идентифицировать дополнительные члены кластера генов Rpi-blb и специфические аминокислотные остатки в их белках, ответственные за специфичность устойчивости к P. infestans. Кроме того, испытание дополнительных последовательностей в вышеописанных анализах филогенетического дерева, например, с использованием способа Neighbour-Joining Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), обеспечивает дополнительную идентификацию генов, принадлежащих к кластеру генов Rpi-blb.

Данное изобретение обеспечивает развитие интраспецифического картирования популяции S. bulbocastanum, которая расщепляется в отношении раса-неспецифической устойчивости к фитофторозу. Эта устойчивость картирована на хромосоме 8, в районе, локализованном на расстоянии 0,3 сМ от СТ88. Благодаря раса-неспецифическому характеру этой устойчивости, всегда считалось, что устойчивость к фитофторозу S. bulbocastanum является независимой от гена R. Однако в данном изобретении авторы демонстрируют впервые, что раса-неспецифическая устойчивость S. bulbocastanum придается фактически геном, имеющим сходство с геном R NBS-LRR-типа.

Далее, данное изобретение обеспечивает молекулярный анализ этого геномного района и выделение с использованием клонирования на основе карты ДНК-фрагмента устойчивого родителя, который несет ген R, обозначенный Rpi-blb. Этот ДНК-фрагмент был субклонирован из клона бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) длиной приблизительно 80 т.п.н., которая содержала четыре полных R-ген-подобных последовательности в кластер-подобном размещении. Трансформация чувствительного сорта картофеля Agrobacterium tumefaciens выявила, что одна из этих четырех R-ген-подобных последовательностей соответствует Rpi-blb, что обеспечивает раса-неспецифическую устойчивость к фитофторозу. Характеристика этого гена Rpi-blb показала, что он является членом класса NBS-LRR R-генов растений. Самыми близкими функционально охарактеризованными последовательностями предыдущего уровня являются члены семейства генов устойчивости I2 в томатах. Эти последовательности имеют общую идентичность аминокислотной последовательности приблизительно 32% с последовательностью Rpi-blb.

Таким образом, в первом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, причем указанная нуклеиновая кислота кодирует генный продукт, имеющий последовательность Rpi-blb, или ее функциональный фрагмент, который способен обеспечивать член семейства Solanaceae раса-неспецифической устойчивостью против патогена из класса оомицетов.

Обеспеченное данным изобретением выделение гена, который кодирует желаемый признак устойчивости против фитофтороза, и последующая трансформация существующих сортов картофеля и томата этим геном обеспечивает теперь гораздо более прямой и более быстрый подход в сравнении с использующей интрогрессию селекцией. Обеспеченные здесь результаты предоставляют возможности дальнейшего исследования молекулярной основы взаимодействия растение-патоген, экологической роли R-генов в диком виде Мексиканского картофеля и являются применимыми для развития устойчивых сортов картофеля и томата с использованием генетической модификации.

В отличие от R-генов, клонированных и описанных до настоящего времени, ген, описанный здесь авторами данного изобретения, является первым выделенным R-геном из вида Solanum, который обеспечивает раса-неспецифическую устойчивость против патогена из класса оомицетов. Примечательно, что данное изобретение обеспечивает здесь нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает желаемую устойчивость видам Solanum, среди которых находится S. tuberosum. В частности, этот ген является первым геном, который был выделен из филогенетически отличающегося родственного вида культивируемого картофеля, S. bulbocastanum, для которого было показано с использованием анализов на комплементацию, что он является функциональным в S. tuberosum. Эти данные предполагают, что ген Rpi-blb может быть легко использован в получении картофеля без необходимости отнимающей много времени и трудоемкой селекции с использованием интрогрессии.

Для терминов, используемых в описании и примерах, даются следующие определения.

- Нуклеиновая кислота: двухцепочечная или одноцепочечная молекула ДНК или РНК.

- Олигонуклеотид: короткая одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты.

- Праймер: термин праймер относится к олигонуклеотиду, который может праймировать (служить затравкой) синтез нуклеиновой кислоты.

