Применение s1p

Применение s1p

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к применению S1P (сфингозин-1-фосфата). Другие аспекты изобретения относятся к способу скрининга лекарственных средств и к способам лечения боли.

Боль представляет собой сложное субъективное ощущение, отражающее реальное или возможное повреждение тканей и эмоциональный ответ на него. Острая боль представляет собой физиологический сигнал, означающий возможное или реальное повреждение. Хроническая боль может быть либо соматогенной (органической), либо психогенной. Хронической боли часто сопутствуют или за ней следуют вегетативные признаки, которые часто приводят к депрессии.

Соматогенная боль может быть ноцицептивного, воспалительного или невропатического происхождения. Полагают, что ноцицептивная боль связана с непрерывной активацией соматических или висцеральных болевых чувствительных нервных волокон. Невропатическая боль возникает вследствие дисфункции нервной системы; полагают, что ей способствуют аберрантные соматосенсорные процессы периферической нервной системы, ЦНС или их обоих. (Для обзора механизмов боли см., например, Scholz and Woolf, 2002; Julius and Basbaum, 2001, Woolf and Mannion, 1999; Wood, J.D., 2000; Woolf and Salter, 2000.)

Хроническая боль приводит к страданию человека и к огромным социально-экономическим затратам. Существующие способы лечения боли крайне неудовлетворительны как в отношении эффективности, так и в отношении безопасности.

В настоящее время для лечения боли, как правило, применяют два класса анальгетиков: неопиоидные анальгетики, главным образом ацетаминофен и НПВЛС (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), и агонисты опиоидов (наркотики) (где "опиоид" является общим термином для природных или синтетических веществ, связывающихся со специфическими опиоидными рецепторами в ЦНС, оказывая действие в качестве агониста). К сожалению, оба класса анальгетиков, и опиоидные, и неопиоидные, обладают некоторыми нежелательными побочными эффектами. Наиболее серьезными побочными эффектами опиоидов являются возможность угнетения дыхательной системы и возникновение зависимости после длительного их приема (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). С другой стороны, НПВЛС, большой класс не являющихся опиоидами анальгетиков, может вызывать множество осложнений желудочно-кишечного тракта, такие как язвы и кровотечение, а также оказывать отрицательное воздействие на почки (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). Было установлено, что в США вследствие вызываемых общепринятыми НПВЛС тяжелых желудочно-кишечных осложнений ежегодно умирает приблизительно 16000 пациентов.

Ввиду серьезных недостатков методов лечения боли, известных в данной области, существует необходимость в новых классах модулирующих боль лекарственных средств. Особенно, ввиду огромного разрыва между быстрым продвижением в понимании нейробиологии боли и неудовлетворенной клинической потребностью в эффективных способах лечения без побочных эффектов в данной области, необходимы усилия, направленные на поиск новых объектов исследования для создания новых классов анальгетиков. Таким образом, целью настоящего изобретения является получение новых средств для разработки и получения нового класса модулирующих боль лекарственных средств.

Эта цель достигается благодаря применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для получения модулирующих боль фармацевтических соединений.

Изобретение основано на открытиях авторов изобретения, впервые продемонстрировавших, что S1P участвует в ноцицептивных процессах и способен снижать боль. Термин функциональный в отношении S1P или термин функция S1P относится к способности S1P взаимодействовать по меньшей мере с одним из его рецепторов и, предпочтительно, активировать рецептор, или к способности S1P уменьшать внутриклеточные уровни цАМФ, или к способности S1P опосредовать перенос PAM (ассоциированный с Myc белок) из эндоплазматического ретикулума к клеточной мембране; более конкретно, он относится к его способности усиливать активность PAM (т.е. к способности PAM взаимодействовать с AC, и/или уменьшать активность AC, и/или уменьшать боль) и/или к его способности ингибировать активность AC и, еще более предпочтительно, к его способности снижать боль. Термин функциональный в отношении рецепторов S1P или термин функция рецептора S1P относится к способности рецепторов S1P взаимодействовать с S1P, более конкретно, к их способности опосредовать характерный для рецептора сигнал, инициируемый взаимодействием с S1P, и более конкретно, к их способности воздействовать на болевой процесс, инициируемый взаимодействием с S1P.

