Способ получения, способ очистки и способ стабилизации полипептидов фактора vii, ix и x

Способ получения, способ очистки и способ стабилизации полипептидов фактора vii, ix и x

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам производства, очистки и получения белков-протеаз.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Доказано, что многие белки, вовлеченные в коагуляционный каскад, в том числе, например, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, и фактор XIII, являются эффективными терапевтическими средствами для лечения различных патологических состояний. В целом, компоненты крови, принимающие участие в коагуляционном “каскаде”, являются проферментами или зимогенами, ферментативно неактивными белками, которые преобразуются в протеолитические ферменты под воздействием активатора, который сам является активирующимся фактором свертывания крови. Факторы коагуляции, которые подвергались такому преобразованию, в целом относятся к «активированным факторам» и обозначаются добавлением строчной буквы «а» (например, активированный фактор VII (FVIIa)).

Из-за множества неудобств, возникающих при использовании человеческой плазмы в качестве источника фармацевтических препаратов, предпочтительно получать такие белки в рекомбинантных системах. Однако белки коагуляции подвергаются различным котрансляционным и постранляционным модификациям, включая, например, аспарагин-связанное (N-связанное) гликозилирование, О-связанное гликозилирование, и γ-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты. По этой причине предпочтительно получать их в клетках млекопитающих, которые способны изменить рекомбинантные белки соответствующим образом.

При получении белков коагуляции из культур микроорганизмов или клеточных линий заключительным шагом получения является извлечение и, необязательно, концентрирование интересующего продукта. Культуральная среда, в которой росли клетки и которая содержит секретированные белки, и, в частности, клеточные лизаты, содержащие интересующие внутриклеточные белки, также содержит, в большей или меньшей степени, другие белки, продуцирующиеся клетками, а также другие примеси, такие как компоненты среды, нуклеиновые кислоты и тому подобное. Для получения очищенного белкового продукта необходимо отделить интересующий белок от других белков и полипептидов и других примесей сырого материала, содержащего интересующий белок.

Патент США 5700914 относится к способу очистки FVII, где, по крайней мере, присутствует цинк на одной из стадий очистки.

Обычно, на стадиях культивирования, очистки и в общепринятых способах получения лекарственных средств, активированные белки коагуляции имеют тенденцию деградировать из-за протеолитической функции белков. Таким образом, в данной области существует необходимость в улучшении способов культивирования, очистки и получения лекарственных средств, содержащих активированные белки коагуляции с целью снижения деградации при получении белков коагуляции, особенно рекомбинантных полипептидов фактора VII человека или пептидов, связанных с фактором VII.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в широком аспекте к очистке протеаз. Процесс, описанный здесь, может использоваться для очистки любой протеазы, в том числе факторов коагуляции FXII/FXIIa, FXI/FXIa, FX/FXa, FIX/FIXa, FVII/FVIIa, тромбина, и антикоагулянтов С-белкового происхождения. Предпочтительно процесс может использоваться для очистки рекомбинантных протеаз, полученных из клеточной культуры. Предпочтительно процесс может использоваться для очистки сериновых протеаз, содержащих остатки GLA (гамма-карбоксиглутаминовой кислоты), витамин К-зависимых факторов коагуляции VIIa, IXa, Xa, активированного белка С и тромбина.

Более предпочтительными сериновыми протеазами, содержащими домен с остатками GLA (гамма-карбоксиглутамат), являются полипептид фактора IX, а именно FIXa. Еще более предпочтительными сериновыми протеазами, содержащими домен с остатками GLA (гамма-карбоксиглутамат), являются полипептид фактора VII, а именно FVIIa.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения очищенной сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, где способ включает:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, включающей сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток; и

(iii) очистку сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, от культуральной среды;

где концентрация свободных ионов кальция в стадии (iii) выше 1,2 мM или ниже 0,10 мM; и/или

где концентрация свободных ионов другого двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мM; и/или

где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения очищенного полипептида фактора VII, где способ включает:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид фактора VII, в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии полипептида фактора VII;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей полипептид фактора VII; и

(iii) очистку полипептида фактора VII от культуральной среды;

где концентрации свободных ионов кальция в стадии (iii) выше 1,2 мM или ниже 0,10 мM; и/или