- Гомология: гомология является термином, используемым в отношении сходства или идентичности биологической информации последовательности. Гомология может быть обнаружена на уровне нуклеотидной последовательности и/или на уровне кодируемой аминокислотной последовательности. Для расчета процентной идентичности может быть использован алгоритм BLAST (Altschul et al., 1997 Nucl. Acids Res. 25:3389-3402), использующий параметры по умолчанию, или, альтернативно, алгоритм GAP (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453), использующий параметры по умолчанию, которые включены в пакет программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA. BLAST-поиски предполагают, что белки могут моделироваться в виде случайных последовательностей. Однако многие реальные белки содержат районы неслучайных последовательностей, которые могут быть гомополимерными участками, короткими периодическими повторами или районами, обогащенными одной или несколькими аминокислотами. Такие районы низкой сложности могут быть сопоставлены между неродственными белками даже в том случае, когда другие районы данного белка являются полностью несходными. Ряд программ-фильтров низкой сложности могут быть использованы для уменьшения таких сопоставлений низкой сложности. Например, фильтры низкой сложности SEG (Wooten and Federhen, 1993 Comput. Chem. 17:149-163) и XNU (Claverie and States, 1993 Comput. Chem. 17:191-201) могут использоваться по отдельности или в комбинации.

В применении здесь, термины «идентичность последовательности» или «идентичность» в контексте двух белковых последовательностей (или нуклеотидных последовательностей) включают в себя ссылку на остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при сопоставлении на максимальное соответствие на протяжении указанного окна сравнения. При использовании термина процент идентичности последовательности в отношении белков считается, что положения остатков, которые являются неидентичными, часто различаются консервативными аминокислотными заменами, где аминокислоты заменены другими аминокислотными остатками со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональные свойства данной молекулы. Когда последовательности отличаются по консервативным заменам, процентная идентичность последовательности может корректироваться в сторону повышения для коррекции на консервативный характер этих замен. О последовательностях, которые отличаются такими консервативными заменами, говорят, что они имеют «сходство последовательности» или «сходство». Способы выполнения подобных коррекций хорошо известны лицам с квалификацией в данной области. Обычно они включают в себя оценку в баллах (очках) консервативной замены как частичного, а не полного ошибочного спаривания, что увеличивает процентную идентичность последовательности. Так, например, если идентичной аминокислоте дается оценка 1, а неконсервативной замене дается оценка 0, консервативной замене дается оценка между 0 и 1. Оценку в баллах консервативных замен рассчитывают, например, в соответствии с алгоритмом Meyers and Miller (Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, 1988).

В применении здесь, «процентная идентичность последовательности» означает величину, определенную сравнением двух оптимально сопоставленных последовательностей на протяжении окна сравнения, где часть аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) в сравнении со ссылочной последовательностью, для оптимального сопоставления этих двух последовательностей. Процент рассчитывают определением числа положений, в которых идентичные остатки аминокислот или нуклеотидов встречаются в обеих последовательностях, с получением числа соответствующих (правильно спаренных) положений, делением числа правильно спаренных положений на общее число положений в окне сравнения и умножением результата на 100 для получения процентной идентичности последовательности. Предпочтительно, аминокислотная последовательность белка данного изобретения имеет по меньшей мере 82% или более высокую гомологию с последовательностью, изображенной на фиг.8. Как показано в таблице 4, самая близкая функционально охарактеризованная последовательность предыдущего уровня (члены кластера генов I2 Fusarium в томате) имеет гораздо более низкий уровень идентичности аминокислотной последовательности, чем указанный уровень (32% относительно Rpi-blb). Гомология в кластере генов данного изобретения варьируется между 70% и 81% на уровне аминокислотной последовательности.

Гомологичные последовательности нуклеиновых кислот являются последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими определенный выше гомологичный белок. Одним примером такой нуклеиновой кислоты является последовательность, приведенная на фиг.6А. Однако имеются многочисленные последовательности, которые кодируют белок, являющийся на 100% идентичным белку, изображенному на фиг.8. Это обусловлено «качелями» в триплетах нуклеотидов, где одну и ту же аминокислоту может кодировать не один триплет, а несколько («гипотеза качелей», т.е. нестрогого соответствия в третьем положении триплета). Таким образом, даже без влияния на аминокислотную последовательность белка нуклеотидная последовательность, кодирующая этот белок, может существенно варьироваться. Общепризнанным является то, что нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, которые не являются на 100% идентичными указанному белку, могут содержать даже еще больше вариаций. Таким образом, процентная идентичность на уровне последовательностей нуклеиновых кислот может варьироваться в более широких пределах, без отклонения от данного изобретения.