Фрагмент S1P может быть любым фрагментом, меньшим, чем исходная молекула, в соответствии с фиг.15. Фрагмент PAM может быть любым полипептидным или полинуклеотидным фрагментом, являющимся более коротким, чем соответствующая исходная молекула. Фрагмент рецептора S1P может представлять собой любой полипептидный или полинуклеотидный фрагмент, который короче, чем соответствующая исходная молекула.

Производное S1P или фрагмент S1P может иметь любую модификацию молекулы с функцией S1P или модификацию любого другого типа, такую как химическая или биологическая модификация, например, приводящая к стабилизации молекулы или изменяющая ее специфическую направленность, например, на определенные клетки или облегчающая ее проникновение в клетки или ее захват клеткой; одна из известных модификаций представляет собой гидроксилирование или метилирование S1P. Пригодными являются подходящие модификации или дополнения для обеспечения или облегчения ее направления к необходимому участку и ее вхождения в клетку. С другой стороны, для обеспечения ее направления к спинному мозгу возможно локальное применение, такое как интраспинальное применение с применением подходящих катетеров и тому подобное. Другие пригодные дополнения включают в себя соли (для физиологически переносимых или неорганических солей см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, p. 1418, 1985), буферы или тому подобное для ее стабилизации и тому подобное.

Так как S1P эндоцитируется в клетки посредством специфических рецепторов, то его можно применять наружно, и он затем специфически эндоцитируется. Модулирование направленности S1P можно достичь посредством клонирования и экспрессии рецепторов S1P в желаемых клетках. Клеточную типоспецифическую экспрессию можно обеспечить с применением подходящих промоторов/энхансеров генов, известных в данной области.

Настоящее изобретение основано на исследованиях авторов, впервые продемонстрировавших, что S1P участвует в механизмах повышения чувствительности в спинном мозге и ганглиях задних корешков (DRG).

S1P (сфингозин-1-фосфат) представляет собой фосфорилированное производное сфингозина, структурную основу всех сфинголипидов. Известно, что этот внеклеточный (образующийся в сыворотке) сфинголипид регулирует множество клеточных процессов посредством связывания с одним из пяти специфических сопряженных с G-белками рецепторов (GPCR), обозначенных от S1P₁ до S1P₅, которые по-разному экспрессированы в различных тканях, где каждый регулирует специфические виды клеточной деятельности (для обзора см., например, Payne et al., 2002; и Spiegel and Milstien, 2000). Известные функции внеклеточного S1P включают в себя, например, регуляцию клеточной миграции, продолжительность жизни клеток или ангиогенез. Кроме его внеклеточного действия, также известно, что он действует как внутриклеточный мессенджер (для обзора см., например, Payne et al., 2002; и Spiegel and Milstien, 2000). Однако до сих пор его вовлеченность в ноцицептивные процессы являлась неизвестной.

PAM (ассоциированный с Myc белок) представляет собой гигантский белок с массой 510 кДа. Белковая, геномная и кодирующая полинуклеотидные последовательности PAM известны в данной области и общедоступны, например, в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) под инвентарными номерами AAC39928 (кодирующая последовательность; SEQ ID NO:1), AF075587 (белковая последовательность; SEQ ID NO:2). Человеческий PAM расположен на хромосоме 13q22; его геномная последовательность общедоступна под номером NT_024524.11 (Старт: положение 24679861; Стоп: положение 24962245; SEQ ID NO:3). Альтернативно, белковая и кодирующая последовательности общедоступны под инвентарными номерами для белка KIAA0916 NP_055872 (белковая последовательность) и NM_015057 (кодирующая последовательность).

Для крысиного PAM общедоступны следующие кодирующие последовательности из EST-клонов:

AW921303 (соответствует 960-1394 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:4);

AW918711 (соответствует 8188-8632 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:5);

BQ201485 (соответствует 8966-9633 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:6);

BE112881 (соответствует 10311-10830 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:7);

AW441131 (соответствует 13569-14152 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:8);

BF409872 (соответствует 13569-14807 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:9).

