Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства

Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства

Реферат

Заявляемое изобретение относится к фармацевтике и медицине, конкретно к регенерирующему средству на основе коменовой кислоты и способу лечения хориоретинальных дистрофий с помощью этого средства.

Заявляемое изобретение может быть использовано для производства высокоэффективных синтетических не пептидной природы регенерирующих противовоспалительных препаратов, которые, в свою очередь, могут быть применены в медицине и ветеринарии для лечения хориоретинальных дистрофий различного генеза, в том числе туберкулезного характера.

Регенерирующие средства объединяют лекарственные препараты различных фармакологических групп, способные направленно влиять на процессы пролиферации, регенерации и уровень метаболизма.

Нормальная жизнедеятельность организма сопровождается непрерывным процессом замены отмирающих клеток и тканей, получившим название физиологической регенерации. Разные ткани отличаются по способности к восстановлению (регенерации), которая тем выше, чем большую роль играет физиологическая регенерация в структуре и функционировании ткани. Клетки крови, слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, покровного эпителия кожи и др. быстро обновляются и поэтому ткани, которые они формируют, характеризуются высоким потенциалом регенерации. Напротив, у нейронов и мышечных клеток потенциал регенерации минимален (приближается к нулевому). Под влиянием возраста, сопутствующих заболеваний, токсических и экологических факторов, радиации процесс физиологической регенерации может затормаживаться. Аналогичным эффектом обладают некоторые лекарственные средства, в т.ч. иммунодепрессанты, противоопухолевые препараты, кортикостероиды, некоторые антибиотики и НПВС и др. Угнетение процесса физиологической регенерации сопровождается развитием нарушений обменных процессов, возникновением лейко- и тромбоцитопении, анемии, поражением слизистых оболочек, в т.ч. желудочно-кишечного тракта и др. Лекарственные средства, способные увеличивать скорость и интенсивность физиологической регенерации получили название стимуляторов регенерации, или регенерантов.

Восстановление участков тканей и органов, погибших в результате травм, повреждений или дистрофии (интоксикации, гипоксия, инфекции и др.) представляет собой процесс репаративной регенерации. Соответственно, препараты, обладающие способностью стимулировать репаративную регенерацию - репарантами (Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т.1, с.145). В итоге репарации происходит замещение очагов некроза специфической и/или соединительной (имеет самый высокий потенциал регенерации) тканью.

Общий механизм регенеративного действия включает усиление биосинтеза пуриновых и пиримидиновых оснований, РНК, функциональных и ферментативных клеточных элементов, в т.ч. фосфолипидов мембран, а также стимуляцию редупликации ДНК и деления клеток. Следует заметить, что процесс биосинтеза в ходе как физиологической, так и репаративной регенерации нуждается в субстратном обеспечении (незаменимые амино- и жирные кислоты, микроэлементы, витамины). Кроме этого, процесс биосинтеза белков и фосфолипидов отличается высокой энергоемкостью и его стимуляция требует соответствующего энергообеспечения (энергетические материалы). К таким средствам, субстратно и энергетически обеспечивающим протекание процессов регенерации, относятся актовегин, солкосерил и др. Эффект этих препаратов и собственно регенерирующего процесса зачастую трудно дифференцировать.

В соответствии с локализацией действия (и задачами фармакотерапии) стимуляторы регенерации и репарации условно подразделяются на общеклеточные (универсальные) и тканеспецифические. К общеклеточным стимуляторам, действующим на любую регенерирующую ткань, относятся анаболические стероиды, нестероидные анаболики - натрия дезоксирибонуклеат (Деринат), метилурацил, инозин и др. и витамины пластического обмена Тканеспецифические стимуляторы процесса регенерации представляют собой препараты с разным механизмом действия, объединенные в подгруппы по избирательному действию на ту или другую ткань или систему органов (Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т.1, т.2). Наиболее известными препаратами для лечения хориоретинальных дистрофий являются глутоксим, кортексин, фезам, эмоксипин. все они имеют ряд ограничений в применении из-за аллергических реакций.