где концентрация свободных ионов другого двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения очищенной сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, включающему:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток; и

(iii) очистку сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток от культуральной среды;

где молярное отношение ионов кальция и сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток (Ca²⁺:сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток) в стадии (iii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения очищенного полипептида фактора VII, где способ включают:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид фактора VII, в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии полипептида фактора VII;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей полипептид фактора VII; и

(iii) очистку полипептида фактора VII из культуральной среды;

где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) в стадии (iii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, где способ включает:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток; и

(ii) очистку сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, из расвора;

где молярное отношение ионов кальция и сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток (Ca²⁺:сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток) в стадии (ii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки полипептида фактора VII, где способ включает:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего полипептид фактора VII; и

(ii) очистку полипептида фактора VII из раствора;

где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) в стадии (ii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, включающему:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток; и

(ii) очистку сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток из расвора;

где концентрация свободных ионов кальция в стадии (ii) выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки полипептида фактора VII, включающему:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего полипептид фактора VII; и

(ii) очистку полипептида фактора VII из раствора;

концентрация свободных ионов кальция в стадии (ii) выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение касается процесса очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, в результате чего раствор сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, подвергается ряду стадий очистки, где концентрация свободных ионов кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки 0,025 мМ; и/или

где pH, по крайней мере, на одной из стадий очистки, ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу очистки полипептида фактора VII, в результате чего раствор полипептида фактора VII подвергается ряду стадий очистки, где концентрация свободных ионов кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 0,025 мМ; и/или

где pH, по крайней мере, на одной из стадий очистки, ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, в результате чего раствор сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, подвергается ряду стадий очистки, где молярное отношение ионов кальция и сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток (Ca²⁺:сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток), по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 0,025 мМ; и/или

где pH, по крайней мере, на одной из стадий очистки, ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу очистки полипептида фактора VII, в результате чего раствор полипептида фактора VII подвергается ряду стадий очистки, где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII), по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 0,025 мМ; и/или

где pH, по крайней мере, на одной из стадий очистки, ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу стабилизации сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, в растворе, содержащем сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, таким образом, указанный раствор, содержащий сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, подвергается стадиям добавления кальция с получением концентрации свободных ионов кальция выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

добавления двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, с получением концентрации свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, выше 0,025 мМ; и/или

доведение pH раствора, содержащего сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, до pH ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу стабилизации полипептида фактора VII в растворе, содержащем полипептид фактора VII, таким образом указанный раствор, содержащий полипептид фактора VII, подвергается стадиям добавления кальция с получением концентрации свободных ионов кальция выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

добавления двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, с достижением концентрации свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, выше 0,025 мМ; и/или

доведения pH раствора, содержащего полипептид фактора VII, до значения pH ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей (i) сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, (ii) свободные ионы кальция в концентрации выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

свободный катион двухвалентного металла, отличный от иона цинка и иона кальция, в концентрации выше 0,025 мМ; и/или

где pH композиции имеет значение ниже 7,5, или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей (i) полипептид фактора VII, (ii) свободные ионы кальция в концентрации выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

свободный катион двухвалентного металла, отличный от иона цинка и иона кальция, в концентрации выше 0,025 мМ; и/или

где pH композиции имеет значение ниже 7,5 или выше 8,6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для уменьшения деградации гиперактивных аналогов FVII(a), например, вариантов полипептида FVII с протеолитической активностью выше активности неизмененного FVII человека, активность и лабильность снижаются обработкой a) в присутствии >25 микромоль катиона двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, например Cu²⁺, во время очистки, и/или b) в присутствии >1,2 мМ Ca²⁺ во время очистки, и/или c) в присутствии <0,1 мМ Ca²⁺ во время очистки, и/или d) при pH ниже 7,5 во время очистки, и/или e) при значении pH во время очистки выше 8,6.

Деградация гиперактивных аналогов FVIIa повышена при нейтральном значении pH (pH=7,5) и является причиной значительного сокращения выхода продукта в процессе очистки. Известными решениями этого является введение в процессе очистки либо высокотоксичных ингибиторов протеазы, либо дорогостоящих «адаптированных» ингибиторов, или пептидов/белков-поглотителей.

