Устройство для тест-определения аналита

Устройство для тест-определения аналита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при мониторинге загрязнений окружающей среды, контроле качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, анализе биологических объектов.

В современной практике для определения различных веществ широко применяются неинструментальные иммунохимические тест-методы. Наибольшую популярность получили иммунохроматографические (Collin R., Schneider E., Briggs L., Towers N. // Food and Agricultural Immunology. 1998. V.10. P.91-104; Delmulle B., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 2005. V.53. P.3364-3368; Usleber E., Schneider E., Märtlbauer E., Terplan G. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 1993. V.41. P.2019-2023) и иммунофильтрационные тесты (Schneider E., Usleber E., Märtlbauer E. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 1995. V.43. P.2548-2552; De Saeger S., Sibanda L., Desmet A., Van Peteghem C. // International Journal of Food Microbiology. 2002. V.75. P.135-142). Оба типа тестов основаны на использовании мембран, содержащих тестовую зону, окраска которой зависит от концентрации определяемого вещества в образце.

Однако указанные тест-системы сильно подвержены матричному эффекту анализируемого образца, для устранения которого используют разбавление растворов, что зачастую приводит к недостаточной чувствительности метода. Кроме того, высокое содержание окрашенных веществ в матрице анализируемого образца может мешать визуальному детектированию.

Для повышения чувствительности тест-систем предложен подход, заключающийся в использовании вместо мембран тестового слоя, который представляет собой аффинный гель (Goryacheva I.Yu., Beloglazova N.V., Eremin S.A., Mikhirev D.A., Niessner R., Knopp D. // Talanta 2008. Vol.75. N2. P.517-522). Однако этот способ применим только для неокрашенных простых объектов анализа (водные среды).

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются устройство и метод для определения присутствия аналита (L.Sibanda, S.De Saeger, C.Van Peteghem, Device and method for detecting the presence of an analyte, International Patent Application No. PCT/EP02/01496 (2001)). Устройство позволяет детектировать присутствие аналита в жидких и полужидких средах и представляет собой прозрачный контейнер с отверстиями для ввода и вывода пробы, содержащий, по крайней мере, два отдельных слоя. Анализируемый образец пропускают последовательно через первый и второй слои. Первый слой состоит из сорбента, способного удерживать хотя бы часть мешающих веществ из образца, а второй слой содержит сорбент с молекулами-рецепторами, способными селективно связывать аналит. В качестве такого сорбента может быть использован иммуноаффинный гель с привитыми специфическими антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами.

Указанный формат тест-системы был использован для определения охратоксина А в специях (Goryacheva I.Y., De Saeger S., Lobeau M., Eremin S.A., Barna-Vetrу I., Van Peteghem C. 2006. Approach for ochratoxin A fast screening in spices using clean-up tandem immunoassay columns with confirmation by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) // Analytica Chimica Acta 577:38-45). Водно-ацетонитрильный экстракт специй пропускают через колонку, затем вводят конъюгат с ферментной меткой. Для удаления излишков конъюгата используется стадия промывки. Затем в колонку добавляют субстрат, катализирующий развитие окраски. При загрязнении образца охратоксином А выше допустимого уровня тестовый слой окрашивается в голубой цвет, в случае отсутствия охратоксина А в образце окраска не развивается - тестовый слой остается белым.

Недостатком данного устройства является вымывание мешающих веществ из очищающего слоя при внесении реагентов для проведения иммуноанализа и промывке, что приводит к загрязнению детектирующего слоя и искажению результатов анализа. В частности, данный подход оказался неприемлемым для определения охратоксина А в черном и белом перце.

Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для тест-определения аналита в объектах окружающей среды, пищевых продуктах, лекарственных препаратах, промышленных и биологических объектах.

Технический результат заключается в снижении матричного эффекта пробы без существенного усложнения процедуры пробоподготовки, концентрирования и определения аналитов.

Поставленная задача достигается тем, что устройство для тест-определения аналита, содержащее, во-первых, прозрачный резервуар с отверстиями для ввода и вывода пробы, внутри которого размещен, по крайней мере, один тестовый слой, во-вторых, очищающий слой, согласно решению оно содержит дополнительный резервуар с входным и выходным отверстиями с возможностью обеспечения разъемного соединения с прозрачным резервуаром, при этом очищающий слой расположен в дополнительном резервуаре.

В качестве пробы могут выступать жидкие и полужидкие среды, а также твердые образцы, переведенные в раствор, например, посредством экстракции или растворения.

Тестовый слой выполнен в виде сорбента со специфическими рецепторами, способного удерживать аналит.

В качестве специфических рецепторов выбраны антитела, специфические к аналиту.

В качестве сорбента использована сефароза или ее производные.

Устройство выполнено с возможностью введения ферментной или люминесцентной или флуоресцентной или хемилюминесцентной или коллоидной меток.

В качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена.

Прозрачный резервуар с тестовым слоем содержит дополнительный контрольный слой с антителами, специфическими к метке.

В качестве тестового слоя использованы полимеры с молекулярными отпечатками.

В качестве тестового слоя использовано вещество, полученное по золь-гель технологии.

Слои зафиксированы с помощью пористых фильтров.

В прозрачном резервуаре расположено несколько тестовых слоев для определения различных аналитов.

Резервуар имеет форму трубки.

Устройство дополнительно содержит шприц для подачи растворов под давлением.

Устройство укомплектовано тест-набором, состоящим из одного или более реактивов: растворитель для экстракции или растворения твердых образцов, буферные растворы для разбавления пробы, промывочные буферы, конъюгат аналита с меткой и хромогенный субстрат.