Ряд заболеваний, в частности, в офтальмологической практике, приводит к инвалидизации большого числа пациентов, а лечение остается чисто симптоматическим. Повышение эффективности лечения больных с патологией сетчатки является одной из основных задач современной офтальмологии и требует поиска и разработки новых медикаментозных препаратов. В последние годы большое внимание уделяется биорегулирующей терапии, обладающей органотропностью и патогенетической направленностью действия. Свойства данной группы препаратов обусловлены участием пептидов в белковом синтезе, регуляции клеточного метаболизма в пептидном процессинге (отщепление необходимых аминокислотных последовательностей). Множественность регуляторных систем организма предполагает наличие универсальных посредников - регуляторных пептидов. Они необходимы для передачи информационных сигналов между клетками и участвуют в поддержании структурного и функционального гомеостаза клеточных популяций. В основу функционирования биологической регуляции положен принцип пептидного каскада. Одним из наиболее эффективных препаратов данной группы является зарегистрированный в 1999 году регенерант и репарант сетчатки - ретиналамин. Ретиналамин (комплекс полипептидных фракций из сетчатки глаз крупного рогатого скота или свиней) оказывает тканеспецифическое регенерирующее действие на сетчатку глаза (И.Б.Максимов, Л.К.Мошетова, С.А.Савостьянова. Ретиналамин в комплексном лечении инволюционных центральных хориоретинальных дистрофий. СПб., 2006, 96 с.). Известный препарат выбран в качестве прототипа для заявляемого регенерирующего средства. Он представляет собой комплекс пептидов пара- и аутокринной природы размером от 1000 до 10000 Да, выполняющий функцию внутри- и межклеточного мессенджера. Относится к группе цитомединов. Выпускается в форме лиофилизированного порошка во флаконах по 5 мг ретиналамина в каждом. Используется ретиналамин в разведенном виде как прозрачный бесцветный водный раствор для парабульбарных и внутримышечных инъекций. Сложный состав ретиналамина не позволяет произвести обычный фармакокинетический анализ отдельных компонентов. Таким образом, фармакокинетическое исследование ретиналамина не проведено, что является явным недостатком препарата. Специфическое действие известного препарата направлено на стимуляцию фоторецепторов и клеточных элементов сетчатки, улучшение функционального взаимодействия пигментного эпителия и наружных сегментов фоторецепторов, ускорение восстановления световой чувствительности сетчатки. Неспецифическое действие ретиналамина проявляется в нормализации проницаемости сосудов, уменьшении различных проявлений воспалительной реакции, стимуляции репаративных процессов в сетчатке глаза. Ретиналамин обладает метаболическим и ретинопротективным действием, оказывает биорегулирующее влияние на орган зрения и тканеспецифичное действие на сетчатку глаза. Препарат противопоказан при индивидуальной непереносимости и беременности. При применении по показаниям в рекомендуемых дозах побочное действие не выявлено. Лекарственное взаимодействие препарата ретиналамин с другими лекарственными средствами не описано. Ретиналамин хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 2° до 20°С. Срок годности - 2 года. В растворе препарат не стабилен, поэтому его хранят в виде порошка и разводят непосредственно перед инъекцией. Это существенный недостаток известного препарата. Препарат отпускается по рецепту врача.

Способ лечения с использованием ретиналамина выбран в качестве способа-прототипа. Ретиналамин применяют для лечения центральной хориоретинальной дистрофии сетчатки глаза (ЦХРД), диабетической ретинопатии, тапеторетанальной абиотрофии. В постоперационном периоде ретиналамин примененяется у пациентов с отслойкой сетчатки, при лазерной гиперкоагуляции, у пациентов с инволюционной ЦХРД. Рекомендовано использование препарата при лечении тромбоза центральной вены сетчатки и профилактике ретромбоза, а также хориоретинитах различной этиологии. Препарат вводят взрослым (для детей рекомендации относительно использования препарата пока не имеется) парабульбарно или внутримышечно однократно ежедневно (содержимое флакона растворяют в 1-2 мл 0,5%-ного раствора новокаина или воды для инъекций, или изотонического раствора натрия хлорида) - по 5-10 мг в сутки в течение 5-10 дней (при необходимости повторный курс через 3-6 мес.). Несколько отсроченный эффект терапии и стойкость результата обусловлены эффектом пептидного каскада. Известный препарат, как установили авторы изобретения в ходе специально поставленных опытов, не влияет на эффективность комплексной противотуберкулезной терапии при лечении хориоретинитов туберкулезного характера.

