Антитело против интерферон- / -связывающего белка i (ifnab-bpi)

Антитело против интерферон- / -связывающего белка i (ifnab-bpi)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается новых интерферон-α/β-связывающих белков, способных модулировать активность различных подтипов интерферона-α (IFN-α), а также активность интерферона-β. Изобретение, в частности, касается клонирования молекул ДНК, кодирующих указанные белки, их экспрессии в клетках-хозяевах и антител против указанных белков.

В заявке на выдачу патента Израиля 103052 описывается и заявляется растворимый рецепторный белок интерферона-α с молекулярной массой около 45000 Да, выявленный по методу вестерн-блоттинга с помощью моноклональных антител против рецептора интерферона-α. В указанной заявке описывается и заявляется также другой растворимый связывающий интерферон-α белок, имеющий молекулярную массу около 40000 Да, который выявили с помощью связывания с ¹²⁵I-IFN-α2 и иммуноосаждением с помощью анти-IFN-α моноклональных антител. Если их выделяют из сыворотки крови, то указанные соединения имеют молекулярную массу 50 кДа. В заявке на выдачу патента Израиля 106591 описывается и заявляется указанный выше интерферон-α-связывающий белок с молекулярной массой 40000 Да (далее обозначается “IFNAB-BP” или “IFNAB-BPII”), который выделяется из мочи в гомогенном виде и имеет последовательность, которая отличается от любого известного белка. IFNAB-BP связывает и блокирует активность различных подтипов интерферона-α, а также интерферона-β. По этой причине характеристики связывания IFNAB-BP значительно отличаются от ранее описанных рецепторов интерферона на поверхности клеток, которые соответствуют лишь интерферону-αβ человека.

В соответствии с настоящим изобретением две комплементарные молекулы ДНК (кДНК), кодирующие предшественники IFNAB-BP, клонируют и определяют последовательность их аминокислотных остатков. Вероятно, обе они получаются из одного и того же гена, например, путем альтернативного сплайсинга. Описывается также продуцирование двух рекомбинантных белков, обозначаемых IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, в клетках млекопитающих и других клетках-хозяевах. Заявляются также поликлональные и моноклональные антитела, направленные против IFNAB-BP, применимые для блокирования рецептора интерферона, для проведения иммуноанализов и иммуноочистки IFNAB-BPI и IFNAB-BPII.

IFNAB-BPI и IFNAB-BPII способны модулировать активность интерферонов типа I, т.е. различных подтипов интерферона-α, а также интерферона-β. Таким образом, они могут подавлять нежелательное воздействие интерферонов типа I.

Предпосылки изобретения

Интерфероны типа I (IFN-α, IFN-β, и IFN-ω) составляют семейство близких по своей структуре цитокинов, которые обычно выделяют по их способности придавать устойчивость к вирусным инфекциям. Сообщалось о разнообразной биологической активности интерферонов типа I, включая подавление пролиферации клеток, индукцию антигенов МНС класса I и некоторых других иммунорегулирующих активностях (1). Интерферон-α и интерферон-β применимы для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе гепатита С (2, 3) и бородавок (4, 5), а также некоторых злокачественных заболеваний, таких как волосато-клеточный лейкоз (6), хронический злокачественный лейкоз (7) и саркома Kапоши (8).

Интерферон-α был обнаружен в сыворотках различных пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (9), а также больных СПИД (10). Интерферон-α принимает участие в развитии ювенильного диабета (11). Кроме того, сообщалось, что повышенная экспрессия интерферона-α в белом веществе микроглии может вносить вклад в патологию болезни Альцгеймера. Далее, было показано, что терапия с использованием интерферона-α приводит в ряде случаев к нежелательным побочным эффектам, в том числе к лихорадке и неврологическим заболеваниям (12). Следовательно, существуют патологические состояния, в которых нейтрализация активности интерферона может принести пользу пациенту.

Как и в случае других цитокинов интерферон-α проявляет свою биологическую активность путем связывания на поверхности клетки с рецептором, который является специфическим для всех подтипов интерферона-α, а также для интерферона-β (13). Рецептор интерферона-α человека (IFNAR) был идентифицирован и клонирован из клеток Дауди (14). Клонированный рецептор имеет одну трансмембранную область, внеклеточную и внутриклеточную область. При экспрессии в мышиных клетках указанный рецептор придает восприимчивость по отношению к интерферону-α человека, однако оказывает незначительное воздействие по отношению к другим видам интерферона-α и интерферона-β, указывая на то, что в реакции на воздействие интерферона-α и различных подтипов интерферона-β могут принимать участие дополнительные компоненты.

