Конъюгат полипептида фактора vii, способ его получения, его применение и содержащая его фармацевтическая композиция

Конъюгат полипептида фактора vii, способ его получения, его применение и содержащая его фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, включающим конъюгаты фактора VII, которые обладают заданным характером гликозилирования.

Предпосылки создания изобретения

Фактор VII представляет собой витамин К-зависимый белок плазмы, синтезируемый в печени и секретируемый в кровоток в виде одноцепочечного гликопротеина с молекулярной массой примерно 50 кДа. Зимоген фактора VII превращается в активированную форму (фактор VIIа (FVIIа)) путем протеолитического расщепления. FVIIа в комплексе с тканевым фактором (ТФ) способен превращать и фактор IX, и фактор Х в их активированные формы, которые впоследствии участвуют в реакциях, ведущих к быстрому генерированию тромбина и образованию фибрина.

Белки, участвующие в каскаде процесса свертывания крови, включающие, например, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор Х и белок С, являются, как уже доказано, полезными терапевтическими средствами, применяемыми для лечения множества патологических состояний. Соответственно, имеется повышенная потребность в композициях, включающих указанные белки, которые были бы фармацевтически приемлемыми и обладали однородной и заданной клинической эффективностью.

В связи с тем, что использование человеческой плазмы в качестве источника фармацевтических продуктов имеет множество недостатков, предпочтительно получать такие белки с использованием рекомбинантных систем. Белки свертывания, однако, являются объектом множества модификаций, осуществляемых в процессе трансляции и после трансляции, которые включают, например, аспарагинсвязанное (N-связанное) гликозилирование, О-связанное гликозилирование и γ-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты. Указанные модификации могут количественно и качественно отличаться в случае использования гетерологичных клеток в качестве хозяйских клеток для крупномасштабного получения белков. В частности, процесс получения в системе гетерологичных клеток зачастую приводит к получению разной совокупности гликоформ, которые характеризуются наличием идентичных полипептидов, обладающих разными ковалентно присоединенными олигосахаридными структурами.

В разных системах вариации в структуре олигосахаридной части терапевтических белков связаны, в том числе, с изменениями в иммуногенности и клиренсе in vivo.

Кроме клиренса in vivo существенным для определения периода полувыведения in vivo является длительность периода времени, в течение которого указанные соединения являются "терапевтически доступными" в организме.

Период полувыведения циркулирующего в крови rFVIIа составляет примерно 2,3 часа ("Summary Basis for Approval for NovoSeven©", FDA reference number 96-0597).

Коммерческие препараты человеческого рекомбинантного фактора VIIа предлагаются в виде препарата NovoSeven®. Препарат NovoSeven® представляет собой единственный рекомбинантный фактор VIIа, применяемый для эффективного и надежного лечения кровотечений, который доступен на фармацевтическом рынке. Относительно высокие дозы и частое введение препарата необходимы для достижения и поддержания желательного терапевтического или профилактического эффекта. Как следствие такого режима возникает сложность в регуляции адекватной дозы и потребность в частых внутривенных введениях, что накладывает определенные ограничения на качество жизни пациентов.

Молекула с более длительным периодов полувыведения из кровотока могла бы способствовать снижению количества необходимых введений. В связи со связью имеющегося в настоящее время продукта фактора VIIа с частыми введениями имеется явная потребность в создании улучшенных молекул фактора VII.

Одним из способов улучшения циркуляции является создание условий, при которых уровень клиренса из организма будет снижен. Как отмечалось, вариации в структуре олигосахарида в терапевтических белках связаны, в числе других факторов, с клиренсом in vivo. Более того, присоединение химического фрагмента к полипептидам может сказываться на снижении почечного клиренса полипептида.

Имеются сообщения о неактивных формах фактора VII. Инактивированная форма способна вступать в конкуренцию с фактором VII или фактором VIIа дикого типа по связыванию с тканевым фактором и ингибировать свертывающую активность. Предполагается, что инактивированная форма фактора VIIа будет использоваться для лечения пациентов в состояниях, характеризующихся гиперкоагуляцией, таких как пациенты с сепсисом, пациенты, имеющие риск развития инфаркта миокарда или тромботического кровоизлияния.