Общим недостатком известных методов является то, что они вызывают серию побочных эффектов в отношении сердечно-сосудистой, иммунной, дыхательной, репродуктивной систем и отрицательно влияют на печень и почки пациентов.

Из приведенного выше анализа следует, что из-за сложности механизма процесса регенерации в организме и неочевидности регуляции действия компонентов известных препаратов, прежде всего пептидных, вызываемых ими побочных эффектов, проблема разработки универсальных синтетических регенерирующих препаратов остается актуальной.

Задачей настоящего изобретения является создание высокоэффективного синтетического регенерирующего средства, не пептидной природы, не имеющего негативных побочных фармакологических эффектов, присущих известным аналогам, и способов лечения хориоретинальной дистрофии различной этиологии с использованием этого средства.

Эта задача решается заявляемой группой из трех изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, - регенерирующим средством на основе коменовой кислоты и двумя способами лечения с помощью этого средства.

Заявляемая композиция характеризуется следующей совокупностью существенных признаков:

1. Регенерирующее противовоспалительное средство, представляющее собой водный раствор активного начала - коменовой кислоты и вспомогательного вещества - натрия гидрокарбоната, при следующем соотношении компонентов, в мас.%:

коменовая кислота -	1-2, преимущественно 1 и 2,
натрия гидрокарбонат -	0,55-1,1,

вода для инъекций - до 100.

2. Регенерирующее противовоспалительное средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит примесь коменовой кислоты бензилкоменовую кислоту - в количестве не более 2,5% в пересчете на коменовую кислоту.

Совокупность существенных признаков заявляемого изобретения обеспечивает получение технического результата: созданное регенерирующее противовоспалительное средство предназначено для стимуляции гуморального иммунитета, повышающего фагоцитарную активность макрофагов на фоне эмоционального стресса, проявляет противовоспалительные и антиоксидантные свойства, повышает эффективность стандартной противотуберкулезной терапии, проявляет нейроретинопротекторные и ретиностимулирующие свойства и блокирует токсические эффекты препаратов группы сердечных гликозидов, нейротрофические и трофические свойства препарата тканеспецифичны. Согласно данным доклинических исследований и экспертной оценке у него отсутствуют негативные побочные эффекты. Заявляемое средство в терапевтических дозах не влияет на сердечно-сосудистую систему, формулу крови, дыхательную систему, эмбриогенез, не стимулирует терратогенез, не вызывает аллергии, не влияет на репродуктивную функцию, не стимулирует опухолевый рост. Нейротоксические эффекты у заявляемого средства отсутствуют. Высокие значения таких показателей, как клиренс (450-500 мл/кг/ч) и стационарный объем распределения (2.5 л/кг) свидетельствуют о том, что заявляемое средство очень активно распределяется из системного кровотока. Большая часть препарата, не выводится, а подвергается метаболизму и утилизируется в самом организме. Последнее дает возможность рекомендовать использование заявляемого средства у пациентов с почечной и печеночной недостаточностью. Фармакокинетическое исследование заявляемого средства, проведенное авторами, делает использование заявляемого средства, более предпочтительным, поскольку фармакокинетический анализ препарата-прототипа ретиналамина не проведен. Специфические фармакологические свойства заявляемого средства реализуются после внутривенного, или парабульбарного (при лечении ретинопатий различного генеза) введения через 5-7 мин. Действующая субстанция - коменовая кислота - технологически доступна. Исследование острой и подострой токсичности показали, что средство (лекарственная форма в виде 1 и 2% растворов для инъекций в ампулах 1, 2, 5 мл) относится к V классу практически нетоксичных соединений. Заявляемое средство не вызывает привыкания и зависимости, проникает через гематоэнцефалический барьер. Заявляемое средство является стабильным в виде раствора для инъекций. При хранении в естественных условиях степень его разложения составляет около 1% в год. На основании этих данных срок годности установлен на 2 года.