Исходно PAM идентифицировали по его способности специфически взаимодействовать с активирующим транскрипцию доменом на N-конце Myc (Guo Q. et al., 1998). Недавно PAM описан как мощный ингибитор активности AC (Scholich K., Pierre S., Patel T.B.: Protein associated with myc (PAM) is a potent inhibitor of adenylyl cyclase. J. Biol. Chem. 2001, Dec 14;276(50):47583-9.), но до настоящего времени доказательств его функционирования в обработке ноцицептивных сигналов и повышения ноцицептивной чувствительности не существовало.

Предпочтительнее полагают, что PAM играет роль в регуляции пресинаптического роста: известно, что мРНК PAM высоко экспрессирована в специфических анатомических областях, включающих в себя гиппокамп, зубчатую извилину и мозжечок. Экспрессия и PAM, и Myc в головном мозге взрослых крыс и мышей ограничена зрелыми клетками Пуркинье в мозжечке и зернистыми и пирамидальными клетками в гиппокампе (Ruppert C., et al., 1986; Yang H. et al., 2002). Однако ни для одного из этих типов клеток не известно, что он вовлечен в обработку болевых ощущений и повышение болевой чувствительности.

Показано, что гомологи PAM у Drosophila (highwire) и C. elegans (rpm-1) играют ключевую роль в организации пресинаптических окончаний (Zhen et al., 2000), регуляции синаптического роста (Wan et al., 2000), формировании синапсов и росте и направлении аксонов (Schaefer et al., 2000). Данные открытия привели к предположению, что highwire, rpm-1 и их гомолог у млекопитающих PAM могут действовать как негативные регуляторы синаптического роста (Chang et al., 2000; Jin Y., 2002). Таким образом, в мозжечке, гиппокампе и зубчатой извилине в течение основного периода формирования синапсов в этих структурах выявили значительное увеличение экспрессии PAM (Yang et al., 2002).

В течение развития головного мозга у грызунов экспрессия PAM запускается вскоре после рождения, повышается в течение первых двух недель, а затем экспрессия PAM остается повышенной в течение взрослого периода (Yang et al., 2002). До настоящего времени об экспрессии и регуляции PAM в спинном мозге и DRG и его функции в механизмах повышения чувствительности и регуляции боли ничего не было известно.

Ранее показано, что человеческий PAM представляет собой мощный регулятор путей передачи сигнала циклического АМФ (цАМФ) и ингибирует ферментативную активность некоторых изоформ аденилатциклазы (AC; E.C.4.6.1.1) при наномолярных концентрациях (Scholich et al., 2001).

Повсеместно присутствующая система вторичного мессенджера циклического АМФ (цАМФ) представляет собой один из различных механизмов передачи сигнала, преобразующих внеклеточные стимулы во внутриклеточные сигналы и ответы. При внеклеточной стимуляции сопряженные с G-белками рецепторы (GPCR) модулируют связанные с плазматической мембраной ферменты или ионные каналы посредством связанных с ГТФ тримерных регуляторных белков (G-белков). Один из ферментов, активность которого регулируют GPCR, представляет собой аденилатциклазу (AC), образующий цАМФ фермент. Таким образом, поступающие внеклеточные стимулы воздействуют на внутриклеточную концентрацию внутриклеточного медиатора, циклического АМФ. Повышение уровней цАМФ воздействует на клетку посредством стимуляции протеинкиназы A (PKA), фосфорилирующей специфические внутриклеточные белки-мишени и, таким образом, изменяющей их активность.

Каждый тип клеток обладает характерным набором GPCR, модулируемых данными GPCR ферментов, специфических подклассов аденилатциклазы (AC) и белков-мишеней, которые, действуя совместно с более неспецифическими или часто встречающимися партнерами (такими как повсеместно присутствующий цАМФ), позволяют каждой клетке производить ее собственный характерный ответ на поступающие внеклеточные сигналы. Например, известно, что вторичный мессенджер циклический АМФ (цАМФ) играет главную роль в синаптической пластичности (Bailey et al., 1996; Xia et al., 1997; Brandon et al., 1997); с другой стороны, он вовлечен в метаболические процессы и клеточную пролиферацию. Таким образом, роль повсеместно распространенной системы мессенджера цАМФ и ее различных компонентов варьируется в зависимости от различных видов специализации различных типов тканей и клеток.