В патенте WO 98/32466 высказывается предположение о том, что фактор VII в числе многих других белков может подвергаться модификации с присоединением ПЭГ-группировки, то есть ПЭГилированию, но никакой другой информации по данному аспекту в указанном патенте не содержалось.

В патенте WO 01/58935 заявляются конъюгаты неполипептидных фрагментов (например, ПЭГ) с полипептидом, аминокислотная последовательность которого отличается от последовательности фактора VII дикого типа за счет того, что в нее вводится или из нее удаляется по меньшей мере один аминокислотный остаток, включающий присоединяемую группу для неполипептидного фрагмента.

В патенте США 4847325 высказывается предположение о том, что колониестимулирующий фактор-1 (КСФ-1) может быть присоединен к ПЭГ посредством реакции производных ПЭГ с окисленным КСФ-1.

Таким образом, имеется потребность в создании композиций и разработке способов, которые обеспечили бы получение белковых препаратов для свертывания крови, в частности препаратов, содержащих улучшенный рекомбинантный человеческий фактор VII, модифицированный фактор VII или фактор VII-родственный полипептид.

Краткое описание сущности изобретения

Авторы настоящего изобретения показали, что препараты полипептида фактора VII, обладающие характеристиками гликоформы и содержащие по меньшей мере одну олигосахаридную группу, ковалентно присоединенную по меньшей мере к одной полимерной группе, проявляют улучшенные функциональные свойства. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые обеспечивают получение таких конъюгатных белковых препаратов.

Соответственно, настоящее изобретение относится, в первом аспекте, к препарату, включающему множество полипептидов фактора VII или фактор VII-родственных полипептидов, где указанные полипептиды включают аспарагин-связанные и/или серин-связанные олигосахаридные цепи и где по меньшей мере одна олигосахаридная группа ковалентно присоединена по меньшей мере к одной полимерной группе.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полимерная группа ковалентно присоединяется к фрагменту сиаловой кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полимерная группа ковалентно присоединяется к фрагменту галактозы.

В одном варианте осуществления изобретения примерно 94-100% олигосахаридных цепей включают по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты.

В одном варианте осуществления изобретения примерно 94-100% олигосахаридных цепей включают по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты, где менее чем примерно 25% олигосахаридных цепей включают по меньшей мере одну не кэппированную антенну.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения меньше, чем примерно 10%, олигосахаридных цепей включают по меньшей мере одну не кэппированную антенну.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения меньше, чем примерно 5%, предпочтительно меньше, чем примерно 2%, олигосахаридных цепей содержат по меньшей мере одну не кэппированную антенну.

В одном варианте осуществления изобретения примерно 96-100% олигосахаридных цепей включают по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения примерно 98-100% олигосахаридных цепей включают по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи расположены в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам Asn-145 и Asn-322 человеческого фактора VIIа дикого типа (см. в конце описания).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения серинсвязанные олигосахаридные цепи расположены в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам Ser-52 и Ser-60 человеческого фактора VIIа дикого типа (фиг. 1).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные полимеры выбирают из группы, состоящей из полиалкиленоксидов (ПАО), включающих полиалкиленгликоль (ПАГ), такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полипропиленгликоль (ППГ), разветвленные ПЭГи, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, ангидрид сополимера полиэтилена и малеиновой кислоты, ангидрид сополимера полистирола и малеиновой кислоты и декстран, включающий карбоксиметилдекстран, полиуретан, полиэфир и полиамид.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), в одном варианте осуществления настоящего изобретения полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ с молекулярной массой 300-100000 Да, такой как примерно 500-20000 Да или примерно 500-15000 Да, или 2-15 кДа, или 3-15 кДа, или 3-12 кДа, или примерно 10 кДа.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид имеет аминокислотную последовательность фактора VII дикого типа (фиг.1). В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды представляют собой фактор VIIа дикого типа.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды фактора VII выбирают из группы, состоящей из S52-фактора VII, S60-фактора VII, фактора VII, который был протеолитически расщеплен на участке между остатками 290 и 291; фактора VII, который был протеолитически расщеплен на участке между остатками 315 и 316; фактора VII, который был окислен, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F347P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII; вариантных последовательностей фактора VII, где аминокислотный остаток в положениях 290 и/или 291, предпочтительно 290, замещен, и вариантных последовательностей фактора VII, где аминокислотный остаток в положениях 315 и/или 316, предпочтительно 315, замещен. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды фактора VII выбирают из группы, состоящей из вариантов фактора VII, обладающих повышенной биологической активностью в сравнении с фактором VIIа дикого типа, описанных в документах WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/77218, WO 03/27147 и WO 03/37932:

полипептидов фактора FVII, включающих замещения, добавления или делеции в аминокислотной последовательности фактора VII на участке от 233Thr до 240Asn, фактора VII, включающего замещения, добавления или делеции в аминокислотной последовательности на участке от 304Arg до 329Cys, и фактора VII, включающего замещения, делеции или добавления в аминокислотной последовательности на участке от Ile153 до Arg223.

В одном варианте осуществления изобретения фактор VII-родственные полипептиды выбирают из группы, состоящей из: R152E-фактора VII, S344A-фактора VII, FFR-фактора VII и фактора VII, не содержащего Gla-домена.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фактор VII-родственные полипептиды демонстрируют активность по меньшей мере примерно на уровне 25%, предпочтительно по меньшей мере примерно на уровне 50%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на уровне 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на уровне 90% от удельной активности фактора VIIа дикого типа, который получают в том же типе клеток, при анализе в рамках одного или более тестов: тесте на свертывание, тесте на протеолиз или тесте на связывание с TФ, как описано в настоящем описании.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фактор VII-родственные полипептиды демонстрируют активность менее чем примерно на уровне 25%, предпочтительно менее чем примерно на уровне 10%, более предпочтительно менее чем примерно на уровне 5%, и наиболее предпочтительно менее чем примерно на уровне 1%, от удельной активности фактора VIIа дикого типа, который получают в том же типе клеток, при анализе в рамках одного или более тестов: тесте на свертывание, тесте на протеолиз или тесте на связывание с TФ, как описано в настоящем описании.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгированный полипептид демонстрирует биологическую доступность, которая составляет по меньшей мере примерно 110% от биологической доступности эталонного препарата, например, по меньшей мере примерно 120% или по меньшей мере примерно 130%, или по меньшей мере примерно 140% от биологической доступности эталонного препарата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированный полипептид демонстрирует период полувыведения сыворотки, который составляет по меньшей мере примерно 125% от периода полувыведения эталонного препарата, в частности по меньшей мере примерно 150% или по меньшей мере 200%, или по меньшей мере примерно 250% от периода полувыведения эталонного препарата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгированный полипептид получают путем ферментативной модификации фрагментов сиаловой кислоты или галактозы в полипептиде.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения препарата по пункту 1, где указанный способ включает стадию приведения в контакт олигосахаридсодержащего полипептида с полимерной молекулой в условиях, при которых по меньшей мере одна полимерная молекула ковалентно присоединяется по меньшей мере к одной из ологисахаридных цепей полипептидов.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей препарат, определенный в любом из пунктов 1-22, и фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению препарата, включающего множество полипептидов фактора VII или фактор VII-родственных полипептидов, где указанные полипептиды включают аспарагинсвязанные и/или серинсвязанные олигосахаридные цепи и где по меньшей мере одна олигосахаридная группа ковалентно присоединяется по меньшей мере к одной полимерной группе, при получении лекарственного средства, предназначенного для лечения фактор VII-реактивного синдрома.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения фактор VII-реактивного синдрома, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей препарат, описанный в пунктах 1-22, пациенту, при потребности в таком лечении, в условиях, которые приводят к снижению кровотечению и/или к повышению уровня свертывания крови.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром выбирают из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, недостаточности фактора XI, недостаточности фактора VII, тромбоцитопении, болезни Виллебранда, состояния, связанного с наличием ингибитора фактора свертывания, после хирургического вмешательства, после травмы, после антикоагуляционной терапии, включающей дилюционную коагулопатию, а также внутричерепного кровотечения, трансплантации стволовых клеток, кровотечения в верхней части желудочно-кишечного тракта и болезни печени.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения нежелательного кровотечения, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей препарат, описанный в пунктах 1-22, пациенту, при потребности в таком лечении, в условиях, которые приводят к снижению уровня кровотечения и/или к повышению уровня свертывания крови.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения нежелательного свертывания крови, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей препарат, описанный в пунктах 1-22, пациенту, при потребности в таком лечении, в условиях, эффективных для подавления свертывания.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения нежелательное свертывание крови связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из ангиопластики, тромбоза глубоких вен, легочной эмболии, кровоизлияния, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома), отложения фибрина в легких и почках, связанного с эндотоксемией, вызванной грамотрицательными бактериями, и инфаркта миокарда.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения реакций, опосредованных тканевым фактором, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей препарат, описанный в пунктах 1-22, пациенту, при потребности в таком лечении, в условиях, эффективных для подавления свертывания крови.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная реакция, опосредованная тканевым фактором, относится к состоянию, выбранному из группы, состоящей из воспаления, рака, роста опухоли, метастаз, ангиогенеза, ССВР(SIRS), ОПЛ (ALI), РДСВ, МНО (MOF), ГУС (HUS) и ТЦП.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что препараты, включающие белки коагуляции, обладают характеристиками гликоформ, в которых по меньшей мере одна олигосахаридная группа ковалентно присоединяется по меньшей мере к одной полимерной группе, такой как например ПЭГ, демонстрируя при этом улучшенные функциональные свойства. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые позволяют создать указанные препараты конъюгированного белка. В частности, настоящее изобретение относится к препаратам, включающим полипептиды фактора VII и фактор VII-родственные полипептиды, обладающие характеристиками аспарагинсвязанных (N-связанных) и серинсвязанных (О-связанных) олигосахаридов, ковалентно присоединенных по меньшей мере к одной полимерной группе. Препараты по настоящему изобретению демонстрируют измененные свойства, которые включают, без ограничения, улучшенные фармакокинетические свойства и повышенную клиническую эффективность. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают указанные препараты, а также к способам лечения с помощью данных композиций.