В других исследованиях показано, что дополнительные компоненты или субъединицы рецептора вовлекаются в связывание интерферона-α и интерферона-β (15-17). Более того, сообщалось, что уже описанный рецептор (14) принимает участие в связывании всех видов интерферона-α и интерферона-β (18).

Связывающие цитокины белки (растворимые рецепторы цитокинов) соответствуют областям связывания внеклеточного лиганда соответствующих рецепторов цитокина на поверхности клетки. Их получают либо альтернативным сплайсингом пре-мРНК, общей для рецептора на поверхности клетки, либо протеолитическим расщеплением рецептора на поверхности клетки. Подобные растворимые рецепторы ранее были описаны, в том числе среди прочих растворимые рецепторы IL-6 и IFN-γ (19-21), TNF (22-24), IL-1 (25-27), IL-4 (25, 28), IL-2 (29, 30), IL-7 (31) и IFN-α (32).

Сущность изобретения

В настоящем изобретении заявляются молекулы ДНК, кодирующие известные IFN-α/β-связывающие белки (IL106591). Указанные молекулы ДНК на самом деле кодируют два различных белка, IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, получаемые, вероятно, от одинаковой пре-мРНК путем альтернативного сплайсинга, который приводит к образованию двух молекул мРНК, одна из которых имеет размер приблизительно 1,5 тыс. нуклеотидов, а другая имеет размер приблизительно 4,5 тыс. нуклеотидов, при этом каждая из них кодирует один из связывающих белков - м-РНК размером 1,5 тыс. нуклеотидов кодирует IFNAB-BPI, а мРНК размером 4,5 тыс. нуклеотидов кодирует IFNAB-BPII. Термин IFNAB-BP относится как к IFNAB-BPI, так и к IFNAB-BPII. IFNAB-BP, выделенный из мочи, идентифицирован как IFNAB-BPII.

Таким образом, в настоящем изобретении заявляется молекула ДНК, кодирующая IFN-α/β-связывающие белки, выбранные из IFNAB-BPI, IFNAB-BPII, слитых белков и мутеинов IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, их функциональных производных и их активных фракций.

В изобретении также заявляются реплицируемые экспрессирующие векторы, включающие указанные молекулы ДНК, трансформированные с их помощью клетки-хозяева и белки, продуцированные указанными трансформированными клетками-хозяевами. Термин «молекулы ДНК» включает геномные ДНК, комплементарные ДНК, синтетические ДНК и их комбинации.

Изобретение относится также к молекулам ДНК, которые гибридизуются в жестких условиях с указанными выше молекулами ДНК и кодируют белки, обладающие той же биологической активностью, что и молекулы IFNAB-BP.

В настоящем изобретении заявляются также способы получения функционально активных IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, слитых белков, мутеинов или их активных фракций в клетках-хозяевах, способных их продуцировать.

В настоящем изобретении заявляются также рекомбинантные IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, слитые белки, мутеины или их активные фракции, а также соли всех указанных соединений, и фармацевтические композиции, содержащие IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, слитые белки, мутеины, их активные фракции, а также соли указанных соединений.

IFNAB-BPI и IFNAB-BPII подавляют биологическую активность природных лейкоцитов человека и интерферонов фибробластов, а также рекомбинантных интерферонов IFN-α2, IFN-αB, IFN-αC и IFN-β человека. IFNAB-BPI соответствует новому трансмембранному белку, который является лиганд-связывающим рецептором IFN-α/β. IFNAB-BPII представляет собой растворимый рецептор, который в основном соответствует внеклеточному лиганд-связывающему домену IFNAB-BPI.

Описание чертежей

На Фиг.1 показана стратегия клонирования IFNAB-BPI и IFNAB-BPII:

(А) Средний ряд: Последовательность внутреннего CNBr пептида (27 аминокислотных остатков, cb7), полученного из IFNAB-BPII с молекулярной массой 40000 Да, выделенного из мочи.

Верхний и средний ряды: синтетические смысловые (вверху) и антисмысловые (внизу)_, генетически вырожденные олигонуклеотиды, полученные на основе пептидной последовательности и используемые для обратной транскрипции (лишь антисмысловой праймер) и для полимеразной цепной реакции (PCR).