Создание заявляемого средства стало возможным, благодаря изучению авторами изобретения элементов тонкого механизма воздействия веществ, способных образовывать хелатные комплексы с ионами кальция и магния, проявляющих протвовоспалительные свойства, тканеспецифичные трофические и нейротрофические свойства, направленно регулирующие процессы кодирования ноцицептивной информации в центральной нервной системе, не имеющих побочных эффектов в отношении жизненно важных функций организма, и тщательному исследованию пути мембранной сигнализации, через который происходит активация Na/K-АТФазы в качестве трансдуктора сигнала при регуляции синтетических процессов в тканях разных типов (Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. Исследования участия Na⁺, К⁺-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, т. 140, №8, с.150-153; Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование роли Na⁺, К⁺-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005.Т. 139, №2. С.147-160; Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Цырлин В.А. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов на рост эксплантатов ткани сердца. Физиологич. журнал им. Сеченова, 2005. Т. 91. №11. С.1299-1304; Karetsky A.V., Lopatina E.V., Penniyaynen V.A. а3-izoform of Na⁺, K⁺-ATPase modulates process of cells growth in the chicken retina. Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects" Saint-Petersburg. 2005. P.30). Аналогичную функцию - функцию трансдуктора Na/K-АТФаза выполняет при модуляции кодирования ноцицептивного сигнала (Крылов Б.В., Дербенев А.В., Подзорова С.А., Людыно М.И., Кузьмин А.В., Изварина Н.Л. Морфин уменьшает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов // Российский физиол. журн. 1999, т. 85, №2, с.225-236). В результате этого исследования авторами заявляемого изобретения было предсказано, что коменовая кислота может быть использована в качестве действующей субстанции при изготовлении противовоспалительного синтетического регенерирующего средства, проявляющего иммуномодуляторные, антиоксидантные и другие эффекты, описанные выше. Перечисленные свойства заявляемое средство реализует благодаря способности образовывать хелатные комплексы с ионами кальция и магния с последующей активацией специфического молекулярного механизма мембранной сигнализации, включающего альфа три изоформу Na/K-АТФазы в качестве трансдуктора сигнала. Механизм реализации эффектов заявляемого средства был открыт авторами заявляемого изобретения.

Заявляемая композиция отличается от препарата-прототипа рядом существенных признаков: качественным составом, прежде всего использованием другой действующей субстанции - коменовой кислоты, соответствующими количественными характеристиками, тем, что заявляется готовый для инъекций раствор. Предлагаемое лекарственное средство отличается тем, что является синтетическим средством, препарат в отличие от препарата-прототипа и известных аналогов, не является пептидным соединением, лекарственный эффект которых трудно прогнозировать и регулировать, лекарственная форма препарата производится в виде готового стабильного, стерильного раствора для инъекций.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым. Ранее авторами изобретения было показано, что коменовая кислота обладает седативным действием, в дозах, превышающих значения заявляемого изобретения (патент РФ №2209062 «Вещество, обладающее седативным действием» от 19.03.02, опубл. 27.07.03), что не порочит новизну заявляемого изобретения. Таким образом, можно предполагать, что заявляемое средство обладает новизной.

Только совокупность существенных признаков заявляемого регенерирующего средства позволяет достичь указанного технического результата. Способность композиции веществ, составляющих основу заявляемого средства, проявлять стабильную регенерирующую активность была открыта авторами изобретения, как было указано выше, случайно, при исследовании роли Na/K-АТФазы в качестве трансдуктора сигнала при регуляции синтетических процессов в тканях разных типов.

Следует подчеркнуть, что до сих пор не созданы не имеющие негативных побочных эффектов регенерирующие средства, сопоставимые по степени регенерации с анаболиками.

Таким образом, предлагаемое регенерирующее средство может соответствовать условию охраноспособности «изобретательский уровень» («неочевидность»).

Заявляемые способы лечения представляют собой следующую совокупность существенных признаков:

Способ 1

1(3). Способ лечения хориоретинальных дистрофий различной этиологии, заключающийся в том, что пациенту вводят регенерирующее средство по пп.1-2 парабульбарно в дозе от 10 до 20 мг (в пересчете на коменовую кислоту) один раз в сутки в течение 10 дней.

2(4). Способ лечения по п.3, отличающийся тем, что курс лечения повторяют 2-3 раза в год.

3(5). Способ лечения по п.3, отличающийся тем, что в офтальмологии пациенту вводят регенерирующее средство в один или оба глаза.