В контексте настоящего описания термин "ковалентное присоединение" указывает на то, что олигосахаридный фрагмент и полимерная молекула либо непосредственно ковалентно соединены друг с другом, либо опосредованно ковалентно соединены друг с другом через разделяющий фрагмент или фрагменты, такие как мостик, спейсер или один или более связующих фрагментов.

Термин "конъюгат" или используемый взаимозаменяемо термин "конъюгированный полипептид" обозначают гетерогенную (в смысле композитную или химерную) молекулу, образованную при ковалентном присоединении одного или более полипептидов к одной или более полимерным молекулам.

Термин "полимерная молекула" или используемый взаимозаменяемо термин "полимерная группа" или "полимерный фрагмент" или "молекула полимера" относится к молекуле, которая способна конъюгировать с присоединяющей группой в полипептиде. При использовании данного термина для описания конъюгата по настоящему изобретению следует понимать, что полимерная молекула (или фрагмент) соединяются с полипептидной частью конъюгата через присоединяющую группу олигосахаридной цепи гликопротеина, предпочтительно полимерная молекула присоединяется к фрагменту сиаловой кислоты, кэппирующему олигосахарид («кэппинг-группа сиаловой кислоты»), или к галактозному фрагменту.

Полимерная молекула представляет собой молекулу, образованную путем ковалентного связывания двух или более мономеров, где ни один из мономеров не представляет собой аминокислотный остаток. Предпочтительные полимеры представляют собой полимерные молекулы, выбранные из группы, состоящей из полиалкиленоксида (ПАО), включающего полиалкиленгликоль (ПАГ), такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полипропиленгликоль (ППГ), разветвленные ПЭГи, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, ангидрид сополимера полиэтилена и малеиновой кислоты, ангидрид сополимера полистирола и малеиновой кислоты и декстран, включающий карбоксиметилдекстран, при этом особенно предпочтительным является ПЭГ.

Термин "присоединяющая группа" в контексте настоящего описания обозначает функциональную группу олигосахаридного фрагмента, способную присоединять полимерную молекулу. Используемые полимерные группы включают, например, амин, гидроксил, карбоксил, альдегид, кетон, сульфгидрил, сукцинимидил, малеимид, винилсульфон и галогенацетат.

Присоединяющая группа на олигосахаридном фрагменте может быть активирована перед реакцией с полимером. Альтернативно, группа, присутствующая на полимере, может быть активирована перед реакцией с олигосахаридным фрагментом. Активированная группа, которая может присутствовать на олигосахаридном или полимерном фрагменте, может иметь вид активированной удаляемой группы.

