Способ получения функционально активного рекомбинантного белка летального фактора язвы (lf), рекомбинантная плазмидная днк pethis-lf, кодирующая активный белок lf и штамм escherichia coli bl-hislf, продуцирующий активный белок летального фактора сибирской язвы

Способ получения функционально активного рекомбинантного белка летального фактора язвы (lf), рекомбинантная плазмидная днк pethis-lf, кодирующая активный белок lf и штамм escherichia coli bl-hislf, продуцирующий активный белок летального фактора сибирской язвы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области генной инженерии, касается способа получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы LF, рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТНIS-LF, кодирующей активный белок летального фактора сибирской язвы LF, и штамма бактерий Escherichia coli, продуцирующего активный белок летального фактора сибирской язвы.

Летальный фактор сибирской язвы (LF), наряду с протективным антигеном (РА), представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инвазии. Основными областями применения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств, в частности разработка диагностических китов для раннего определения и фармацевтических препаратов для терапии сибиреязвенной инфекции и вакцинации против сибирской язвы. Это может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы.

Сибирская язва - это инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами грамположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютамовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn²⁺-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства киназ митогенакивируемых протеин киназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры.

Летальный фактор сибирской язвы является белком с молекулярной массой 90 кДа, структурно составленным из четырех доменов с преимущественно спиральной структурой. Домен 1 состоит из 12 спиральных участков, уравновешивающих четырехцепочечный слой. Этот домен связывается с протективным антигеном. Домен 2 сходен со вторым доменом токсина VIP2 Bacillus cereus, однако не обладает его каталитическими радикалами. Внутри последовательности домена 2 находится последовательность домена 3. Этот домен составлен из повторов, которые возникли в результате дупликапии последовательности, изначально принадлежавшей домену 2. Домен 4 - это каталитически активная протеаза. Бета-слой и шесть альфа-спиралей формируют структуру, сходную с той, которая существует у другой металлопротеазы, термолизина. Связывание субстратного белка семейства МАРКК происходит в углублении между доменами 3 и 4. Активный центр фермента составлен аминокислотным радикалом Glu₆₈₇ за молекулой воды и атомом цинка, связанным с радикалами His₆₈₆, His₆₉₀, Туr₇₂₈ и Glu₇₃₅ (Pannifer AD, Wong TY, Schwarzenbacher R, Renatus M, Petosa C, Bienkowska J, Lacy DB, Collier RJ, Park S, Leppla SH, Hanna P, Liddington RC. (2001) Nature, 414, 229-233).

Известен способ выделения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы (Gupta P, Batra S, Chopra АР, Singh Y, Bhatnagar R. (1998) Infect Immun, 66(2), 862-865), в котором используют экспрессионную конструкцию на основе плазмиды pQE30, проэкспрессированную в штамме Е.coli SG 13009. Недостатком продукции белка с использованием этой конструкции является то, что более 40% белка находится в деградированном состоянии (видимо, в силу расщепления протеазами E.coli), что, безусловно, снижает выход белка при использовании данной конструкции. Большая исходная степень деградации белка приводит к тому, что требуется три стадии очистки белка для получения гомогенного продукта. В используемой экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Известен наиболее близкий к заявленному генно-инженерный способ получения мутантного белка LF с использованием конструкции на основе рЕТ30 под контролем промотора фага Т5 в экспрессионных штаммах E.coli (патент РФ №2287581, опубл. 20.11.2006). Полученный таким образом белок и его мутанты используют для разработки вакцин против сибирской язвы. Однако известно, что рекомбинантный белок LF, синтезируемый с применением использованной конструкции имеет до 40% деградации. В запатентованной экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Изобретение решает задачу создания продуцента и получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы с высоким выходом, низкой степенью деградации, легко детектируемого и по упрощенной технологии с использованием двух стадий хроматографической очистки вместо трех.