В настоящее время в данной области известны 5 различных действующих на рецепторы S1P GPCR, обозначенных от S1P₁ до S1P₅ (для обзора см., например, Spiegel, S. and Milstien, S., 2000). Белковая и кодирующая полинуклеотидная последовательности различных рецепторов S1P известны в данной области и общедоступны, например, в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) под инвентарными номерами: NM_001400 (SEQ ID NO:32; нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 1 (EDG1/S1P₁); NP_001391 (SEQ ID NO:31, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов

1 (EDG1/S1P₁); NM:_004230 (SEQ ID NO:34, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 5 (EDG5/S1P₂); NP_004221 (SEQ ID NO:33, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 5 (EDG5/S1P₂); NM_005226 (SEQ ID NO:36, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 3 (EDG3/S1P₃); NP:005217 (SEQ ID NO:35, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов

3 (EDG3/S1P₃); NM:003775 (SEQ ID NO:38, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 6 (EDG6/S1P₄); CAA04118 (SEQ ID NO:37, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора 6 (EDG6/S1P₄); NM_030760 (SEQ ID NO:40, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия у человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 8 (EDG8/S1P₅); NP_110387 (SEQ ID NO:39, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 8 (EDG8/S1P₅).

В другом аспекте изобретение относится к S1P или его функциональному фрагменту или производному для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения боли.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для модуляции боли. Данная модуляция предпочтительно представляет собой уменьшение, или профилактику, или полное подавление.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для идентификации соединений, модулирующих боль. Модулирующие соединения предпочтительно представляют собой соединения, обладающие активностью S1P, имитирующие или усиливающие ее. Наиболее предпочтительно, чтобы они обладали способностью предотвращать, уменьшать или прекращать боль.

Например, соединения можно идентифицировать по их способности

a) имитировать, восстанавливать, активировать или усиливать функцию S1P (т.е. его способность взаимодействовать по меньшей мере с одним из его рецепторов или их фрагментов и, предпочтительно, активировать рецептор или его способность уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ или опосредовать перемещение PAM из эндоплазматического ретикулума к клеточной мембране; более предпочтительно это относится к его способности усиливать активность PAM и/или ингибировать активность AC, а даже более предпочтительно к его способности уменьшать боль) или функцию PAM (т.е. его способность уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ, взаимодействовать с другими факторами, подобными AC, и особенно с AC, ингибировать AC или его способности уменьшать восприятие боли);

b) увеличивать сывороточный уровень S1P (например, посредством активации или усиления продукции S1P или посредством уменьшения его внеклеточного разрушения);

c) усиливать экспрессию, по меньшей мере, одного рецептора S1P (т.е. посредством активации его транскрипции, механизмов стабилизации продукта его транскрипции, трансляции или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции его посттрансляционной модификации или посредством активации механизмов его стабилизации или ингибирования его разрушения и тому подобное);

d) взаимодействовать с ферментами, ответственными за продукцию или разрушение S1P.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или уменьшения боли, включающему в себя введение индивидууму достаточного количества S1P или его функционального фрагмента или производного.

Соответственно введение следует проводить способом, обеспечивающим направление S1P к участку действия (DRG или спинной мозг), например, посредством системного введения производных или препаратов S1P в кровоток (например, внутривенное или пероральное применение) или посредством местного (например, интраспинального) применения S1P, или его фрагментов, или производных.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга фармацевтических средств, пригодных для модуляции и/или профилактики боли, включающему в себя стадии:

a) получения образца, содержащего PAM или его функциональный фрагмент или производное и не содержащего S1P,

b) получения второго образца, содержащего PAM или его функциональный фрагмент или производное, а также содержащего S1P,

c) приведения в контакт с соединением, по меньшей мере, одного образца,

d) измерения активности PAM в образцах,

e) определения способности соединения имитировать действие S1P.