Термин "активированная удаляемая группа" включает фрагменты, которые легко замещаются в реакции замещения, осуществляемой с помощью органических соединений или ферментов. Активированные удаляемые группы известны в данной области техники и описаны в литературе (см., например, Vocadlo et al., In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol 2, Wiley-VCH Verlag, Germany (2000); Kodama et al., Tetrahedron Letters 34: 6419 (1993); Lougheed et al., J. Biol. Chem. 274:37717 (1999)).

Методы и химическая природа активации полимеров описаны в литературе. Обычно используемые методы активации полимеров включают активацию функциональных групп цианогенбромидом, периодатом, глутаральдегидом, биэпоксидами, эпихлоргидрином, дивинилсульфоном, карбодиимидом, сульфонилгалогенидами, трихлортриазином и т.п. (см., например, Taylor (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Application, Marsel Dekker, N.Y.: Wong (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; Hermanson et al., (1993) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991).

Реактивные группы и классы реакций, используемые в практике осуществления настоящего изобретения, в основном включают те из них, которые осуществляются в относительно мягких условиях. Указанные группы и классы включают, без ограничения, реакции нуклеофильного замещения (например, реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активными сложными эфирами), реакции электрофильного замещения (например, реакции енамина) и реакции присоединения к углерод-углеродным связям и связям углерод-гетероатом (например, реакция Михаэля, реакции присоединения Дильса-Альдера). Указанные и другие используемые в технике методы описаны в соответствующих руководствах (см., например, March, Advanced Organic Chemistry, 3^rd edition, John Wiley & Sons, N.Y. 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney et al., Modification of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol 198, American Chemical Society, 1982).

Реактивные функциональные группы могут быть выбраны таким образом, что они не будут участвовать или препятствовать реакциям, необходимым для сборки олигосахаридного и полимерного фрагмента. Альтернативно, реактивная функциональная группа может быть защищена от участия в реакции за счет присутствия защитной группы. Примеры используемых защитных групп приведены, в частности, в работе Грина с соавт. (Green et al., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley&Sons, N.Y., 1991).

Основные подходы, осуществляемые для объединения углеводов с другими молекулами, описаны в литературе (см, например, Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990); и Bednarski et al., WO 92/18135).

Термин "природный сайт гликозилирования" в контексте настоящего описания обозначает сайты гликозилирования в положениях Asn-145 (N145), Asn-322 (N322), Ser-52 (S52), и Ser-60 (S60). Аналогично, термин "природный сайт О-гликозилирования in vivo" включает положения S52 и S60, тогда как термин "природный сайт N-гликозилирования in vivo" включает положения N145 и N322.

Термин "функциональный полупериод существования in vivo" используется в обычном значении для данного термина, то есть указывает время, в течение которого 50% биологической активности полипептида или конъюгата все еще присутствуют в организме и/или в органе-мишени, или время, в течение которого активность полипептида или конъюгата составляет 50% от его исходного значения. В качестве альтернативного варианта определения функционального полупериода существования in vivo может быть использован термин "период полувыведения из сыворотки", определяемый как время, в течение которого 50% полипептидных или конъюгатных молекул циркулируют в плазме или кровотоке перед выведением из организма. Определение периода полувыведения из сыворотки часто проще, чем определение функционального полупериода существования, и значение периода полувыведения из сыворотки обычно является хорошим показателем величины функционального полупериода существования in vivo. Альтернативные термины для характеристики периода полувыведения из сыворотки включают период полувыведения из плазмы, период полувыведения из кровотока, полупериод циркуляции в крови, клиренс из сыворотки, клиренс из плазмы и полупериод клиренса. Полипептид или конъюгат выводится из организма посредством функционирования одной или более ретикулоэндотелиальных систем (РЭС), почки, селезенки или печени, под действием тканевого фактора, рецептора SEC или путем выведения, опосредованного другими рецепторами, или путем специфического или неспецифического протеолиза. В норме величина клиренса зависит от размеров (относительно размера отсекаемых при клубочковой фильтрации соединений), заряда, природы присоединяемых углеводных цепей и от наличия клеточных рецепторов для белка. Сохраняемую функциональность обычно выбирают из прокоагулирующей, протеолитической активности, активности по связыванию с кофактором или рецептором. Функциональный полупериод существования и период полувыведения из сыворотки может быть определен способом, известным в данной области техники, который описан ниже (см. раздел "Функциональные свойства препаратов фактора VII").