Стабилизация культурального супернатанта, иммуноаффинный захват и очистка путем анионного обмена, осуществляемая при рН 6 авторами настоящего изобретения, показали огромное преимущество перед известными методами очистки FVII.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения очищенного пептида фактора VII, где способ включает:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид фактора VII, в культуральной среде в условиях, пригодных для экспрессии полипептида фактора VII;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей полипептид фактора VII; и

(iii) очистку полипептида фактора VII из культуральной среды;

где концентрация свободных ионов кальция в стадии (iii) выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки полипептида фактора VII, где способ включает:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид фактора VII, в культуральной среде в условиях, пригодных для экспрессии полипептида фактора VII;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей полипептид фактора VII; и

(iii) очистку полипептида фактора VII из культуральной среды;

где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) в стадии (iii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка или иона кальция, в стадии (iii) выше 0,025 мМ;

и/или где pH в стадии (iii) ниже 7,5 или выше 8,6.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки полипептида фактора VII, где способ включает:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего полипептид фактора VII; и

(ii) очистку полипептида фактора VII из раствора, где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:плипептид FVII) в стадии (ii) выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки полипептида фактора VII, где способ включает:

(i) восстановление всего или части раствора, содержащего полипептид фактора VII; и

(ii) очистку полипептида фактора VII из раствора;

где концентрация свободных ионов кальция в стадии (ii) выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, в стадии (ii) выше 0,025 мМ; и/или

где pH в стадии (ii) ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу очистки полипептида фактора VII, в котором раствор полипептида фактора VII подвергается ряду стадий очистки, где концентрация свободных ионов кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

где концентрация двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 0,025 мМ; и/или

где pH по крайней мере, на одной из стадий очистки ниже 7,5, или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу очистки полипептида фактора VII, в котором раствор полипептида фактора VII подвергается ряду стадий очистки, где молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII), по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 20 или ниже 0,50; и/или

где концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки, выше 0,025 мМ; и/или

где pH, по крайней мере, на одной из стадий очистки, ниже 7,5 или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу стабилизации полипептида фактора VII в растворе, содержащем полипептид фактора VII, при котором вышеуказанный раствор, содержащий полипептид фактора VII, подвергается стадиям добавления кальция для достижения концентрации свободных ионов кальция выше 1,2 мМ или ниже 0,10 мМ; и/или

добавления двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, для достижения концентрации свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, выше 0,025 мМ; и/или

доведения pH раствора, содержащего полипептид фактора VII, до pH ниже 7,5, или выше 8,6.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения очищенной сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток. Вышеуказанный способ включает:

(i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей вышеуказанную сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, в культуральной среде в условиях, пригодных для экспрессии вышеуказанной сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток;

(ii) восстановление всей или части культуральной среды, содержащей вышеуказанную сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток; и

(iii) очистку вышеуказанной сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, из культуральной среды,

где рН в стадии (iii) имеет значение между 4,5 и 6 между 8,6 и 10.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, при котором раствор сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, подвергается ряду стадий очистки, где рН, по крайней мере, на одной из стадий очистки, имеет значение между 4,5 и 6,9, или имеет значение между 8,6 и 10.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу стабилизации сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, в растворе, включающем сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, при котором названный раствор, включающий сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, подвергается ряду этапов добавления кальция для достижения концентрации свободных ионов кальция выше 1,2 мМ, или ниже 0,10 мМ; и/или

добавления двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, для достижения концентрации свободных ионов двухвалентного металла, отличных от иона цинка и иона кальция, выше 0,025 мМ; и/или

доведения pH раствора, содержащего сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, до значения между 4,5 и 6,9 или до значения между 8,6 и 10.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, в растворе со значением рН между 4,5 и 6,9, или между 8,6 и 10.

Термин «сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток», употребляемый здесь, обозначает белок, выбранный из группы, включающей полипептиды фактора VII, полипептиды фактора IX, фактора Х и их варианты и производные, белок С и вариант и производные, и протромбин/тромбин и их вариант и производные, где белок содержит один или более аминокислотный остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA). В одном из вариантов осуществления сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток, является активной формой белка, как, например, фактор VIIa, фактор IXa, фактор Xa, активированный белок C, и тромбин. В одном из вариантов осуществления, сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток, является человеческой.