Способ 2

4(6). Способ повышения противотуберкулезной терапии, заключающийся в том, что пациенту вводят регенерирующее средство по пп.1-2 внутривенно в дозе до 350 мг в сутки (в пересчете на коменовую кислоту) в течение 10 дней.

5(7). Способ лечения по п.4(6), отличающийся тем, что курс лечения проводят 1-3 раза в год с перерывом в 3-6 мес.

Заявляемое средство не вызывает зависимости и привыкания, следовательно доза препарата, используемая при лечения хориоретинальных дистрофий и в комплексной противотуберкулезной терапии - остается неизменной в ходе лечения даже при длительном применении.

Введение заявляемого регенерирующего средства парабульбарно в дозе, большей чем 20 мг в сутки (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту) нецелесообразно, так как регенерирующий и противовоспалительный эффект не увеличивается.

Введение заявляемого средства внутривенно в дозе большей чем 350 мг в сутки (5 мг/кг) (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту) при включении в комплексную противотуберкулезную терапию нецелесообразно, так как противовоспалительный эффект не увеличивается.

Совокупность существенных признаков каждого из предлагаемых способов лечения позволяет достичь технического результата, заключающегося в эффективном лечении ретинопатий, в том числе туберкулезного характера, улучшении эффективности комплексного лечения туберкулеза и ряда дегенеративных заболеваний, что позволяет качественно осуществлять терапию по лечению основного заболевания и существенно улучшить качество жизни пациентов. В ходе лечения не возникает привыкания к препарату, что позволяет осуществлять продолжительное лечение, не меняя препарат, достигать устойчивого эффекта.

В отличие от способа лечения с помощью прототипа-ретиналамина предлагаемые способы лечения не имеют побочных эффектов, характерных для препаратов пептидной природы, а именно: развитие аллергических реакций, головокружения. Механизм действия заявляемого средства сугубо избирателен. Это особенно ценно при хирургических офтальмологических вмешательствах. Таким образом, заявляемый способ лечения является щадящим. Способы лечения с помощью заявляемого средства являются более удобными для медицинского персонала, поскольку не требует дополнительных манипуляций, связанных с его приготовлением (растворением), следовательно, сокращается время работы персонала с каждым пациентом.

Следует подчеркнуть, что прототип-ретиналамин не применяется при лечении туберкулеза.

Заявляемые способы лечения отличаются от способа-прототипа с использованием ретиналамина рядом существенных признаков: использованием другой действующей субстанции - заявляемого регенерирующего противовоспалительного средства на основе коменовой кислоты в определенных дозе и сроках лечения. Способ-прототип в отличие от заявляемых включает предварительную стадию подготовки - приготовления раствора ретиналамина. Ретиналамин вводится внутримышечно и парабульбарно, заявляемое средство - парабульбарно и внутривенно.

Полностью совпадающего с заявляемыми по совокупности существенных признаков способа лечения хориоретинальных дистрофий не обнаружено, это может служит доказательством новизны заявляемых способов.

Только совокупность существенных признаков каждого из заявляемых способов лечения позволяет достичь указанного технического результата - проведения эффективной комплексной патогенетической противотуберкулезной терапии за счет повышения гуморального иммунитета и фагоцитарной активности макрофагов; направленной модуляции процесса пролиферации клеток сетчатки и кардиомиоцитов, стимуляции роста нейритов. Действительно, до сих пор не известен способ комплексного патогенетического лечения туберкулеза, при реализации которого происходит направленное воздействие на стимуляцию гуморального иммунитета, в результате чего повышается фагоцитарная активность макрофагов и потенцирование действия препаратов используемых в стандартной противотуберкулезной терапии. При лечении дистрофии сетчатки, возникшей как осложнение при развившемся туберкулезе глаза, обнаружено достоверное уменьшение площади фиброзных очагов при включении в комплексную терапию заявляемого средства. Это происходит за счет того, последний реализует свои свойства при образовании хелатных комплексов с ионами кальция (магния) и активирует функцию Na/K-АТФазы как трансдуктора сигнала, стимулирующего процесс пролиферации без интоксикации, привыкания и рецидивов. Специальные исследования показали, что при наличии у заявляемого средства мощных тканеспецифичных трофических, ретинопротекторных и нейротрофических свойств, препарат не стимулирует возникновение и рост новообразований. Заявляемое средство может быть рекомендовано больным с почечной и печеночной недостаточностью, поскольку не выводится печенью и почками, а метаболизируется в самом организме, образуя глюкуроновые конъюгаты или комплексные соединения с катионами металлов кальция и магния. Все это свидетельствует о неочевидности заявляемых способов.