(В) Гель-электрофорез в агарозе продуктов PCR, полученных с использованием указанных выше смысловых и антисмысловых праймеров. Для генерирования кДНК, играющей роль матрицы в PCR, используют следующие молекулы РНК и праймеры: (1) Поли А+ РНК клеток Дауди, антисмысловой праймер. (2) Поли А+ РНК клеток Дауди, олиго-d(T)праймер. (3) Общая РНК клеток WISH, антисмысловой праймер. Размер (т.п.н.) ДНК-маркеров приведен в левой части.

(С) Верхний ряд: Невырожденная часть последовательности, полученной из клонов pBluescript продукта PCR c размером 101 т.п.н.

Нижний ряд: Трансляция полученной невырожденной последовательности ДНК в ожидаемую последовательность, которая представляет собой часть последовательности пептидов сb7 (остатки 9-20).

На Фиг.2 показана кДНК и транслированная полипептидная последовательность клона q10, несущего кДНК IFNAB-BPI:

Указанный клон выделяют из библиотеки лямбда gtll, полученной из кДНК клеток HeLa человека, скринингом с синтетическим олигонуклеотидом, соответствующим последовательности невырожденной ДНК, приведенной на фиг.1(С). Последовательность, соответствующая N-концу IFNAB-BPI, выделенного из мочи, и его CNBr-пептидам, подчеркнута, а под чертой приведено название соответствующей последовательности (n1, N-конец 1; n2, N-конец 2; сb3, CNBr пептид 3; cb6, CNBr пептид 6; cb7, CNBr пептид 7). Гидрофобная последовательность, соответствующая сигнальному(ым) пептиду(ам) и трансмембранной области (tm) подчеркнута дважды. Жирные цифры с правой стороны указывают на количество аминокислотных остатков. Обычные цифры соответствуют нуклеотидным остаткам, принимая инициатор А в ATG за номер 1.

На Фиг.3 показано определение мРНК методом нозерн-блоттинга с использованием специфического зонда, общего для последовательности IFNAB-BPI и IFNAB-BPII:

Зонд, содержащий 397 пар нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 218-614 IFNAB-BPI, получают полимеразной цепной реакцией, используя подходящие праймеры и стохастическую метку праймеров с помощью [³²Р]. Поли А+ РНК из клеток Дауди человека, нанесенную на нитроцеллюлозу и гибридизованную со специфическим зондом, анализируют методом электрофореза в агарозе (1,5%). Размер рибосомальной РНК указан с правой стороны.

На Фиг.4 показана последовательность нуклеотидов и аминокислот полного клона кДНК с размером 1,5 тыс. нуклеотидов, соответствующего IFNAB-BPI. Аминокислотные остатки в однобуквенных кодах нумеруются жирными цифрами, начиная с кодона инициации трансляции. Подчеркнуты области гидрофобного лидера и трансмембранные области. Последовательность N-концевых белков IFNAB-BP, выделенного из мочи (из кодона 27), и внутренние CNBr пептиды подчеркнуты пунктирной линией (однако остатки Cys и N-гликозилированные остатки Asn не обнаруживаются). Сигналы N-гликозилирования помечены звездочками, а сигналы полиаденилирования подчеркнуты дважды.

На Фиг.5 показаны частичные последовательности нуклеотидов и аминокислот клона кДНК размером 4,5 тыс. нуклеотидов, соответствующего IFNAB-BPII. Аминокислотные остатки в однобуквенных кодах нумеруются жирными цифрами, начиная с кодона инициации трансляции. Подчеркнута область гидрофобного лидера. Последовательность N-концевых белков IFNAB-BP, выделенного из мочи (из кодона 27), и внутренние CNBr пептиды подчеркнуты пунктирной линией (остатки Cys и N-гликозилированные остатки Asn не обнаруживаются). Сигналы N-гликозилирования и кодоны остановки помечены звездочками.

На Фиг.6 показана генная конструкция вектора экспрессии млекопитающих для экспрессии внеклеточной области IFNAB-BPI для связывания лиганда.

(А) Смысловые и антисмысловые синтетические олигонуклеотиды, используемые для получения ДНК, которая кодирует внеклеточную область IFNAB-BPI для связывания лиганда, путем полимеразной цепной реакции.

(B) Гель-электрофорез в агарозе продукта полимеразной цепной реакции размером приблизительно 850 пар нуклеотидов, полученного с помощью указанных выше смысловых и антисмысловых праймеров и ДНК клона qlO.

(C) Структура peF-BOS-IFNAB-BP-I, вектора экспрессирующего в клетках млекопитающих для получения растворимого IFNAB-BPI.