Термин "повышенный" в контексте определения функционального полупериода существования in vivo или периода полувыведения из плазмы в контексте настоящего описания указывает на то, что релевантный период полувыведения полипептида или конъюгата статистически значимо повышается в сравнении с соответствующим показателем для эталонной молекулы, такой как неконъюгированный фактор VIIа (например фактор VIIа дикого типа) при определении в сравнимых условиях. Например, релевантный период полувыведения может быть повышен по меньшей мере примерно на 25%, в частности по меньшей мере примерно на 50%, в частности по меньшей мере примерно на 100%, 150%, 200%, 250% или 500%.

Термин "иммуногенность" препарата относится к способности препарата при его введении в организм человека выявлять неблагоприятный иммунный ответ, независимо от того, является ли он гуморальным, клеточным или имеет объединенную природу. В отношении полипептида фактора VIIa и фактора VIIa-родственных полипептидов неизвестно, чтобы они проявляли заметные иммунные реакции у людей. Тем не менее, в любой подгруппе людей могут встречаться индивидуумы, которые проявляют чувствительность к конкретным вводимым белкам. Иммуногенность может быть определена путем количественного измерения уровня имеющихся антител к фактору VII и/или Т-клеток, реактивных в отношении фактора VII, у чувствительных индивидуумов с использованием традиционных методик, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описываемые в нем препараты приводят к снижению уровня иммуногенности у чувствительного индивидуума по меньшей мере примерно на 10%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 50% относительно иммуногенности, свойственной индивидууму на эталонный препарат.

Термин "аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотным остаткам S52, S60, N145, N322 на фиг.1 (FVII масс.)" обозначает аминокислотные остатки Asn и Ser, соответствующие последовательности фактора VII дикого типа (фиг.1), при сопоставлении последовательностей. Гомогенность/идентичность аминокислотных последовательностей определяется при сопоставлении последовательности с использованием соответствующей компьютерной программы, применяемой для сопоставления последовательностей, такой как, например, программа ClustalW, версия 1.8, 1999 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680).

Полипептиды фактора VII и фактор VII-родственные полипептиды

Настоящее изобретение относится к полипептидам человеческого фактора VII, таким как, например, полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, описанную в патенте США No. 4784905 (фактор VII дикого типа). В контексте настоящего описания термины "фактор VII" и "полипептид фактора VII" обозначают фактор VII дикого типа, а также варианты фактора VII, обладающие по существу той же или улучшенной биологической активностью, что и фактор VII дикого типа. Термин "фактор VII" в контексте настоящего описания обозначает полипептиды фактора VII в их нерасщепленной форме (в форме зимогена), а также такие формы, которые после протеолитической обработки образуют соответствующие биологически активные формы и которые могут быть обозначены как фактор VIIа. В типичном случае фактор VII расщепляется на участке между остатками 152 и 153 с образованием фактора VIIа.

В контексте настоящего описания термин "фактор VII-родственные полипептиды" относится к полипептидам, включая их варианты, для которых биологическая активность указанного фактора VIIа по существу модифицирована или снижена относительно активности фактора VII дикого типа. Указанные полипептиды включают, без ограничения, фактор VII или фактор VIIа, которые были химически модифицированы, и варианты фактора VII, в которые введены специфические изменения аминокислотной последовательности, модифицирующие или нарушающие биологическую активность полипептида.