Способ может дополнительно включать в себя стадию, где клетки вместо соединения контактируют с S1P и где активность PAM в c) и d) выше сравнивают с активностью PAM в присутствии S1P.

Другой пример относится к способу, включающему в себя стадии:

a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P или его функциональный фрагмент или производное,

b) приведения одного образца в контакт с соединением,

c) измерения активности рецептора в обоих образцах.

Способ по другому аспекту изобретения включает в себя стадии:

a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P или его функциональный фрагмент или производное,

b) приведения образцов в контакт с S1P,

c) приведения одного образца в контакт с соединением,

d) измерения активности рецептора или взаимодействия S1P и рецептора в обоих образцах.

PAM или рецепторы S1P можно получать из любой доступной последовательности, удовлетворяющей их конкретному назначению по различным аспектам настоящего изобретения. Предпочтительно PAM или рецепторы S1P являются человеческими.

В различных аспектах настоящего изобретения также предпочтительно, если PAM или рецепторы S1P представляют собой выделенные полипептиды, или олиго-, или полинуклеотиды. Выделенные в контексте различных аспектов настоящего изобретения означают, по меньшей мере, частично очищенные из природного источника или рекомбинантные молекулы (которые, конечно, также могут являться очищенными или частично очищенными).

Анализ представляет собой аналитический способ любого типа для слежения за биологическим процессом. Для применения в скрининге лекарственных средств анализ должен являться воспроизводимым, а предпочтительно, также расширяемым и надежным. Анализ предпочтительно пригоден для высокопроизводительного скрининга химических соединений на их способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль. Высокопроизводительный скрининг, как правило, включает в себя скрининг приблизительно 500000 различных соединений на определенную способность. Например, тип анализа зависит от типа применяемой молекулы (или полипептид, или полинуклеотид) и "вывода", т.е. способа, которым определяют активность S1P, PAM или рецептора S1P (см. ниже).

Различные типы таких анализов, как правило, известны в данной области и коммерчески доступны у частных поставщиков. Пригодные виды анализа включают в себя радиоизотопный или флуоресцентный виды анализа, например, виды флуоресцентного поляризационного анализа (такие как виды анализа, предоставляемые на коммерческих условиях Panvera, Perkin-Elmer life sciences (например, LANCE) или Packard BioScience (например, HTRF или ALPHAscreen™)) для измерения взаимодействия меченого партнера с немеченым партнером (например, PAM или его фрагменты могут являться мечеными, а измерять можно их взаимодействие с AC).

Простые биохимические анализы пригодны, например, для определения взаимодействия между потенциальным фармацевтическим соединением и рецептором или функциональным фрагментом или производным рецептора. Определить, способно ли соединение активировать данный рецептор и, таким образом, имитировать активность S1P, также можно более сложными анализами.

Более многочисленные примеры включают в себя основанные на применении клеток анализы, где клеточная линия стабильно (индуцируемо или нет; с хромосомы или эписомы) или транзиторно экспрессирует интересующий рекомбинантный белок. Данные виды анализа включают в себя, например, анализ с репортерным геном, где регуляцию определенного промотора или пути передачи сигнала участника каскада передачи сигнала измеряют по активности репортерного фермента, экспрессия которого находится под контролем указанного определенного промотора. Для данного типа анализа конструируют рекомбинантную клеточную линию, содержащую репортерный ген под контролем определенного промотора, который необходимо исследовать самого или который регулируется исследуемым сигнальным каскадом. Пригодные репортерные ферменты, как правило, известны в данной области и включают в себя люциферазу светляка, люциферазу Renilla (например, коммерчески доступная в Packard reagents), β-галактозидазу. Пригодность клеточных линий зависит от цели анализа, но они, как правило, включают в себя клеточные линии, которые легко трансфицировать и легко культивировать, например, такие как HeLA, COS, CHO, NIH-3T3 и тому подобное.