На Фиг.7 показана экспрессия IFNAB-BPI и IFNAR в различных клетках:

Экспрессия IFNAB-BPI в различных клетках показана в виде SDS-PAGE (7,5% акриламида, невосстанавливающие условия) экстрактов из клеток с помощью детергентов с последующим иммуноблоттингом анти-IFNAB-BPII антителом кролика и ¹²⁵I-белка А. Клон 369.11 представляет собой клетки NIH-ЗTЗ, экспрессирующие IFNAB-BPI; клон 470.6 представляет собой клетки NIH-ЗTЗ, экспрессирующие IFNAR; а клон 508.12 экспрессирует оба белка. Показаны также контрольные клетки NIH-ЗTЗ и клетки Дауди человека. Формы IFNAB-BPI с массой 51 кДа (в мышиных клетках) и 102 кДа (в клетках Дауди) указаны стрелками. Указатели молекулярной массы приведены с левой стороны.

На Фиг.8 представлены данные по связыванию ¹²⁵I-IFN-α2 с различными клетками-хозяевами:

(А) Насыщение связывания ¹²⁵I-IFN-α2 с клетками NIH-ЗTЗ, экспрессирующими IFNAB-BPI (клон 369,11, □), и клетками, экспрессирующими как IFNAB-BPI, так и IFNAR (клоны 508,12, •), и отсутствие связывания с клетками, экспрессирующими лишь IFNAR (клон 470,6, ∆). (В) Анализ Скэтчарда связывания ¹²⁵I-IFN-α2 с указанными выше клетками. Данные по связыванию были обработаны с использованием программы LIGAND. Следующие клетки показывают высокое сродство насыщения: клетки Дауди человека (∆), позитивные клетки IFNAB-BPI (клон 369,11, •) и клон 508,12, экспрессирующий как IFNAB-BPI, так и IFNAR (□).

На Фиг.9 обобщены результаты исследований системы BIAcore, которые определяют сродство IFNAB-BPII, выделенного из мочи, к IFN-α2:

IFN-α2 иммобилизовали на чувствительном элементе и пропускали через него различные концентрации IFNAB-BPII, выделенного из мочи. Кривая "Относительная величина реакции в зависимости от времени" характеризует процесс связывания и диссоциации. Кажущаяся константа диссоциации составляет 3,12 × 10^-9М.

На Фиг.10 приведены результаты ELISA анализа IFNAB-BPII, выделенного из мочи:

Чистый IFNAB-BPII, выделенный из мочи, последовательными двукратными разведениями разбавляли до указанной концентрации, помещали на микротитровальные планшеты для проведения анализа ELISA, которые предварительно покрывают моноклональными анти-IFNAB-BPII антителами. Планшеты затем подвергали взаимодействию с кроличьими анти-IFNAB-BPII антителами с последующим добавлением козьих антител против кроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, и субстрата ABTS/H₂O. Считывание планшетов проводили при длине волны 405/630 нм. Нижний порог обнаружения составляет 30 пг/мл.

Подробное описание изобретения

В соответствии с заявкой на выдачу патента Израиля 106591 белок связывания IFN-α/β, имеющий молекулярную массу 40000 Да (IFNAB-BP), выделяли хроматографически в две стадии из обычной мочи. Неочищенные белки, выделенные из мочи, помещали в колонку, содержащую IFN-α2, сшитый с агарозой. Колонку промывали для удаления не представляющих интерес белков, а затем связанные белки элюировали при низком значении рН. Элюированные белки затем разделяли с помощью ВЭЖХ с определением размеров и получали несколько пиков белков, один из которых отличается своей способностью специфично взаимодействовать c ¹²⁵I-IFN-α2 и блокировать антивирусную активность интерферона-α и интерферона-β. Эти белки далее охарактеризовывали микроанализом последовательности аминокислотных остатков N-конца, с помощью которого получена основная последовательность N-концевой области:

Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg.

Была выделена минорная полипептидная последовательность, соответствующая основной последовательности, но содержащая дополнительно три аминокислотных остатка (Ile-XXX-Tyr) со стороны N-конца приведенной выше последовательности (XXX обозначает неидентифицированную аминокислоту). При сравнении полученной последовательности было установлено, что она полностью отличается от последовательности известного IFN-αВ рецептора (14). Она отличается также от любого другого известного белка и не кодируется ни одной известной последовательностью ДНК, что показано при сравнении с данными библиотек Swissprot и Genbank при использовании программы FastA (33).