Промотор: термин «промотор» означает короткую ДНК-последовательность, с которой связываются РНК-полимераза и/или другие факторы инициации транскрипции перед транскрипцией ДНК, с которой функционально соединен этот промотор, позволяя иметь место транскрипции (т.е. запуская транскрипцию). Промотор обычно расположен слева (5') от кодирующей последовательности. В более широком смысле, термин «промотор» включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы, а также регуляторные элементы последовательности, локализованные в нескольких сотнях нуклеотидов, иногда даже более далеко расположенные от стартового сайта транскрипции. Такими регуляторнными последовательностями являются, например, последовательности, которые участвуют в связывании белковых факторов, регулирующих эффективность инициации транскрипции в ответ на физиологические условия. Район промотора должен быть функциональным в клетке-хозяине и предпочтительно соответствует району природного промотора гена устойчивости Rpi-blb. Однако может быть использован любой гетерологичный промоторный район, пока он является функциональным в клетке-хозяина, в которой экспрессия является желательной. Гетерологичный промотор может быть либо конститутивным, либо регулируемым, тканеспецифическим, либо не специфическим в отношении конкретной ткани. Конститутивный промотор, такой как промотор CaMV 35S или промотор Т-ДНК, хорошо известные специалистам с квалификацией в данной области, является промотором, который по существу не подвергается регуляции, такой как индукция или репрессия, но делает возможной постоянную и по существу неизменную транскрипцию ДНК-последовательности, с которой он функционально связан во всех активных клетках организма, при условии, что другие требования для того, чтобы транскрипция имела место, являются удовлетворенными. Можно использовать тканеспецифический промотор, который запускает экспрессию в тех частях растения, которые имеют тенденцию к заражению патогеном. В случае Phytophthora может быть использован промотор, который запускает экспрессию в листьях, например промотор ферредоксина. Регулируемым промотором является промотор, функция которого регулируется одним или несколькими факторами. Эти факторы могут быть либо такими, которые своим присутствием гарантируют экспрессию релевантной ДНК-последовательности, либо могут, альтернативно, быть такими, которые подавляют экспрессию этой ДНК-последовательности, так что их отсутствие заставляет экспрессироваться данную ДНК-последовательность. Таким образом, промотор и необязательно связанная с ним регуляторная последовательность могут активироваться присутствием или отсутствием одного или нескольких факторов для влияния на транскрипциию ДНК-последовательностей генетической конструкции данного изобретения. Подходящие промоторные последовательности и способы получения увеличенной транскрипции и экспрессии известны специалистам с квалификацией в данной области.

Терминатор: терминатор транскрипции служит для терминации транскрипции ДНК в РНК и предпочтительно выбран из группы, состоящей из терминаторных последовательностей транскрипции растений, терминаторных последовательностей транскрипции бактерий и терминаторных последовательностей вирусов растений, известных специалистам с квалификацией в данной области.

Ген: термин “ген” используется для указания ДНК-последовательности, которая участвует в получении полипептидной цепи и которая включает в себя районы, предшествующие кодирующему району и следующие за кодирующим районом (расположенные 5'- (слева) и 3' (справа) от кодирующего района последовательности)), а также промежуточные последовательности, так называемые интроны, которые расположены между отдельными кодирующими сегментами (так называемыми экзонами) или в 5'- или 3'-районе. 5'-район (выше по ходу транскрипции) может содержать регуляторную последовательность, которая регулирует экспрессию гена, обычно промотор. 3'-район (ниже по ходу транскрипции) может содержать последовательности, которые участвуют в терминации транскрипции гена, и необязательно последовательности, ответственные за полиаденилирование транскрипта, и 3'-нетранслируемый район. Термин “ген устойчивости” обозначает выделенную нуклеиновую кислоту данного изобретения, причем указанная нуклеиновая кислота кодирует генный продукт, который способен обеспечивать устойчивость растения против патогена, причем более конкретно, указанное растение является членом семейства Solanaceae (семейства пасленовых), более конкретно, картофелем или томатом, причем указанный патоген является, более конкретно, патогеном из класса оомицетов, более конкретно Phytophthora, еще более конкретно Phytophthora infestans, и указанная нуклеиновая кислота предпочтительно содержит последовательность, изображенную на фиг.8, или ее часть, или гомологичную последовательность, имеющую по существу одинаковые функциональные и структурные характеристики. Функционально эквивалентный фрагмент такого гена или нуклеиновой кислоты устойчивости, обеспеченный данным изобретением, кодирует фрагмент полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.8, или ее часть, или гомологичный и/или функционально эквивалентный полипептид, причем указанный фрагмент проявляет свойство обеспечения по меньшей мере частичной устойчивости к инфекции оомицетов, такой как инфекция, вызываемая P. infestans, при включении и экспрессии в растении или клетке растения.

Продукт гена устойчивости: обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.8, или ее часть, или гомологичный и/или функционально эквивалентный полипептид, проявляющий свойство обеспечения по меньшей мере частичной устойчивости к инфекции оомицетов, такой как инфекция, вызываемая P. infestans, при включении и экспрессии в растении или клетке растения.