Под «стабилизацией» сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, как, например, полипептид фактора VII, или полипептид фактора IX, в композиции, включающей сериновую протеазу, подразумевается снижение степени деградации (то есть количество продукта деградации в единицу времени) сериновой протеазы в композиции, например протеолитической или химической деградации. Предпочтительно деградация, измеренная в анализе скорости образования GD-FVIIa, описанном здесь, составляет менее 60% от максимума образования GD-FVIIa, как, например, 50% от максимума образования GD-FVIIa, например 40% от максимума образования GD-FVIIa, например 30% от максимума образования GD-FVIIa, например 20% от максимума образования GD-FVIIa, например 10% от максимума образования GD-FVIIa.

Понятно, что под «стабилизацией» сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток, в композиции подразумевается повышение стабильности на любой стадии процесса получения рекомбинантного белка, где стадия выбрана из группы, включающей сбор клеток, фиксацию, хранение, обработку, переработку, очистку, предварительного получения основной массы; получения основной массы, ультра-/диафильтрации, ионный обмен, фиксацию анионным обменом, гель-хроматрографию, гидрофобную хроматографию, осаждение и аффинную очистку.

Термин «очищенная сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток», как используется здесь, подразумевает сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, которая была отделена, по крайней мере, от приблизительно 50% по массе полинуклеотидов, липидов, углеводов и любых других примесей полипептидов или других примесей, которые могут быть обнаружены в культуральной среде после экспрессии в эукариотических клетках-хозяина, которые могут оказывать негативное влияние на его терапевтическое, диагностическое, профилактическое или научно-исследовательское применения. Сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток, может быть очищена от культуральной среды и быть по существу свободной от естественных примесей, с помощью любого из многочисленных способов. На некоторых стадиях очистки, также может быть использована технология стандартного хроматографического разделения для очистки сериновой протеазы, содержащей GLA-остаток.

Термин «очищенный полипептид фактора VII», как используется здесь, подразумевает полипептид фактора VII, который был отделен, по крайней мере, от 50% по массе полинуклеотидов, липидов, углеводов и любых других примесных полипептидов или других примесей, которые могут быть обнаружены в культуральной среде после экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, которые могут оказывать негативное влияние на его терапевтическое, диагностическое, профилактическое или научно-исследовательское применение. Полипептид фактора VII может быть очищен от культуральной среды и быть по существу свободным от естественных примесей любым из многочисленных способов. На некоторых стадиях очистки также может быть использована технология стандартного хроматографического разделения для очистки полипептида фактора VII.

Под «очисткой» полипептида от композиции, содержащей полипептид и один или несколько примесей, подразумевается повышение степени чистоты полипептида в композиции путем удаления (полного или частичного), по крайней мере, одного загрязнителя из композиции. «Стадия очистки» может быть частью всего процесса очистки, приводящей к «гомогенной» композиции, которая может использоваться здесь в отношении композиции, включающей по массе, по крайней мере, около 70% массы интересующего полипептида, исходя из общей массы композиции предпочтительно, по крайней мере, около 80% по массе.

Под термином «концентрация свободных ионов кальция», как используется здесь, понимают концентрацию двухвалентных положительных ионов кальция (Ca²⁺), окруженных молекулами воды. Термин не включает кальций в твердой форме, то есть кристаллическую структуру или кальций, связанный в белках, как, например FVII.

Термин «концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция», как используется здесь, подразумевает концентрацию двухвалентного положительного иона, окруженного молекулами воды, который не является ионом кальция или ионом цинка. Термин не относится к двухвалентному положительному иону в твердой форме, то есть кристаллической структуре или ионам, связанным в белках.

В одном из вариантов осуществления изобретения, стадии очистки являются стадиями хроматографической очистки.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является гидрофобной хроматографией.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является гель-хроматографией.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является анионообменной хроматографией.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является ультрафильтрацией.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является иммуноаффинной очисткой.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одна стадия очистки является диафильтрацией.