Изобретение поясняется чертежами, на фиг.1 схематически изображено устройство, на фиг.2 - схема проведения иммуноферментного определения веществ, где:

1 - резервуары;

2 - очищающий слой;

3 - соединительный элемент (переходник);

4 - тестовый слой;

5 - пористые фильтры (фриты);

6 - проба;

7 - промывочный буфер I;

8 - конъюгат;

9 - промывочный буфер II;

10 - субстрат.

Устройство для тест-определения аналита содержит резервуар в виде колонки 1, внутри которой размещен очищающий слой 2, по необходимости зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 5, соединенную через переходник 3 с колонкой 1, внутри которой размещен тестовый слой 4, содержащий связывающее аналит вещество, по необходимости зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 5.

Устройство предназначено для определения аналитов в жидких и полужидких пробах, а также твердых образцах, в том числе интенсивно окрашенных, переведенных в раствор, например, путем экстракции. В качестве аналитов выступают токсиканты различной природы (микотоксины, например, охратоксин А, токсин Т-2, зеараленон, один из афлатоксинов или их группа; полициклические ароматические углеводороды), биологически активные вещества, лекарственные вещества, взрывчатые вещества.

Устройство работает следующим образом.

Твердый образец переводят в раствор посредством экстракции водно-органическими смесями. Полученный экстракт, либо жидкую или полужидкую пробу 6, по необходимости разбавленную буферным раствором с добавками, пропускают через колонку 1 сверху вниз, затем промывают раствором в промывочном буфере I 7, вводят конъюгат 8, который представляет собой аналит или его аналог, ковалентно связанный с ферментом, играющим роль метки. Для удаления излишков конъюгата 8 используется стадия промывки с помощью промывочного буфера II 9. Затем в колонку 1 добавляют субстрат 10, развитие окраски которого катализирует фермент, и наблюдают развитие окраски. В случае появления окраски на тестовом слое 4, представляющем собой иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к аналиту, образец считают не содержащим аналит выше допустимого уровня, в случае отсутствия окраски образец считают содержащим аналит выше допустимого уровня.

Возможность реализации и эффективность предлагаемого подхода подтверждает представленный ниже пример иммуноферментного определения охратоксина А в красном вине.

Для определения охратоксина А использовали две колонки емкостью 1 мл, в одну из которых помещали очищающий слой (200 мг сорбента, представляющего собой силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами), а во вторую - тестовый слой, представляющий собой гель на основе бромциансефарозы с привитыми (ковалентно связанными) специфическими к охратоксину А антителами.

Для проведения определения аликвоту (1 мл) анализируемого вина смешивали с 1 мл раствора, содержащего полиэтиленгликоль 6000 и гидрокарбонат натрия. 2 мл получившегося раствора пропускали через колонки с очищающим и тестовым слоями с помощью шприца. Затем колонку с очищающим слоем отсоединяли и продолжали работу только с колонкой, содержащей детектирующий слой. Через нее пропускали промывочный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий казеин), затем пропускали конъюгат охратоксина А с пероксидазой хрена. Конъюгат оставляли в колонке на 1 минуту, затем удаляли промыванием колонки 10 мл фосфатно-солевого буфера с добавкой Твин 20. Последним шагом определения являлось добавление в колонку субстрата на основе тетраметилбензидина, после чего в течение нескольких минут наблюдалось развитие синей окраски детектирующего слоя (при отсутствии охратоксина А в пробе). В присутствии определяемого вещества выше предела обнаружения (2 мкг/л) тестовый слой остается белым. Развитие окраски фиксируется визуально.

1. Устройство для тест-определения аналита, содержащее, во-первых, прозрачный резервуар с отверстиями для ввода и вывода пробы, внутри которого размещен, по крайней мере, один тестовый слой, во-вторых, очищающий слой, отличающееся тем, что оно содержит дополнительный резервуар с входным и выходным отверстиями с возможностью обеспечения разъемного соединения с прозрачным резервуаром, при этом очищающий слой расположен в дополнительном резервуаре.

2. Устройство по п.1, в котором в качестве пробы могут выступать жидкие или полужидкие среды, а также твердые образцы, переведенные в раствор, например, посредством экстракции или растворения.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что тестовый слой выполнен в виде сорбента со специфическими рецепторами, способного удерживать аналит.

4. Устройство по п.3, отличающееся тем, что в качестве специфических рецепторов выбраны антитела, специфические к аналиту.

5. Устройство по п.3 или 4, отличающееся тем, что в качестве сорбента использована сефароза или ее производные.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью введения ферментной, или люминисцентной, или флуоресцентной, или хемилюминисцентной, или коллоидной меток.

7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что в качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена.

8. Устройство по п.6, отличающееся тем, что прозрачный резервуар с тестовым слоем содержит дополнительный контрольный слой с антителами, специфическими к метке.

9. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в качестве тестового слоя использованы полимеры с молекулярными отпечатками.

10. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в качестве тестового слоя использовано вещество, полученное по золь-гель технологии.

11. Устройство по п.1, отличающееся тем, что слои зафиксированы с помощью пористых фильтров.

12. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в прозрачном резервуаре расположено несколько тестовых слоев для определения различных аналитов.

13. Устройство по п.1, отличающееся тем, что резервуар имеет форму трубки.

14. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит шприц для подачи растворов под давлением.

15. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно укомплектовано тест-набором, состоящим из одного или более реактивов: растворитель для экстракции и растворения твердых образцов, буферные растворы для разбавления пробы, промывочные буферы, коньюгат аналита с меткой и хромогенный субстрат.