Функциональными эквивалентами белка данного изобретения являются белки, которые являются гомологичными белку, изображенному на фиг.8, или полученными из белка, изображенного на фиг.8, заменой, добавлением и/или делецией одной или более аминокислот, но все еще сохраняющие их активность в придании устойчивости к патогену. Такие эквиваленты могут быть легко получены конструированием белка in vivo, например, изменением открытой рамки считывания, способной кодировать этот белок, таким образом, что при этом происходит действие на эту аминокислотную последовательность. Пока эти изменения в аминокислотных последовательностях не уничтожают полностью эту активность данного белка, такие эквиваленты включены в данное изобретение. Далее, должно быть понятно, что эквиваленты должны быть получаемыми из белка, изображенного на фиг.8, при сохранении биологической активности, т.е. все или большая часть промежуточных продуктов между эквивалентным белком и белком, изображенным на фиг.8, должна иметь активность устойчивости к патогену. Большая часть означает 30% или более промежуточных продуктов, предпочтительно 40% или более, более предпочтительно 50% или более, еще более предпочтительно 60% или более, более предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 99% или более.

Предпочтительными эквивалентами являются эквиваленты, в которых богатый лейцинами повторяющийся район является высокогомологичным с LRR-районом, показанным на фиг.8. Другими предпочтительными эквивалентами являются эквиваленты, в которых N-концевой эффекторный домен является по существу одинаковым с эффекторным доменом Rpi-blb.

Белок данного изобретения содержит особый N-концевой эффекторный домен и богатый лейцином повторяющийся домен. Авторы считают, что консервативность этих районов является существенной для функции этого белка, хотя допустима некоторая изменчивость. Однако другие части этого белка являются менее важными для этой функции и могут быть более восприимчивыми к изменению.

Для обеспечения быстрого и простого испытания, способны ли модифицированные белки и/или генные конструкции к экспрессии указанных модифицированных белков, описанных здесь, или могут ли любые новые конструкции, которые являются очевидными для лиц с квалификацией в данной области после прочтения этой заявки, приводить к реакции устойчивости, специалист в данной области может выполнять быстрый тест транзиторной экспрессии, известный под названием АТТА (тест транзиторной экспрессии с использованием Agrobacterium tumefaciens). В этом анализе (подробное описание которого может быть найдено в Van den Ackerveken, G., et al., Cell 87, 1307-1316, 1996) нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок, который должен быть испытан, помещают под контроль промотора CaMV 35S и вводят в штамм Agrobacterium, который используют также в протоколах для стабильной трансформации. После инкубирования этих бактерий с ацетосирингоном или любым другим фенольным соединением, о котором известно, что оно усиливает перенос Т-ДНК Agrobacterium, 1 мл культуры Agrobacterium инфильтрируют в лист растения in situ (например, из растения табака или картофеля) инъекцией, после чего эти растения помещают в оранжерею и инфицируют патогеном, предпочтительно P. infestans. Спустя 2-5 дней листья оценивают на появление симптомов устойчивости.

В данном изобретении авторы идентифицировали и выделили ген устойчивости Rpi-blb, который придает раса-неспецифическую устойчивость к P. infestans. Этот ген клонировали из генотипа Solanum bulbocastanum, который является устойчивым к P. infestans. Этот выделенный ген устойчивости данного изобретения может быть перенесен в чувствительное растение-хозяина с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации или любым известным способом трансформации, и он может участвовать в придании этому растению-хозяину устойчивости к патогенам растений, в частности, к P. infestans. Растением-хозяином может быть картофель, томат или любое другое растение, в частности, член семейства Solanaceae, которое может быть инфицировано таким патогеном растения. Данное изобретение обеспечивает также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую этот белок или его функциональный эквивалент, предпочтительно содержащий ген Rpi-blb, который изображен на фиг.6.

С использованием белка устойчивости Rpi-blb или его функционально эквивалентного фрагмента данного изобретения специалист имеет эффективное средство борьбы против патогенов растений, так как ген, кодирующий этот белок, может быть использован для трансформации чувствительных генотипов растений с получением таким образом генетически трансформированных растений, имеющих уменьшенную чувствительность или предпочтительно являющихся устойчивыми к патогену растения. В частности, растение, генетически трансформированное геном устойчивости Rpi-blb данного изобретения, имело уменьшенную чувствительность к P. infestans.