В одном из вариантов осуществления изобретения, концентрация свободных ионов кальция на стадии (iii) выше 1,2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация свободных ионов кальция на стадии (iii) выше 1,3 мМ, например, выше 1,4 мМ, например, выше 1,5 мМ, например, выше 1,6 мМ, например, выше 1,7 мМ, например, выше 1,8 мМ, например, выше 1,9 мМ, например, выше 2,0 мМ, например, выше 2,1 мМ, например, выше 2,2 мМ, например, выше 2,3 мМ, например, выше 2,4 мМ, например, выше 2,5 мМ, например, выше 2,6 мМ, например, выше 3,0 мМ, например, выше 4,0 мМ, например, выше 5,0 мМ, например, выше 6,0 мМ, например, выше 7,0 мМ, например, выше 8,0 мМ, например, выше 9,0 мМ, например, выше 10,0 мМ, например, выше 20 мМ, например, выше 40,0 мМ, например, выше 60,0 мМ, например, выше 80,0 мМ, например, выше 0,1 M, например, выше 1 M, как например, концентрация свободных ионов кальция, при которой происходит насыщение раствора.

Термин «концентрация свободных ионов кальция, при которой происходит насыщение раствора», как используется здесь, подразумевает концентрацию свободных ионов кальция, при которой растворенные свободные ионы кальция находятся в равновесии с нерастворенным ионом кальция в твердой форме.

В одном из вариантов осуществления изобретения, концентрация свободных ионов кальция на стадии (iii) ниже 0,10 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения, концентрация свободных ионов кальция на стадии (iii) ниже 0,09, например, ниже 0,08, например, ниже 0,07, например, ниже 0,06, например, ниже 0,05, например, ниже 0,04, например, ниже 0,03, например, ниже 0,02, например, ниже 0,01, например, ниже 0,00.

В одном из вариантов осуществления изобретения, концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, на стадии (iii) выше 0,025 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения двухвалентный металл выбран из списка, включающего Mg ²⁺, Cu ²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Fe²⁺, Sm²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Sm²⁺, и Uo²⁺. В одном из вариантов осуществления изобретения двухвалентный металл выбран из списка, включающего Mg²⁺, Cu²⁺, и Mn²⁺. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация свободных ионов двухвалентного металла, отличного от иона цинка и иона кальция, на стадии (iii) выше 0,025 мМ, например, выше 0,03 мМ, например, выше 0,035 мМ, например, выше 0,04 мМ, например, выше 0,045 мМ, например, выше 0,05 мМ, например, выше 0,055 мМ, например, выше 0,06 мМ, например, выше 0,1 мМ, например, выше 0,15 мМ, например, выше 0,2 мМ, например, выше 0,25 мМ, например, выше 0,3, мМ, например, выше 0,5 мМ, например, выше 1,0 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения, сериновая протеаза, содержащая GLA-остаток, очищают на стадии (iii) в присутствии дополнительного хелатора иона двухвалентного металла.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII очищают на стадии (iii) в присутствии дополнительного хелатора иона двухвалентного металла.

Термин «хелатор иона двухвалентного металла», как используется здесь, подразумевает любое вещество или соединение, которое удаляет или связывает ионы двухвалентного металла, как, например, ионы кальция или ионы цинка. Хелатором иона двухвалентного металла может быть поликарбоновая кислота, цитрат, батокупроин, батофенантролин, DTPA, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), EGTA, пеницилламин, TETA (триэтилентетрамин), TPEN и их производные.

В одном из вариантов осуществления изобретения сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, очищают на стадии (iii) при pH ниже 7,5. В одном из вариантов осуществления изобретения pH ниже 7,4, например, ниже 7,3, например, ниже 7,2, например, ниже 7,1, например, ниже 7,0, например, ниже 6,8, например, ниже 6,6, например, ниже 6,4, например, ниже 6,2, например, ниже 6,0, например, 5,5.

В одном из вариантов осуществления изобретения, сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, очищают на стадии (iii) при pH выше 8,6. В одном из вариантов осуществления изобретения pH выше 8,7, например, выше 8,8, например, выше 8,9, например, выше 9,0, например, выше 9,1, например, выше 9,2, например, выше 9,4, например, выше 9,6, например, выше 9,8, например, выше 10,0, например, выше 10,2, например, выше 10,4, например, выше 10,8, например, 11,0.