Образец IFNAB-BPII, выделенного из мочи, расщепляли с помощью CNBr, разделяли с помощью SDS-PAGE, наносили методом электроблоттинга на мембрану из поливинилдифторида и полученные при расщеплении фрагменты подвергали операции микроопределения первичной структуры. Один из фрагментов имел молекулярную массу менее 10 кДа и следующую внутреннюю последовательность (Met предшествует действительной последовательности):

Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile (27 остатков)

Эта внутренняя последовательность обратно транслируется в смысловые и антисмысловые праймеры, к которым добавлены подходящие сайты рестрикции. Полную РНК очищали от клеток человека и первую цепь кДНК генерировали с помощью обратной транскриптазы, используя в качестве праймера либо антисмысловые олигонуклеотиды, либо олиго-d(T). Полученный фрагмент кДНК затем амплифицировали полимеразной цепной реакцией, используя комбинацию смысловых и антисмысловых вырожденных праймеров. Анализ продуктов PCR на 3%-ном геле агарозы показывает специфическую олигонуклеотидную полосу. Эту ДНК подвергали расщеплению рестриктазами, клонировали на pBluescript ("Stratagene") и трансфектировали этим вектором подходящую E.coli. Определяли последовательность аминокислотных остатков нескольких независимых клонов. Последовательность участка, ограниченного смысловыми и антисмысловыми вырожденными праймерами, инвариантна и кодируется ожидаемой последовательностью указанного выше CNBr пептида (сb7) из IFNAB-BP, выделенного из мочи. Синтезировали олигонуклеотид, соответствующий невырожденной внутренней последовательности, делали метку на конце и использовали для скрининга библиотек кДНК.

Скрининг лямбда gtll библиотеки кДНК клеток HeLa человека ("Clontech") дал несколько положительных клонов. Один из этих клонов, обозначенный как ql0, имеет открытую рамку считывания генетической информации, которая соответствует сигнальному пептиду, внеклеточной области, трансмембранной области и короткой цитоплазматической области. Пептидные последовательности, полученные из IFNAB-BP, выделенного из мочи, все находятся внутри внеклеточной области, обозначенной как ql0. Небольшое количество аминокислотных остатков пептидной последовательности было неправильным вследствие ограничений технологии определения первичной структуры (в основном вследствие невозможности идентифицировать Сys и низкие уровни пиков, соответствующие Ser).

Смысловые и антисмысловые праймеры, соответствующие концам нуклеотидной последовательности 219-613 клона ql0 (Фиг.2), использовали для получения с помощью PCR специфического зонда, используя клон ql0 в качестве ДНК-матрицы. Полученную ДНК метили [³²Р] и использовали для гибридизации по методу нозерн-блоттинга поли А+ мРНК из двух клеточных линий человека. В обоих случаях наблюдаются две специфические полосы, одна соответствует мРНК с длиной 1,5 тыс. нуклеотидов, а другая соответствует мРНК с длиной 4,5 тыс. нуклеотидов. Первичный продукт трансляции мРНК с длиной 1,5 тыс. нуклеотидов, обозначают как предшественник IFNAB-BPI. Первичный продукт трансляции мРНК с длиной 4,5 тыс. нуклеотидов, обозначают как предшественник IFNAB-BPII.

Указанный выше специфический зонд использовали для скрининга дополнительной библиотеки кДНК человека и идентифицировали две группы клонов кДНК. Одна группа (около 20 индивидуальных клонов) имеет длину 1,5 тыс. нуклеотидов и кодирует тот же самый предшественник трансмембранного белка, который кодирует клон ql0. Вторая группа (2 индивидуальных клона) имеет длину 4,5 тыс. нуклеотидов. Эти размеры совпадают с размерами двух образцов мРНК, а потому мРНК с размером 1,5 тыс. нуклеотидов кодирует IFNAB-BPI, a мРНК с размером 4,5 тыс. нуклеотидов кодирует IFNAB-BPII. Определение последовательности аминокислотных остатков клонов с размером 4,5 тыс. нуклеотидов показало, что они кодируют предшественник усеченного растворимого рецептора, соответствующего кодонам 1-239 клона ql0. Однако кодоны 238 и 239 были отличны, и за ними следовал кодон остановки. Анализ последовательности аминокислотных остатков белка, проведенный для С-конца 40000 IFNAB-BP, выделенного из мочи, показывает, что он кодируется кДНК с размером 4,5 тыс. нуклеотидов, что определяется последними двумя аминокислотными остатками, и таким образом IFNAB-BP, выделенный из мочи, определен как IFNAB-BPII. Термин "предшественник" в контексте настоящего изобретения используется для обозначения первичного продукта трансляции, который включает сигнальный пептид.