В предпочтительном варианте ген устойчивости Rpi-blb содержит кодирующую последовательность, приведенную на фиг.6А, или любую гомологичную последовательность или ее часть, перед которой находится промоторный район и/или за которой следует терминаторный район. Этот промоторный район должен быть функциональным в клетках растений и предпочтительно соответствовать природному промоторному району гена Rpi-blb. Однако может быть также использован промоторный район, который является функциональным в клетках-растениях, вместе с кодирующими последовательностями.

Кроме того, данное изобретение относится также к белку устойчивости Rpi-blb, который кодируется геном Rpi-blb данного изобретения и который имеет аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.8, или ее функциональный вариант.

Сигнал, который запускает экспрессию гена устойчивости в S. bulbocastanum дикого типа или в трансгенных растениях данного изобретения, обусловлен, возможно, присутствием патогена, более конкретно, патогена P. infestans. Такие системы известны для других взаимодействий патоген-растение (Klement, Z., In: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, eds.: Mount, M.S. and Lacy, G.H., New York, Academic Press, 1982, pp. 149-177), и эта система может быть использована для увеличения применимости белка устойчивости с получением устойчивости к большему числу патогенов (см. ЕР 474857). Эта система позволяет использовать соединение-«элиситор», полученное из патогена, соответствующий ген устойчивости, причем этот ген устойчивости при активации в присутствии элиситора мог бы приводить к локальной смерти клеток (реакция гиперчувствительности). В случае гена устойчивости данного изобретения соответствующий элиситорный компонент еще не был обнаружен, но авторы считают, что это может быть достигнуто специалистом в данной области. После выделения этого элиситорного компонента можно будет трансформировать ген, кодирующий указанный элиситор, вместе с геном, кодирующим белок устойчивости, в растение, посредством чего один из этих генов находится под контролем индуцируемого патогеном промотора. Эти промоторы хорошо известны в данной области (например, prp1, Fis1, Bet v 1, Vst1, gstA1 и промотор сесквитерпенциклазы, но может быть использован любой индуцируемый патогеном промотор, который включается после инфицирования патогеном). Если трансгенное растение содержит такую систему, то атака патогена, которая может запускать индуцируемый патогеном промотор, будет вызывать продуцирование компонента, который находится под контролем указанного промотора, и это, вместе с другим компонентом, экспрессируемым конститутивно, будет вызывать возникновение реакции устойчивости.

Можно также мутировать белок устойчивости, заставляя его находиться в активированном состоянии (см. ЕР 1060257). Поскольку это могло бы перманентно приводить к возникновению реакции устойчивости, которая в конечном счете ведет к локальной смерти клеток, следует заботиться о том, чтобы не произошла конститутивная экспрессия белка устойчивости. Это может выполняться помещением мутированного белка устойчивости под контроль индуцируемого патогеном промотора, который будет не только позволять экспрессию активного белка устойчивости только в моменты атаки патогена, но сделает возможным также более широкий спектр патогенов для индукции гиперчувствительной реакции. Мутация остатков треонина и серина в остатки аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты часто приводит к активации, как показано в случае многих белков, активность которых модулируется фосфорилированием, например, в cлучае MAPK-активируемого белка (Engel et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 27213-27221) и в случае МАР-киназа-киназного белка (Huang et al., 1995 Mol. Biol. Cell 6, 237-245). С- и N-концевые, а также внутренние делеционные мутанты этих белков могут быть также испытаны на подходящие мутанты.

Более косвенный путь идентификации представляющих интерес мутантов, конститутивная активность которых является индуцированной, использует размножение кодирующей этот белок ДНК в так называемых «мутаторных» штаммах E. coli.

Быстрым способом тестирования всех полученных мутантов на их пригодность для индукции гиперчувствительной реакции является использование так называемого АТТА-анализа (Van den Ackerveken, G., et al., Cell 87, 1307-1316, 1996). Многочисленные мутанты могут быть подвергнуты скринингу без значительных усилий для идентификации мутантов, которые будут индуцировать HR после экспрессии.

Данное изобретение обеспечивает также вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную здесь, причем указанная нуклеиновая кислота кодирует генный продукт, который способен обеспечивать член семейства Solanaceae устойчивостью против патогена из класса оомицетов, или функционально эквивалентную выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, в частности, когда указанный член включает в себя S. tuberosum или Lycopersicon esculentum.

Данное изобретение обеспечивает также клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту или вектор данного изобретения. Пример указанной клетки-хозяина обеспечен здесь в подробном описании. В конкретном варианте указанная клетка-хозяин содержит клетку растения. В качестве клетки-растения пре