Анализы для измерения внутриклеточного уровня ионов включают в себя, например, анализы с применением FLIPR (планшет-ридера флуориметрического получения изображения, коммерчески доступного в Molecular Devices), где источник свечения аргонового лазера объединяют с охлажденной CCD-камерой, обеспечивая параллельное измерение в 384-луночных планшетах кратковременных сигналов ионов (таких как Ca²⁺ и тому подобное) в клетках (например, в нервных клетках или других клетках (например, в клетках, рекомбинантно или естественным образом экспрессирующих определенные ионные каналы)). Например, анализы с применением FLIPR позволяют с применением определенных флуорохромов, таких как Fluo-3, Fluo-4, производить мониторинг внутриклеточного содержания кальция или, с применением наборов для анализа с применением специфичных для ф./р. BCECF или BCPCF FLIPR, производить мониторинг внутриклеточного pH, или с применением, например, наборов для анализа с применением DiBAC или специфичных FLIPR проводить мониторинг изменений мембранного потенциала, или проводить мониторинг поляризации мембраны. Для мониторинга других внутриклеточных ионов, например цинка или натрия, можно применять другие известные в данной области красители. Как правило, специалистам в данной области известны другие типы анализа и другие типы вывода данных.

Для измерения уровней цАМФ пригодны, например, AlphaScreen, поляризация флуоресценции или технология HTRF.

Для определения активности ионных каналов (контролирующей, например, внутриклеточные концентрации ионов и которую, таким образом, можно применять для измерения внутриклеточной концентрации ионов) можно применять, например, чувствительные к мембранному потенциалу анализы и красители, такие как DiBAC, или технологию с применением набора для анализа мембранного потенциала на FLIPR из Molecular Devices; измеряющий поляризацию митохондриальных мембран краситель JC-1 с применением технологии FLIPR; иончувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-4 или набор для анализа кальция из Molecular Devices для измерения внутриклеточной концентрации кальция; чувствительные к натрию красители, например, из Molecular Probes для измерения внутриклеточного натрия; основанные на способе фиксации потенциала анализы или основанное на атомно-адсорбционной спектроскопии измерение выхода иона рубидия для определения внутриклеточных концентраций калия и тому подобное. Специалистам в данной области известны дополнительные автоматические устройства и аналитические способы для выявления определенных изменений и состояний в клетках, и они включают в себя, например, детектор Acumen (основанное на флуоресценции лазерное сканирующее считывающее устройство, позволяющее производить трехмерную реконструкцию распределения подходящим образом меченных объектов) из ACUMEN bioscience.

Для измерения активности GPCR пригодны, например, измерение цАМФ, например, посредством системы выявления цАМФ AlphaScreen™ из Packard Bioscience, анализы мобилизации Ca²⁺ или анализы с репортерным геном.

Полипептид PAM предпочтительно представляет собой полипептид, содержащий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2 или состоящий из нее, или кодируемый полинуклеотидом, содержащим последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или 3 или состоящим из нее. Полипептиды рецепторов S1P предпочтительно представляют собой полипептиды, содержащие одну из соответствующих SEQ ID NO:31, 33, 35, 37 или 39 аминокислотных последовательностей или состоящие из нее или кодируемые полинуклеотидами, содержащими одну из соответствующих SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 или 40 последовательностей или состоящими из нее, или кодируемые кодирующими последовательностями в рамках данных последовательностей мРНК.

Полинуклеотид PAM предпочтительно представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или 3 или состоящий из нее, или полинуклеотид, содержащий способную в жестких условиях гибридизоваться с указанными выше полинуклеотидами последовательность или состоящий из нее. Полинуклеотид рецепторов S1P предпочтительно представляют собой полинуклеотиды, содержащие последовательности в соответствии с SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 или 40 или состоящие из них, полинуклеотиды, включающие в себя положения с 244 по 1392 SEQ ID NO:32, с 1 по 1137 SEQ ID NO:34, с 1 по 1062 SEQ ID NO:36, с 23 по 1177 SEQ ID NO:38 или с 10 по 1206 SEQ ID NO:40 или соответствующие им, или полинуклеотиды, содержащие способную в жестких условиях гибридизоваться с указанными выше полинуклеотидами последовательность или состоящие из нее.