В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептид фактора VII очищают на стадии (iii) при pH ниже 7,5. В одном из вариантов осуществления изобретения pH ниже 7,4, например, ниже 7,3, например, ниже 7,2, например, ниже 7,1, например, ниже 7,0, например, ниже 6,8, например, ниже 6,6, например, ниже 6,4, например, ниже 6,2, например, ниже 6,0, например, 5,5.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII очищают на стадии (iii) при pH выше 8,6. В одном из вариантов осуществления изобретения pH выше 8,7, например, выше 8,8, например, выше 8,9, например, выше 9,0, например, выше 9,1, например, выше 9,2, например, выше 9,4, например, выше 9,6, например, выше 9,8, например, выше 10,0, например, выше 10,2, например, выше 10,4, например, выше 10,8, например, 11,0.

В одном из вариантов осуществления изобретения сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, очищают при значении pH между 4,5 и 6,9. В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII очищают при pH между 4,5 и 6,9. В одном из вариантов осуществления изобретения pH имеет значение между 4,7 и 6,8, например между 4,9 и 6,7, например, между 5,1 и 6,6, например, между 5,3 и 6,5, например, между 5,5 и 6,4, например, между 5,7 и 6,3, например, между 5,8 и 6,2, например, между 5,9 и 6,1, например, около 6,0.

В одном из вариантов осуществления изобретения сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, очищают при значении pH между 8,6 и 10. В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII очищают при значении pH между 8,6 и 10. В одном из вариантов осуществления изобретения pH имеет значение между 8,7 и 9,9, например, между 8,8 и 9,8, например, между 8,9 и 9,7, например, между 9,0 и 9,6, например между 9,1 и 9,5, например между 8,7 и 9,8, например, между 8,7 и 9,7, например, между 8,7 и 9,6, например, между 8,8 и 9,5, например, между 8,9 и 9,4, например, между 9,0 и 9,2, например, около 9,2.

В одном из вариантов осуществления изобретения сериновую протеазу, содержащую GLA-остаток, очищают в присутствии гистидина. Понятно, что гистидин может служить буферным агентом и поддерживать рН в диапазоне 5-7 или 8-10.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII очищают в присутствии гистидина. Понятно, что гистидин может служить буферным агентом и поддерживать рН в диапазоне 5-7 или 8-10.

В одном из вариантов осуществления изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка-хозяин.

В одном из вариантов осуществления изобретения эукариотической клеткой-хозяином является клетка млекопитающего. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка млекопитающего выбрана из группы, включающей клетки HEK, клетки BHK, клетки CHO, клетки COS, и клетки миеломы, например SP2-0.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептидом фактора VII является неизмененным фактором VII человека.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид фактора VII имеет протеолитическую активность выше неизмененный FVIIa человека.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептидом фактора VII является фактор VII-связанным полипептидом, выбранным из группы, включающей:

L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII,

R152E-Фактор VII, S344A-Фактор VII, фактор VIIa, лишенный Gla домена; и P11Q/K33E- FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; и FVII, имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности с 233Thr по 240Asn, FVII, имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности с 304Arg по 329Cys.

В одном из вариантов осуществления изобретения молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) на стадии (iii) выше 20. В одном из вариантов осуществления изобретения молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) на стадии (iii) выше 20, например, выше 22, например, выше 24, например, выше 26, например, выше 28, например, выше 30, например, выше 34, например, выше 38, например, выше 42, например, выше 45, например, выше 50, например, выше 55, например, выше 60, например, выше 65, например, выше 70, например, выше 76, например, выше 82, например, выше 90, например, выше 95, например, выше 100.

В одном из вариантов осуществления изобретения молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) на стадии (iii) ниже 0,50. В одном из вариантов осуществления изобретения молярное отношение ионов кальция и полипептида фактора VII (Ca²⁺:полипептид FVII) на стадии (iii) ниже 0,50, например, ниже 0,45, например, ниже 0,40, например, ниже 0,35, например, ниже 0,30, например, ниже 0,25, например, ниже 0,20, например, ниже 0,15, например, ниже 0,10, например, ниже 0,05, например, 0,00.

В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация свободных ионов кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки выше 1,2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация свободных ионов кальция, по крайней мере, на одной из стадий очистки выше 1,3 мМ, на