Поставленная задача решается за счет рекомбинантной плазмидной ДНК pETHIS-LF, обеспечивающей синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющей молекулярную массу 5,15 МДа, состоящей из BamHI-NdeI фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+); синтетической последовательности, кодирующей шесть гистидинов и пептид c-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность полноразмерного летального фактора сибирской язвы, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pETHIS-LF клеток Escherichia coli к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, StuI 1572 пн, XhoI 1625 пн, BcoI 1625 пн.

Также за счет штамма Escherichia coli BL-LFHIS, продуцирующего гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, слитый с последовательностью шести гистидинов и пептидом с-myc.

А также за счет способа получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающего трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7.4, содержащем протеазный ингибитор с последующей очисткой целевого продукта металл-хелатной хроматографией и гель-фильтрацией.

Техническим результатом изобретения является получение в очищенном виде и с высоким выходом (до 95% чистоты, до 100 мг с литра бактериальной культуры без ферментации) гомогенного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы по упрощенной технологии, предусматривающей две стадии хроматографии вместо трех.

Для повышения уровня продукции и снижения степени деградации белка LF в качестве базовой конструкции применяют плазмиду с промотором Т7 полимеразы, содержащую в своем составе последовательность, соответствующую пептиду с-myc для детекции продукта, и последовательность шести гистидинов для эффективной очистки синтезируемого белка. Для получения базовой векторной конструкции pETNHIS в плазмиду pET22b(+) (Novagen), не содержащую сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) по сайтам рестрикции NdeI и BamHI вводят фрагмент ДНК, синтезированный полимеразной цепной реакцией, кодирующий последовательность шести гистидинов и пептид с-myc.

В полученную описанным способом плазмиду pETNHIS по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI клонируют полноразмерный ген летального фактора сибирской язвы, расщепленный по внесенным при амплификации фрагмента в составе праймеров концевым сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI (это возможно, поскольку при щеплении рестриктазы XhoI и SalI образуют совместимые липкие концы).

Полученную экспрессионную конструкцию pETHIS-LF трансформируют в штамм E.coli BL21(DE3) и экспрессируют в среде 2xYT. Выход рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы высокой степени чистоты (97%) после двух стадий хроматографической очистки достигает 15% относительно суммарного белка клетки.

Полученный продукт детектируют специфическими антителами к пептиду с-myc.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BLHIS-LF, содержащий плазмидную ДНК pETHIS-LF и являющийся суперпродуцентом рекомбинантного белка LF.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pETHIS-LF обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в них гена летального фактора сибирской язвы.

Ген летального фактора сибирской язвы получен полимеразной цепной реакцией с ДНК бактерии сибирской язвы в Государственном Научном Центре Прикладной микробиологии (ФГУН ГНЦПМБ).

Концевые участки гена, содержащие соответствующие применному вектору сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI, введены с помощью полимеразной цепной реакции с синтетическими олигонуклеотидными праймерами LFBamHI, LFSalI (фиг.1), а затем ген клонирован в векторной плазмиде pETNHIS.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL-HISLF характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, неспороносные, грамотрицательные.

Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре образуют круглые, мутные желто-серые колонии со слегка неровным краем, диаметром до 3 мм. При росте на жидких средах (LB, 2xYT) образуют интенсивную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме 37°С и оптимальных значениях рН от 7 до 7.5. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы, глицерин. В качестве источника азота могут использовать как органические соединения (аминокислоты, дрожжевой экстракт, триптон и др.), так и неорганические минеральные соли в аммонийной форме.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда (до 100 мкг/мл).

Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток E.coli соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Штамм BL-HISLF является суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-галактозидом происходит эффективный синтез целевого белка LF, который накапливается в цитоплазме клеток в растворимом состоянии и составляет до 50% суммарного белка клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pETHIS-LF, содержащую последовательность полноразмерного гена летального фактора сибирской язвы. Для этого полноразмерный ген летального фактора сибирской язвы получают полимеразной цепной реакцией с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (фиг.1). Праймеры содержат сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI (N-конец гена, праймер LFBamHI) и SalI (С-конец гена, праймер LFXhoI), полученную ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами рестрикции и затем лигируют с расщепленной по сайтам BamHI и XhoI векторной плазмидной ДНК pETNHIS. На фиг.2 представлена последовательность гена полноразмерного летального фактора сибирской язвы. На фиг.3 изображена последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETHIS-LF.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli DH12S или другие клетки, не содержащие DE3 лизогена и собственной устойчивости к антибиотикам пенициллинового ряда, и высевают на 2xYT-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют на наличие плазмиды, содержащей ген LF полимеразной цепной реакцией с праймеров LFBamHI и LFSalI. Из клонов, ПЦР которых приводит к образованию фрагмента нужной длины при анализе продуктов реакции агарозным гель-электрофорезом, выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Встраивание фрагмента подтверждают секвенированием плазмидной ДНК. Полученную рекомбинантную плазмидную ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E.coli BL21(DE3), полученные клоны анализируют на уровень экспрессии целевого белка и отбирают штамм-продуцент.

Штамм-продуцент E.coli BL-LFHIS выращивают на богатой среде (2×YT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С.

Клетки из экспрессионной культуры собирают центрифугированием при 5000 об/мин и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при 4°С в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCL рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl₂ до концентрации 5 мМ и разрушают ДНК ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку. Первая стадия хроматографической очистки проводится на металл-хелатном сорбенте. Вторая стадия очистки осуществляется на гель-фильтрационной колонке в буфере, содержащем 30 мМ трис-НСl рН 7.4 и 70 мМ NaCl. Фракции, содержащие очищенный LF, определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и замораживают для хранения на -70°С.

Детекцию продукта осуществляют с помощью иммуноблота с антителами, специфичными к пептиду с-myc.

Активность полученного рекомбинантного летального фактора сибирской язвы измеряют с использованием специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы и содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия) по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре. Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С.

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

фиг.1 - праймеры для амплификации гена летального фактора сибирской язвы;

фиг.2 - последовательность гена полноразмерного летального фактора сибирской язвы и его фрагмента без домена I;

фиг.3 - последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETHIS-LF.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pETNHIS-LF

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3' к 5' концу с помощью защищенных фосфамидитов (5'диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-О-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов), активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0.5-0.7 мкМ, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкМ/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК 3 мкг плазмиды pETNHIS обрабатывают в 20 мкл буфера для BamHI (фирма New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы рестрикции BamHI, а затем в 20 мкл буфера 2 (New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы XhoI (фирма New England Biolabs). Рестрикция проводится 1 час при 37°С. Векторный фрагмент длиной 6,09 т.п.о. после электрофореза в агарозном геле помещают в диализный мешочек с максмальной пропускной способностью пор 12-14 кДа и элюируют под действием тока в трис-боратном буфере для электрофореза, а затем обрабатывают смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена LF проводят ПЦР-амплификацию, используя в качестве матрицы бактериальную ДНК сибирской язвы 0.05 мкг в образце, а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А и В (по 20 рМ каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0.5 мМ и 1 ед. активности Pfu-полимеразы (фирма Promega). ПЦР проводят в режиме, предусматривающем 1 минуту денатурации при 95°С, отжиг 30 секунд при 57°С, элонгацию - 40 секунд при 72°С, 25 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют смесью фенол-хлороформ (1:2) и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл воды и расщепляют эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI (реакция с эндонуклеазой рестрикции SalI производства Fermentas проводится в буфере О Fermentas). Целевой фрагмент выделяют элюцией из агарозного геля.

0,5 мкг полученного синтетического фрагмента гена рекомбинантного летального фактора сибирской язвы прибавляют к раствору 0,2 мкг описанного выше векторного фрагмента и лигируют в 10 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7.6, 10 мМ MgCl₂, 0.2 мМ АТР, 10 мМ дитиотрейтита и 10 ед. активности Т4-ДНК лигазы в течение 4 часов при 16°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации электропорацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 кB) электрокомпетентных клеток E.coli DH12S. Трансформанты высевают на чашки с 2xYТ-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью ПЦР-амплификации в тех же условиях, что и получение фрагмента ДНК для клонирования, используя в качестве матрицы клетки единичной бактериальной колонии, содержащей плазмиду. Положительные клоны идентифицируются по наличию фрагмента длиной 2340 пн при анализе ПЦР-смеси электрофорезом в агарозном геле. Из отобранных клонов выделяют ДНК плазмиды pETNHIS-LF, используя метод щелочного лизиса.

