Способ снижения концентрации аммиака в крови с помощью аммоцитов и инкапсулированной глутаминсинтетазы

Способ снижения концентрации аммиака в крови с помощью аммоцитов и инкапсулированной глутаминсинтетазы

Реферат

Использование: в области медицинской биохимии, в частности при острой аммиачной интоксикации.

Сущность изобретения: получение эритроцитов с включенной диализным методом глумаминсинтетазой (аммоцитов). Аммоциты вводят внутривенно животным и через 0.5-2 часа определяют концентрацию аммиака в крови. Способ позволяет снизить концентрацию аммиака в крови в 1.5-4 раза в первые 2 часа острого аммиачного отравления.

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано для снижения концентрации токсичного аммиака в крови с помощью внедренного в эритроциты фермента. Эритроциты-носители, заполненные ферментом и предназначенные для снижения концентрации аммиака в крови (названные нами аммоцитами), не равнозначны целым эритроцитам по метаболическим свойствам. Аммоциты содержат в себе специальный фермент, который способен нейтрализовать токсичный аммиак и который отсутствует в нормальных эритроцитах. Такая способность аммоцитов зависит от используемого фермента, способа включения фермента в эритроциты и последующей обработки вновь полученных клеток.

Известен способ внедрения в эритроциты L-аспарагиназы в качестве лекарственного препарата (Аграненко В.А., Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Кияткин А.Б., Жаботинский A.M., Маркова Н.А., Синауридзе Е.И. Способ консервирования фармакоцитов с включенной L-аспарагиназой. Патент РФ №1777887, опубл. 30.11.1992). Целью разработки этого способа было хранение лекарственного препарата в консервированной донорской крови для возможного его применения в будущем. Недостатками способа являются то, что он не предназначен для снижения концентрации аммиака в крови.

Известен способ снижения концентрации аммиака в крови мыши с помощью эритроцитов и инкапсулированной в них глутаматдегидрогеназы (Sanz S., Lizano С., Luque J., Pinilla M. In vitro and in vivo study of glutamate dehydrogenase encapsulated into mouse erythrocytes by a hypotonic dialysis procedure. Life Sci. 1999, 65(26), 2781-2789). Способ испытан при хроническом аммиачном отравлении у мышей. Этот способ наиболее близок к предлагаемому в данном изобретении и применен как прототип.

Целью изобретения является разработка способа снижения концентрации патологически высокой концентрации аммиака в крови с помощью аммоцитов - эритроцитов с инкапсулированным в них ферментом глутаминсинтетазой. Поставленная цель достигается путем строгой стандартизации процесса диализного получения эритроцитов-носителей. Отличие предлагаемого способа от прототипа состоит в том, что эритроциты-носители нагружаются глутаминсинтетазой.

Пример. Получение и хранение аммоцитов с инкапсулированной глутаминсинтетазой. Для приготовления эритроцитов-носителей с глутаминсинтетазой внутри использовали эритроциты, полученные путем удаления плазмы из крови лабораторных крыс и последующего трехкратного их промывания.

Кровь отбирали у крысы в пробирку с 2 мл гепарина (40 ед/мл), ценрифугировали 10 мин при 1000 g и 4°С. Плазму удаляли. Осадок с клетками промывали трижды при 2500 g, 10 мин, 4°С раствором, содержащим 10 мМ КН₂РО₄, 3.5 мМ КСl, 1.5 мМ MgCl₂, 145 мМ NaCl, рН 7.4.

Промытые эритроциты (1 мл) смешивали с 0.3 мл буферного раствора, содержащего 75 мМ КС1, 75 мМ Na₂HPО₄, 10 мМ меркаптоэтанол, рН 8.0, и 2 ед. глутаминсинтетазы (гематокрит суспензии 15%).

Смесь переносили в диализный мешок (CelluSep H1, размер поры 15000 Да). Гипотонический диализ проводили 3 часа в диализной установке в 100 мл лизирующего раствора, содержащего 5 мМ КН₂РО₄, 5 мМ глюкозу, 2 мМ MgCl₂, 1.5 мМ АТФ, 0.1 мМ НАД, 3 мМ глутатион, 2.3 мМ меркаптоэтанол, рН 7.45, при 4°С и при непрерывном перемешивании.

По окончании диализа смесь переносили в пластмассовый бюкс и подвергали «закалке»: 10-минутному перемешиванию на шейкере при 100 качаниях/мин и 37°С. Затем клеточные мембраны «замыкали» добавлением 0.7 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ NaH₂PO₄, рН 7.4, 30 мМ инозин, 30 мМ глюкозу, 30 мМ пируват натрия, 1.5 мМ аденин и 3%-ный NaCl, и инкубацией 5 мин при 37°С и 100 качаниях/мин

Аммониты промывали 10 мин при 4°С и 200 g раствором, содержащим 10 мМ КН₂РО₄, рН 7.4, 3.5 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl₂, 145 мМ NaCl, 6 мМ глюкозу, ресуспендировали в этом растворе и в течение 0-24 час использовали для введения крысам с экспериментальной острой гипераммонемией.

Каждой крысе опытной группы вводили внутрибрюшинно 0.3 мл 0.25 М ацетата аммония (доза 2.5 ммоль/кг массы тела). Непосредственно перед этим контрольным животным вводили внутривенно 0.4 мл смеси 0.9%-ного NaCl и 5 мМ глюкозы, опытным - внутривенно 0.4 мл аммонитов с инокулированной глутаминсинтетазой. Кровь у этих крыс отбирали через 30 и 60 мин из ретроорбитального венозного сплетения, через 120 мин - смешанную при декапитации.

Удельная активность глутаминсинтетазы в аммоцитах составила 1.35 мкмоль/мин·мл, а степень включения фермента в клетки - 15.7%.

Изменения концентрации аммиака в крови у крыс с гипераммонемией во времени и после введения аммоцитов с глутаминсинтетазой показаны в таблице.

Таблица
Время после введения аммиака, минуты	Концентрация аммиака в крови, мМ
Контроль (введены 0.9%-ный NaCl и глюкоза)	Опыт (введены аммоциты)
30	0.94±0.16 (n=4)	0.52±0.09 (n=4)
60	0.84±0.02 (n=2)	0.57±0.00 (n=2)
120	0.95±0.26 (n=4)	0.22±0.05 (n=3)

Способ снижения концентрации аммиака в крови с помощью эритроцитов с инкапсулированным ферментом, отличающийся тем, что в качестве такого фермента используется глутаминсинтетаза, и заключающийся в том, что в эритроциты инкапсулируют диализным методом глутаминсинтетазу, полученные аммоциты вводят внутривенно животным с экспериментальной острой гипераммонемией и через разное время измеряют концентрацию аммиака в крови.