ДНК, кодирующая предшественник усеченной растворимой формы IFNAB-BPI, синтезировали с помощью PCR. Полученный продукт PCR вводили в вектор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, и использовали для трансфекции различных клеток млекопитающих, таких как COS-клетки обезьяны. Указанные клетки экспрессируют высокие уровни биологически активного рекомбинантного растворимого IFNAB-BPI.

Аналогично с помощью PCR синтезировали ДНК, кодирующую предшественника IFNAB-BPII. Полученный продукт PCR вводили в вектор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, и использовали для трансфекции различных клеток млекопитающих, таких как клетки COS обезьяны. Указанные клетки экспрессируют высокие уровни биологически активного рекомбинантного IFNAB-BPII.

Аналогично с помощью PCR синтезировали ДНК, кодирующую предшественник IFNAB-BPI. Полученный продукт PCR вводили в вектор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, и использовали для трансфекции различных клеток млекопитающих, таких как клетки NIH-ЗTЗ мыши. Указанные клетки экспрессируют высокие уровни IFNAB-BPI человека. Клетки способны связывать интерферон IFN-α2 человека с высоким сродством (Kd=3,6×l0^-9 M). Если совместно экспрессировали IFNAB-BPI человека и ранее клонированный рецептор IFNAR интерферона IFN-αB человека (14) в клетках NIH-ЗTЗ мыши, то сродство комплексного рецептора возрастает приблизительно в 10 раз (Kd=4×10^-10 М). Наоборот, если в клетках мыши экспрессируются лишь IFNAR человека, то сродство к IFN-α2 человека не проявляется. Таким образом, составной белок, содержащий два присоединенных полипептида, один из которых содержит область связывания лиганда IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, а второй полипептид содержит внеклеточную область IFNAR, будет проявлять большее сродство к IFN-α по сравнению с одним IFNAB-BPI или одним IFNAB-BPII.

Сродство IFNAB-BPII, выделенного из мочи, к IFN-α человека определяли в системе BIAcore ("Pharmacia", Швеция). IFN-α2 иммобилизовали на чувствительный элемент и давали связывать IFNAB-BPII. На основе значений Kon и Koff получали значение Kd, равное 3,12^-9 М. Это значение очень близко к величине, полученной с клетками NIH-ЗTЗ, экспрессирующими IFNAB-BPI.

Рассмотренные выше операции клонирования, выделения клона, идентификации, характеристики и определения первичной структуры более подробно рассмотрены далее в Примерах.

IFNAB-BPI и IFNAB-BPII могут быть получены из других типов рекомбинантных клеток, таких как клетки прокариотов, в частности E.coli, или клетки эукариотов, такие как СНО, дрожжевые клетки или клетки насекомых. Методы конструирования подходящих векторов, несущих ДНК, которая кодирует полный IFNAB-BPI или IFNAB-BPII и пригодна для трансформирования (в частности, E.coli и дрожжевых клеток) или инфицирования клеток насекомых, с целью получения рекомбинантного IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, хорошо известны из области техники. См., например, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Current Protocols, 1993; и Sambrook et al., eds. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ad., Cold Spring Harbor Press, 1989.

Изобретение также касается активных мутеинов и активных фракций IFNAB-BPI и IFNAB-BPII и слитых белков, включающих дикие IFNAB-BPI и IFNAB-BPII или их активные мутеины, или их активные фракции, слитые с другим полипептидом или белком и проявляющие похожую способность блокировать биологическую активность IFN-α и IFN-β, или других цитокинов, которые участвуют во взаимодействии с рецептором интерферона альфа/бета.

ДНК, кодирующая IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, их активные фракции, мутеины или слитые белки, или оперативно присоединенные сигналы транскрипции или трансляции, вводят в векторы эукариотов, которые способны встраиваться в нужную последовательность гена в хромосоме клетки-хозяина. Чтобы можно было выделить клетки, которые устойчиво интегрировали введенную ДНК в свои хромосомы, используют один или два маркера, которые позволяют провести отбор клеток-хозяев, содержащих вектор экспрессии. Маркер может вносить прототрофию в ауксотрофные клетки, биоцидную резистентность, например, по отношению к антибиотикам, или толерантность к тяжелым металлам, таким как медь и т.п. Селективный ген-маркер может быть либо непосредственно присоединен к ДНК последовательностям гена, которые нужно экспрессировать, либо введен в ту же клетку путем совместной трансфекции. Для оптимального синтеза одноцепочечного белка связывания мРНК могут потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигналы сплайсинга, а также промоторы транскрипции, усилители и сигналы терминации (34).