Жесткие условия являются характерными условиями реакции, влияющими на специфичность гибридизации или отжига двух одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты. Жесткость и, таким образом, специфичность реакции, среди прочего, зависит от температуры и буферных условий, применяемых для реакции. Например, жесткость и, таким образом, специфичность можно увеличить посредством увеличения температуры реакции и/или снижения ионной силы реакционного буфера. Например, условия с низкой жесткостью (и, таким образом, с низкой реакционной или гибридизационной специфичностью) имеют место, если гибридизацию проводят при комнатной температуре в растворе 2×SSC. Условия с высокой жесткостью включают в себя, например, реакцию гибридизации при 68єC в растворе 0,1×SSC и 0,1% SDS.

Под гибридизацией в жестких условиях в пределах различных аспектов настоящего изобретения предпочтительно подразумевают:

1) Гибридизацию меченого зонда с образцом нуклеиновой кислоты для анализа при 65°C или, в случае олигонуклеотидных зондов, при температуре на 5°C ниже температуры отжига или плавления дуплекса, состоящего из олигонуклеотида и образца (температуры отжига и плавления далее подразумевают синонимами), в течение ночи в 50 мМ Tris pH 7,5, 1M NaCl, 1% SDS, 10% декстрансульфате, 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося или сельди.

2) Отмывку в течение 10 минут в 2×SSC при комнатной температуре.

3) Отмывку в течение 30 минут в 1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига).

4) Отмывку в течение 30 минут в 0,1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига).

Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов для гибридизации представляют собой полинуклеотиды, а предпочтительно фрагменты ДНК, с длиной от 15 до 30, а предпочтительно 20, нуклеотидов. Температуру отжига определяют по формуле T_m=2 × (число A+T) + 4 × (число G+C)°C.

Для получения 2×SSC или 0,1×SSC (или любой другой степени разведения SSC) раствор, например, 20×SSC разбавляют соответствующим образом. 20×SSC состоит из 3 М NaCl/0,3 М цитрата Na×2H₂O.

Перед проведением реакции гибридизации полинуклеотиды, если желательно, после проведения электрофоретического разделения (в таком случае: "саузерн"-блот (ДНК) или "нозерн"-блот (РНК)) или без проведения электрофоретического разделения (в таком случае: слот- или дот-блот) переносят на подходящую мембрану, например нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Гибридизацию проводят с применением подходящим образом меченного зонда. Пригодные способы мечения представляют собой, например, радиоактивное мечение или мечение с применением флуоресцентных красителей. Зонд представляет собой одноцепочечный полирибо- или полидезоксирибонуклеотид, являющийся по природе одноцепочечным или, как правило, являющийся двухцепочечным, но сделанный одноцепочечным посредством денатурации. Данный зонд связывается с образцов ДНК или РНК (который также находится в одноцепочечном состоянии) посредством спаривания оснований.

Фрагменты PAM предпочтительно представляют собой фрагменты, содержащиеся в указанных выше последовательностях с ID NO:1, 2 или 3, а производные предпочтительно получают из указанных выше последовательностей с ID NO:1, 2 или 3 или из их фрагментов. Фрагменты рецепторов S1P предпочтительно представляют собой фрагменты, содержащиеся в указанных выше последовательностях с ID NO: от 31 до 40, более предпочтительно, фрагменты, содержащиеся в положениях с 244 по 1392 SEQ ID NO:32, с 1 по 1137 SEQ ID NO:34, с 1 по 1062 SEQ ID NO:36, с 23 по 1177 SEQ ID NO:38 или с 10 по 1206 SEQ ID NO:40 или состоящие из них, а производные предпочтительно получают из данных последовательностей.

Функциональные фрагменты или их производные предпочтительно способны ингибировать активность аденилатциклазы (AC), более предпочтительно, активность AC типа I, V или VI (в отношении рецепторов S1P, более предпочтительно, способную ингибировать активность AC при активации посредством связывания S1P или связывания имитирующей S1P молекулы).