Пример 2

Получение штамма-продуцента E.coli BL-LFHIS и определение его продуктивности

Штамм-продуцент E.coli BL-LFHIS получают трансформацией электрокомпетентных клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pETHIS-LF, как описано в примере 1. Единичные клоны BL21(DE3), несущие плазмиду pETHIS-LF, экспрессируют в аналитическом количестве (по 5 мл). Для этого E.coli BL-LFHIS выращивают на богатой среде (2xYT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С. Анализируют уровень экспрессии белка летального фактора сибирской язвы денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и иммуноблотом с антителами против пептида с-myc. Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Для постановки иммуноблота мембрану Hybond С+ и гель на 10 минут замачивают в буфере, содержащем 38.6 мМ глицина, 47.9 мМ трис-основание, 0,0385% додецилсульфата натрия, 20% метанола. Перенос ведут при силе тока 1 мА на см геля. Блокировка мембраны после переноса осуществляется 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS рН 7,4, содержащим 0.05% Tween. Блокированная мембрана инкубируется с антителами с-myc (клон CRL-1725, АТСС) при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе PBS, содержащем 0.5% БСА, и после отмывки первичного антитела смесью PBS-0.05% Tween 20 мембрана инкубируется ночь с пероксидазным коньюгатом антитела к мышиным антителам. Отмытый блот проявляют с использованием субстрата пероксидазы хлоронафтола. Клоны, дающие наибольший выход белка, являются суперпродуцентами, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают на -70°С для хранения.

Для препаративной экспрессии штаммы суперпродуцента E.coli BL-LFHIS выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 2% глюкозы, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина в течение, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 25°С, добавляют ИПТГ до 1 мМ и проводят экспрессию 6 часов при 25°С. Далее клетки собрают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°С.

Пример 3

Очистка белка летального фактора, полученного с использованием конструкции pETHIS-LF, и определение его активности

Клетки из экспрессионной культуры суспендируют в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCL рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при +4°С в течение 30 минут. Лизируют клетки добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl₂ до концентрации 1 мМ и разрушают геномную ДНК E.coli ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку с металл-хелатным сорбентом с иммобилизованным ионом кобальта (Talon, Clontech) в буфере, содержащем 20 мМ Na₂HPO₄ рН 8.3 и 70 мМ NaCl. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок раствором, содержащим 200 мМ имидазола в том же буфере. Вторая стадия очистки осуществляется на гель-фильтрационной колонке Superdex 200 в буфере, содержащем 30 мМ трис-НСl рН 7.4 и 70 мМ NaCl. Фракции, содержащие очищенный LF, определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2, и замораживают для хранения на -70°С. Чистота перапарата составляет 95% по данным денситометрии. Выход рекомбинантного белка летального фактора составляет 30 мг с литра культуры после полной процедуры очистки.

Протеолитическая активность полученного препарата оценивается по расщеплению специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы, содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия), по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре (Тесап). Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С. Кинетические параметры щепления субстрата полученным летальным фактором сибирской язвы составляют k_cat/К_M=4.15±0.7 с^-1 мкМ^-1.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETHIS-LF, обеспечивающая синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 5,15 МДа, состоящая из: BamHI-NdeI фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+); синтетической последовательности, кодирующей шесть гистидинов и пептид с-mус, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность полноразмерного летального фактора сибирской язвы, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pETHIS-LF клеток Escherichia coli к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эвдонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, StuI 1572 пн, XhoI 1625 пн, BcoI 1625 пн.

2. Штамм Escherichia coli BL-LFHIS, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, слитый с последовательностью шести гистидинов и пептидом с-mус.

3. Способ получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающий трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7,4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта металл-хелатной хроматографией и гель-фильтрацией.