Таким образом, исходя из сказанного выше, заявляемая группа изобретений в целом может претендовать на соответствие критериям охраноспособности «новизна» и «неочевидность».

Для подтверждения соответствия заявляемого решения требованию «промышленная применимость», а также для лучшего понимания сущности изобретения приводим примеры его конкретной реализации.

Прототип

Ретаналамин использован продажный (фирма Герофарм).

Реагенты, использованные для приготовления заявляемого регенерирующего средства:

Активное начало средства - коменовая кислота (5-гидрокси-4-оксопирон-2-карбоновая кислота) синтезирована по методике (Гаркуша Ж.А. Ж. общей химии. 1961, т.31, с.2573). Температура плавления (261-267°С) и спектральный анализ соответствуют литературным данным. В качестве примеси коменовой кислоты может присутствовать бензилкоменовая кислота - в количестве не более 2,5% в пересчете на коменовую кислоту.

В качестве вспомогательного вещества в состав заявляемого средства включен натрия гидрокарбонат (ГОСТ 4201-79; ФС 42-0324-4716-03) с целью создания оптимального значения рН, способствующего диссоциации коменовой кислоты и увеличению ее растворимости.

Вода для инъекций соответствовала требованиям ФС 42-2620-97. Стерилизацию средства проводят методом мембранной фильтрации в асептических условиях. Фильтрат разливают в ампулы нейтрального стекла и запаивают.

Состав заявляемого средства

Положительный заявляемый эффект средства проявляется для 1-2%-ного водного раствора. Преимущественная форма заявляемого средства (лекарственная форма) представляет собой 1% или 2% водный раствор для инъекций в ампулах по 1, 2 и 5 мл. Действующее вещество - коменовая кислота, концентрация которой составляет 10 мг в 1 мл (1% раствор анальгетического средства), либо 20 мг в 1 мл (2% раствор). В состав лекарственной формы заявляемого средства в пересчете на 100% вещество входят натрия гидрокарбонат 5,5 г (1% раствор), либо 11 г (2% раствор), вода для инъекций до 1 л (или 1-2 г коменовой кислоты, 0,55-1,1 г натрия гидрокарбоната и вода до 100 мл). Заявляемое средство является прозрачной жидкостью от желтоватого до желтого (10 мг/мл), от желтовато-зеленоватого до желто-зеленого (20 мг/мл) цвета без запаха, рН - от 4,1 до 5,6 (потенциометрически). Среди посторонних примесей идентифицирована бензилкоменовая кислота, которая является промежуточным продуктом синтеза коменовой кислоты. Норматив совокупного содержания посторонних примесей установлен на основании данных по хранению и с учетом допустимого уровня примесей в субстанции коменовой кислоты: не более 5% (содержание бензилкоменовой кислоты - не более 2,5%) в пересчете на коменовую кислоту. Заявляемое средство является стабильным соединением. При его хранении в естественных условиях: степень его разложения составляет около 1% в год. Срок годности стерильного препарата в защищенном от света месте при температуре не выше +25°С - 2 года. Средство является апиро генным. Тест-доза 10 мг на кг массы животного, в объеме 0,5 мл и 1 мл, соответственно, для препаратов с концентрацией 20 мг/мл и 10 мг/мл. Средство является нетоксичным, относится к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (по коменовой кислоте) (Н. Hodge et al.. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975,427 p.).