В предпочтительном варианте осуществления различных аспектов настоящего изобретения функциональные фрагменты или производные PAM содержат или включают аминокислоты 400-1400, предпочтительно, 446-1062, 499-1065 или 1028-1231 и, более предпочтительно, 1000-1300, и еще более предпочтительно, 1000-1100, и наиболее предпочтительно, 1028-1065 последовательности человеческого PAM, предпочтительно, последовательности человеческого PAM, соответствующей SEQ ID NO:2, в том случае, если их кодируют соответствующие нуклеотидные фрагменты, особенно, если они входят в состав последовательностей SEQ ID NO:2 или 3.

Если функциональные фрагменты или их производные представляют собой полинуклеотиды, предпочтительно, если они содержат кодирующие указанные выше полипептидные фрагменты полинуклеотиды или состоят из них. Более конкретно, предпочтительно, если они содержат положения с 1482 по 3332 (кодирующие аминокислоты 446-1062), или с 1641 по 3341 (кодирующие аминокислоты 498-1066), или с 3228 по 3839 (кодирующие аминокислоты 1038-1231) cds человеческого PAM или состоят из них. Даже более предпочтительно, если cds человеческого PAM, из которой получены фрагменты, обладает последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:2.

По одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящего способа идентификации модулирующих боль соединений применяют клетки, экспрессирующие рецептор S1P и/или PAM, предпочтительно рекомбинантные рецептор S1P и/или PAM.

Клетки могут представлять собой клетки любого типа, например эукариотические или прокариотические одноклеточные организмы (такие как бактерии, например, E. coli или дрожжи, например, S. pombe или S. cerevisiae) или клеточные линии, полученные из многоклеточных организмов (такие как HeLa, COS, NIH-3T3, CHO и тому подобное), где предпочтительны клеточные линии млекопитающих.

По другому предпочтительному варианту осуществления применяют модифицированные клетки с уменьшенной по сравнению с ее немодифицированным состоянием активностью рецепторов S1P. Таким образом, можно тестировать способность химических соединений, тестируемых на способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль, увеличивать или восстанавливать сниженную или полностью нарушенную активность рецепторов S1P.

Модификация может представлять собой модификацию любого типа (стабильную или транзиторную, предпочтительно стабильную), ведущую к уменьшению активности рецептора S1P и/или активности PAM (т.е. их способности уменьшать уровни внеклеточного цАМФ, перемещение PAM, ингибировать AC или их способность снижать восприятие боли), стабильному уровню рецептора S1P или транскрипта PAM (т.е. посредством ингибирования транскрипции рецептора S1P или PAM или стабилизации транскрипта) или стабильному уровню белка рецептора S1P или PAM (т.е. посредством инактивации трансляции рецептора S1P или PAM или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции его посттрансляционной модификации или посредством инактивации его стабилизации или посредством увеличения его разрушения). Этого можно достигнуть, например, с применением доминантных негативных мутантов рецепторов S1P или PAM, антисмысловых нуклеотидов, конструкций RNAi, посредством образования функциональных или геномных нокаутов рецепторов S1P или PAM (которые, например, можно индуцировать) или посредством других пригодных способов, известных в данной области. Для обзора указанных выше способов см., например: Current protocols in Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al., 2003.

По предпочтительному варианту осуществления применяют клетки с нокаутом PAM. Пригодные клеточные линии для получения нокаутов хорошо известны в данной области и описаны, например, в Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc., или Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L. Joyner, IRL Press.

Активность S1P можно определять или непосредственно, например, по его способности (или способности его фрагментов или производных) взаимодействовать, по меньшей мере, с одним из его рецепторов или их функциональными фрагментами или инициировать перемещение PAM к клеточной мембране, или ее можно определять косвенно, например, по его способности (или способности его функциональных фрагментов или производных) уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ, модулировать концентрации ионов в нейронах, ингибировать функционирование AC или его способности модулировать, особенно уменьшать, восприятие боли. Пригодные способы уменьшения указанных выше параметров хорошо известны в данной области (см. также выше): например, уровни цАМФ можно измерять посредством HTRF или ALPHAscreen™, концентрации ионов, например, можно рассчитывать посредством фиксации потенциала или пригодных красителей, восприятие боли можно измерять, например, посредством формалинового теста или тестов механической или термической гипералгезии или посредством теста горячей пластинки и тому подобное. Взаимодей