Биологическая активность фактора VIIа в процессе свертывания крови вытекает из его способности (i) связываться с тканевым фактором (ТФ) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора Х с образованием активированных форм фактора IX или фактора Х (фактора IХа или фактора Ха, соответственно). Для целей настоящего изобретения биологическая активность фактора VIIа может быть количественно определена путем измерения способности данного препарата ускорять свертывание крови с использованием плазмы, дефицитной по фактору VII и тромбопластину, как описано, например, в патенте США No. 5997864. В данном тесте биологическая активность выражается в виде снижения времени свертывания крови относительно контрольного образца и указанную величину преобразуют в "единицы фактора VII" при сравнении с объединенной стандартной сывороткой человека, содержащей активность фактора VII, равную 1 Ед/мл. Альтернативно, биологическая активность фактора VII может быть количественно определена (i) путем измерения способности фактора VIIа образовывать фактор Ха в системе, включающей ТФ, погруженный в липидную мембрану, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) путем измерения уровня гидролиза фактора Х в водной системе (см. приведенный ниже пример 5); (iii) путем измерения уровня физического связывания ТФ с использованием инструмента, основанного на поверхностном резонансе плазмона (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) (iv) путем измерения уровня гидролиза синтетических субстратов (см. приведенный ниже пример 4); и (v) путем измерения уровня образования тромбина в ТФ-независимой системе in vitro.

Варианты фактора VII, обладающие по существу той же или улучшенной биологической активностью в сравнении с фактором VII дикого типа, включают те из них, которые демонстрируют активность по меньшей мере примерно на уровне 25%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на уровне 50%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на уровне 75% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на уровне 90% от удельной активности фактора VIIа дикого типа, который продуцируется в клетках того же типа, при тестировании в одном или более тестах: тесте на свертывание крови, тесте на протеолиз или тесте на связывание с ТФ, как описано выше. Варианты фактора VII, обладающие по существу сниженной биологической активностью относительно фактора VIIа дикого типа, включают те из них, которые демонстрируют активность, составляющую менее чем примерно 25%, предпочтительно менее чем примерно 10%, более предпочтительно менее чем примерно 5% и наиболее предпочтительно менее чем примерно 1% от удельной активности фактора VIIа дикого типа, который продуцируется в клетках того же типа при тестировании в одном или более тестах: тесте на свертывание крови, тесте на протеолиз или тесте на связывание с ТФ, как описано выше. Варианты фактора VII, обладающие по существу модифицированной биологической активностью относительно фактора VII дикого типа, включают, без ограничения, варианты фактора VII, которые демонстрируют ТФ-независимую протеолитическую активность фактора Х и которые связываются с ТФ, но не расщепляют фактор Х.

Варианты фактора VII, независимо от того, демонстрируют ли они по существу ту же или улучшенную биологическую активность фактора VII дикого типа или, альтернативно, демонстрируют по существу модифицированную или сниженную биологическая активность фактора VII дикого типа, включают, без ограничения, полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа за счет наличия вставок, делеций или замещений одной или более аминокислот.

Неограничивающие примеры фактор VII-родственных полипептидов, обладающих по существу той же или улучшенной биологической активностью, что и фактор VII дикого типа, включают S52A-FVII, S60A-FVII (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII; варианты FVIIa, которые демонстрируют повышенную протеолитическую активность, как описано в патенте США No. 5580560; фактор VIIа, который был протеолитически расщеплен на участке между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIа (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999), варианты последовательности фактора VII, в которых аминокислотные остатки в положении 290 и/или 291 (фиг. 1), предпочтительно 290, замещены, и варианты последовательности фактора VII, в которых были замещены аминокислотные остатки в положениях 315 и/или 316 (фиг. 1), предпочтительно в положении 315.

Неограничивающие примеры фактор VII-родственных полипептидов, обладающих по существу той же или улучшенной биологической активностью, что и фактор VII дикого типа, включают: варианты фактора VII, обладающие повышенной биологической активностью в сравнении с фактором VII дикого типа, раскрытым в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/77218, WO 03/27147 и WO 03/37932, включающие, без ограничения,

фактор VII, включающий замещения, добавки или делеции в аминокислотной последовательности на участке от 233Thr до 240Asn, фактор VII, включающий замещения, добавки или делеции в аминокислотной последовательности на участке от 304Arg до 329Cys, и фактор VII, включающий замещения, добавки или делеции в аминокислотной последовательности на участке от Ile153 до Arg223.

Неограничивающие примеры фактор VII-родственных полипептидов, обладающих по существу сниженной или модифицированной биологической активностью относительно фактора VII дикого типа, включают R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J.Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), фактор VIIа, в котором отсутствует домен Gla (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993), и фактор VII, в котором Lys341 заменен на Ala. Неограничивающие примеры химически модифицированных полипептидов фактор VII и вариа