С целью экспрессии белков IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, их активных фракций или производных, молекула ДНК, которую необходимо ввести в выбранные клетки, преимущественно встраивается в плазмиду или вирусный вектор, способный автономно реплицироваться в клетке-хозяине.

Важными факторами при выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора являются: простота распознавания клеток-хозяев, содержащих вектор, и их селекции из клеток, не содержащих вектор; количество копий вектора, которые должны быть воспроизведены в данном хозяине; и в случае необходимости возможность осуществления "челночного" перемещения вектора между клетками-хозяевами и другими объектами. Предпочтительными прокариотическими векторами являются плазмиды, такие как плазмиды, способные к репликации в E.coli, например pBR322, ColEl, pSCl0l, pACYC 184 и т.д. (35); плазмиды Bacillus, такие как рС194, рС221, рТ127 и т.д. (36); плазмиды Streptomyces, в том числе pIJl0l (37); бактериофаги Streptomyces, такие как ФС31 (38) и плазмиды Pseudomonas (39,40).

Предпочтительными эукариотическими плазмидами являются BPV, вирус осповакцины, SV40, 2-микронная плазмида и т.д. или их активные производные. Указанные плазмиды хорошо известны из области техники (41-45).

Как только вектор или последовательность ДНК, содержащие генно-инженерные конструкции, подготовлены для экспрессии, экспрессирующий вектор может быть введен в соответствующую клетку-хозяина различными подходящими способами, такими как трансформация, трансфекция, липофекция, конъюгация, слияние клеток, электропорация, осаждение фосфатом кальция, прямая микроинъекция и т.п.

Клетки-хозяева, которые следует использовать по настоящему изобретению, могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими. Предпочтительными прокариотическими клетками-хозяевами являются бактерии, такие как E.coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serrata и т.п. Наиболее предпочтительными прокариотическими клетками-хозяевами являются клетки E.coli. Бактериями-хозяевами, представляющими особый интерес, являются E.coli K12 штамм 294 (АТСС 31446), E.coli X1776 (АТСС 31537), E.coli W3110 (F^-, λ^-, прототрофные (АТСС 27325)) и другие кишечные бактерии, такие как Salmonella typhimurium или Serrata narcescens, а также различные виды Pseudomonas. В этих условиях белки не гликозилируются. Прокариотическая клетка-хозяин должна быть совместима с репликоном и контролирующей последовательностью в экспрессирующей плазмиде.

Однако поскольку IFNAB-BPI и IFNAB-BPII являются гликозилированными белками, эукариотические хозяева имеют предпочтение перед прокариотическими хозяевами. Предпочтительными эукариотическими хозяевами являются клетки млекопитающих, в частности клетки человека, обезьяны, мыши и клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО), поскольку они вносят посттрансляционные модификации в молекулы белков, включая правильную укладку цепи, правильное образование дисульфидных связей, а также гликозилирование в нужных местах. Модификацию пептидов после трансляции, в том числе высокую степень гликозилирования маннозой, могут осуществлять также дрожжевые клетки и клетки насекомых. Существует ряд стратегий проведения рекомбинации ДНК, в которых используются последовательности высокопродуктивных промоторов и плазмид, позволяющих получить большое количество копий, которые могут быть применены для воспроизводства нужных белков в дрожжевых клетках и клетках насекомых. Дрожжевые клетки узнают последовательность лидера в продуктах подвергнутого клонированию гена млекопитающих и выделяют пептиды, содержащие лидерную последовательность. После введения вектора клетки-хозяева выращивают в селективной среде, которая селективно способствует росту клеток, содержащих вектор. Экспрессия клонированных последовательностей гена приводит к продуцированию IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, слитых белков, или мутеинов, или их активных фракций. Экспрессированные белки затем выделяют и очищают в соответствии с любой известной методикой, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез и т.п. или с помощью аффинной хроматографии с использованием анти-IFNAB-BPI моноклокальных антител, иммобилизованных на гелевом носителе, помещенном в колонку. Неочищенные препараты, содержащие указанные рекомбинантные IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, их активные фракции или производные, пропускают через колонку, в которой IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, их активные фракции или производные связываются в колонке со специфическим антителом, в то время как примеси проходят сквозь колонку. После промывки белок элюируют с геля в условиях, которые обычно используются для этой цели, т.е. при высоком или низком значении рН, в частности рН 11 или рН 2.