Пример 1. Фармакокинетика заявляемого средства

При внутривенном введении заявляемого средства (преимущественно в виде 1 и 2% раствора для инъекций) собакам фармакокинетика действующей субстанции препарата - коменовой кислоты - в плазме крови описывается 3-частевой зависимостью. Первая фаза распределения протекает стремительно - характерное время на этом участке составляет 1,5 мин. За первые 10 мин из плазмы крови уходит около 95% коменовой кислоты (действующая субстанция препарата), при этом ее концентрация снижается от 50-60 мкг/кг до 3 мкг/кг, т.е. почти в 20 раз. Следующая фаза длится с 10-ой минуты и до начала 2-го часа; характерное время составляет порядка 30 мин, и концентрация коменовой кислоты снижается с 3 до 0.6 мкг/мл, т.е. в 5 раз. После 2-го часа наступает, по-видимому, фаза истинной элиминации с временем T_1/2 порядка 5,5 ч. Среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет 5,5-6 ч.

Высокие значения таких показателей, как клиренс (450-500 мл/кг/ч) и стационарный объем распределения (2,5 л/кг) свидетельствуют о том, что заявляемое средство очень активно распределяется из системного кровотока. Этот факт является неожиданным, поскольку коменовая кислота относится к ряду гидрофильных соединений. Отсюда следует, что большая часть средства, вероятно, не выводится, а подвергается метаболизму и утилизируется в самом организме. Это дает возможность рекомендовать использование заявляемого средства у пациентов с почечной и печеночной недостаточностью. Учитывая химическую природу коменовой кислоты (т.е. наличие в ее структуре гидроксильной и карбоксильной групп), возможными ее метаболитами могут быть глюкоронидные конъюгаты или комплексные соединения с катионами металлов.

Положительная динамика после парабульбарного приема заявляемого регенерирующего средства, обладающего противовоспалительными эффектами, проявляется через 10-14 дней от начала использования. Для закрепления положительного результата при необходимости курс лечения повторяют до 3 раз в году.

При включении препарата в стандартную комплексную противотуберкулезную терапию положительный эффект от 10-дневного курса внутривенных инъекций наблюдается через 14 дней от начала использования препарата. Положительный эффект является стойким. При необходимости курс лечения заявляемым препаратом повторяют до 3 раз в году.

Заявляемое средство не вызывает зависимости и привыкания, следовательно, доза препарата, необходимая для достижения регенерирующего эффекта, остается неизменной в ходе лечения даже при длительном применении. В терапевтической дозе средство не влияет на формулу крови, сердечно-сосудистую и дыхательную системы, не вызывает аллергические реакции, не провоцирует терратогенез, не влияет на репродуктивную функцию и эмбриогенез.

Пример 2. Специфическая фармакологическая активность

2.1. Предлагаемый механизм действия. Нейротрофическая и трофическая активность. Опыты in vitro

Нейротрофические и трофические свойства заявляемого средства исследовали при помощи метода органотипического культивирования ткани. Эксперименты осуществляли на эксплантатах ткани сердца, сетчатки и нейронах спинальных ганглиев 10-12 дневных куриных эмбрионов. Исследовано 400 эксплантатов ткани сердца, 500 эксплантатов ткани сетчатки и 400 эксплантатов спинальных ганглиев. Питательная среда, в которой осуществляли культивирование эксплантатов, имела рН 7,2 и следующий состав: 40% - раствор Хенкса; 40% - среда Игла; 15% - фетальная сыворотка коровы; 5% - куриный эмбриональный экстракт; с добавлением глюкозы (0,6%), инсулина (0,5 ед/мл), гентамицина (100 ед/мл), глютамина (0,35%). Эксплантаты помещали на коллагенновую подложку и культивировали в питательной среде в чашках Петри при температуре 37°С в СO₂ инкубаторе (Sanyo), при концентрации О₂ 95% и СO₂ 5% (Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование роли Na⁺, К⁺-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, т. 139, №2, с.147-160; Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Цырлин В.А. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов на роста эксплантатов ткани сердца. Физиологич. журнал им. Сеченова, 2005, Т.91, №11, с.1299-1304. Karetsky A.V., Lopatina E.V., Penniyaynen V.A. α3-izoform of Na⁺, K⁺-ATPase modulates process of cells growth in the chicken retina. Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects" Saint-Petersburg, 2005, p.30).

Контрольными служили эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. Заявляемое средство добавляли в питательную среду в концентрациях: 10^-6 М, 10^-7 М, 10^-8 М, 10^-9 М (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту). Контрольное значение ИП принимали за 100%, достоверность различий в ИП оценивали с помощью t-критерия Стъюдента. В части экспериментов в питательную среду добавляли сердечный гликозид, блокатор Na/K-АТФазы оуабаин (Sigma). Оуабаин добавляли в концентрации 10^-8 М, в этой концентрации препарат блокирует обе функции Na/K-АТФазы - функцию помпы и функцию трансдуктора сигнала и полностью блокирует рост эксплантатов ткани сердца, сетчатки и спинальных ганглиев [там же].

Проведенные исследования показали, что заявляемое средство обладает нейротрофическими и трофическими свойствами. Действие препарата является дозозависимым и тканеспецифичным.

При введении в питательную среду заявляемого средства в концентрации 10^-6 М (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту) наблюдали достоверное угнетение роста эксплантатов ткани сетчатки на 24%по сравнению с контролем. Аналогичное действие оказывала эта концентрация на рост нейритов, ИП был на 20% ниже контрольного значения. В то время как влияние заявляемого средства в дозе 10^-6 М на рост эксплантатов ткани сердца оказалось противоположным. В этой концентрации препарат достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сердца на 40% по отношению к контролю. В концентрации 10^-7 М степень угнетения роста эксплантатов ткани сетчатки и нейритов сенсорных нейронов препаратом была значительно меньше. ИП эксплантатов ткани сетчатки был ниже контрольного значения на 17,5%. ИП нейритов сенсорных нейронов был ниже контрольного значения на 5%. Величина ИП эксплантатов ткани сердца в аналогичных условиях культивации была выше контрольного значения на 23%. Добавление препарата в концентрации 10^-8 М приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки и нейритов сенсорных нейронов на 18% и 24%, соответственно. На рост эксплантатов ткани сердца препарат в этой концентрации не влиял. Данные не отличались от контрольных. При введении в питательную среду препарата в концентрации 10^-9 М наблюдали достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки. ИП был выше контрольного значения на 50%. Рост нейритов сенсорных нейронов сохранялся на прежнем уровне. На рост эксплантатов ткани сердца препарат в этой концентрации не влиял.

В части экспериментов в питательную среду вместе с заявляемым средством в эффективной для каждого типа ткани концентрации добавляли оуабаин в концентрации 10^-8 М. Именно в этой концентрации оуабаин полностью угнетал рост эксплантатов ткани сетчатки, нейритов сенсорных нейронов и эксплантатов ткани сердца. При совместном культивировании эксплантатов ткани сетчатки в среде, содержащей заявляемое средство в концентрации 10^-9 М и оуабаин в концентрации 10^-8 М оказалось, что ИП экспериментальных эксплантатов ничем не отличался от контрольного значения. Аноцептин в концентрации 10^-8 М устранял блокирующий эффект оуабаина по отношению к нейритам сенсорных нейронов, ИП экспериментальных эксплантатов ничем не отличался от контрольного значения. Токсический эффект оуабаина по отношению к эксплантатам ткани сердца заявляемое средство устраняло в концентрации 10^-6 М. Степень роста эксплантатов ткани сердца, культивируемых в среде, содержащей заявляемое средство (10^-6 М) и оуабаин (10^-8 М) соответствовала контрольному значению -ИП эксплантатов ткани сердца, культивируемых только в условиях питательной среды. Таким образом, тканеспецифичное нейротрофическое и трофическое действие, которое оказывает заявляемое средство реализуется благодаря его непосредственному влиянию на Na/K-АТФазу, скорее всего ее альфа три изоформу. Усиление процессов роста и пролиферации в тканях разных типов в этом случае связано с активацией функции Na/K-АТФазы как трансдуктора сигнала. В этом качестве Na/K-АТФаза может принимать участие в регуляции синтетических процессов (пролиферации и роста) в тканях разного типа [там же]

Цитологические исследования препаратов ткани сетчатки, окрашенных гематоксилинэозином позволили обнаружить, что в зоне роста контрольных и экспериментальных эксплантатов, культивируемых в течение 3-х суток в питательной среде, содержащей заявляемое средство (10^-9 М) присутствовали клетки пигментного эпителия сетчатки, палочки, колбочки, ганглиозные клетки. На фиксированных препаратах ткани сердца, окрашенных гематокилинэозином, обнаружено,