В контексте настоящего изобретения термин "мутеины" обозначает аналоги IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, или их активных фракций замещены другими аминокислотами или удалены, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, не изменяя существенно активность полученных продуктов по сравнению с IFNAB-BPI или IFNAB-BPII дикого типа или их активными фракциями. Указанные мутеины получают известными синтетическими способами и/или сайт-направленным мутагенезом или другими подходящими способами.

Любой подобный мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, практически дублирующую последовательность IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, так что они имеют существенно идентичную активность таковой IFNAB-BPI и IFNAB-BPII или их активных фракций. Один тип активности IFNAB-BPI и IFNAB-BPII заключается в ее способности связываться с одним или большим количеством интерферонов типа I, таких как нативные интерфероны лейкоцитов и фибробластов человека, а также с рекомбинантными интерферонами человека IFN-α, IFN-αB, IFN-αC и IFN-β. Поскольку мутеин обладает способностью к связыванию с одним или большим количеством указанных интерферонов, его можно использовать для очистки этих интерферонов, например, с помощью аффинной хроматографии, а потому можно считать, что они обладают практически аналогичной активностью по отношению к IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. Таким образом, можно установить, обладает ли данный мутеин практически той же активностью, что IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, проведя обычные исследования, которые заключаются в тестировании указанного мутеина с помощью, например, простого конкурентного анализа с целью определить, связывается ли он с интерфероном, содержащим подходящую метку, в частности с помощью радиоиммуноанализа или твердофазного ИФА. Указанный анализ следует повторить с несколькими образцами интерферона типа I, поскольку мутеин, который связывается с любым образцом интерферона типа I и сохраняет значительную активность IFNAB-BPI или IFNAB-BPII, обладает по крайней мере одним из указанных эффектов IFNАВ-ВРI или IFNAB-BPII и, таким образом, обладает по отношению к ним аналогичной активностью.

В настоящем описании любой подобный мутеин обладает по крайней мере 40%-ной идентичностью или гомологичностью по отношению к последовательности IFNAB-BPI либо IFNAB-BPII. Более предпочтительно он обладает 50%-ной, по крайней мере 60%-ной, по крайней мере 70%-ной, по крайней мере 80%-ной, а наиболее предпочтительно 90%-ной идентичностью или гомологичностью по отношению к указанным последовательностям.

Мутеины полипептидов или белков IFNAB-BPI или IFNAB-BPII или их активных фракций, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают ограниченный набор практически соответствующих последовательностей взаимозаменяемых пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть легко получены любым специалистом без проведения большого количества экспериментов, если взять за основу методики и рекомендации, представленные в настоящем описании. Для подробного описания химии и структур белков см. G.E. Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; и Т.Е.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1983, которые приводятся здесь в качестве ссылки. Для примеров замен нуклеотидных последовательностей, таких как предпочтительные кодоны, см. Ausubel et al., см. выше, в параграфах А.1.1-А.1.24, и Sambrook et al, см. выше, в Приложениях С и D.

Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением являются так называемые "консервативные" замены. Консервативные замены аминокислот в полипептидах или белках или активных фракциях IFNAB-BPI и IFNAB-BPII могут включать синонимичные аминокислоты внутри группы, которые в значительной степени обладают похожими физико-химическими свойствами, так что замены между членами группы приведут к сохранению биологической функции молекулы (Grantham, Science, 1974, Vol.185, pp.862-864). Очевидно, что в указанных выше последовательностях могут быть осуществлены инсерции или делеции аминокислот, которые не изменяют функции последовательностей, особенно в том случае, если инсерции или делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, в частности в пределах тридцати, преимущественно менее десяти, и не приводят к перемещению аминокислот, которые являются принципиально важными для функциональной конформации, в частности остатков цистеина (Anfinsen, "Principles that Govern the Folding of Protein Chains", Science, 1973, Vol.181, pp.223-230). Белки или мутеины, получаемые в результате указанных делеций и/или инсерций, входят в объем притязаний по настоящему изобретению.

Предпочтительные группы синонимичных аминокислот приведены в Таблице I. Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот приведены в Таблице II; и наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот приведены в Таблице III.

Таблица IПредпочтительные группы синонимичных аминокислот
Аминокислота	Синонимичные группы
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp
Таблица IIБолее предпочтительные группы синонимичных аминокислот
Аминокислота	Синонимичные группы
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Me
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp