Способ получения средства, обладающего гепатозащитной активностью

Способ получения средства, обладающего гепатозащитной активностью

Реферат

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего гепатозащитной активностью.

Поиск и разработка новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний печени, обусловлены широким распространением, особой тяжестью течения и наличием ряда вариантов в патогенезе данного заболевания. В настоящее время доказана эффективность применения лекарственных препаратов из растительного сырья для лечения некоторых форм гепатита, при этом фитопрепараты не оказывают побочного действия и безвредны при длительном применении.

Известен способ получения сиропа из плодов шиповника "Холосас", применяемого как гепатозащитное средство [6]. Недостатком данного способа является менее выраженная гепатопротекторная активность получаемого средства по сравнению со средством, получаемым по заявляемому способу.

Целью изобретения является повышение гепатопротекторной активности средства за счет более высокого содержания действующих веществ (сумма флавоноидов).

Для достижения указанной цели растительный материал (сырье) - надземную часть горечавника бородатого (30%); надземную часть зубчатки поздней (30%), плоды яблони ягодной (30%), корни софоры желтоватой (10%), экстрагируют 50-60% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:(14-16) (с учетом коэффициента водопоглощения), при температуре 55-65°С и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-м и 2-м контактах фаз - 60 мин, при 3-м контакте фаз - 30 мин. Извлечения фильтруют через серошинельное сукно, объединяют, упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 30.9±0.5% от массы растительного сырья.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом, с содержанием влаги - не более 5%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

300 г надземной части горечавника бородатого, 300 г надземной части зубчатки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83), 300 г плодов яблони ягодной, 100 г корней софоры желтоватой измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 14 л 50% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:14, с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 50% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения (1-й слив - 10.85 л, 2-й слив - 11.05 л, 3-й слив - 9.87 л). Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 308.3 г готового продукта, что составляет 30.83% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.05%.

Гепатопротекторную активность полученного продукта определяли при экспериментальном остром гепатите, вызванном тетрациклином [1, 2]. Опыты проводили на 48 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 170-180 г, которых содержали в условиях естественного светового режима и на стандартном диете при свободном доступе к воде и пище. Крысы получали подкожные инъекции 4 мл/кг тетрахлорметана (CCl₄) в 50% масляном растворе в течение 4 дней. С 3-го дня интоксикации на протяжении 10 дней им вводили в желудок водный раствор экстракта гепатопротекторного в экспериментально-терапевтической дозе; в качестве препарата сравнения использовали гепатопротектор "холосас" в изоэффективной дозе 100 мг/кг в аналогичном режиме. Контрольная группа животных получала воду очищенную в соответствующем объеме. Крыс декапитировали под легким эфирным наркозом. В сыворотке крови измеряли активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание билирубина, липидов, белка, мочевины, креатина [7], определяли показатели тимоловой пробы и малонового диальдегида в сыворотке крови и желчи [2]. Наряду с этим определяли активность каталазы крови [5].

Из полученных данных, представленных в таблице 1, следует что содержание МДА в гомогенате печени у животных, получавших только гепатотоксин, повышалось по сравнению с данными у животных интактной группы в 2.1 раза, в желчи - на 99%, а активность каталазы сыворотки крови снижалась на 41%. При назначении животным с токсическим гепатитом гепатопротекторного фитоэкстракта "тиг-да" содержание МДА в гомогенате печени снижалось на 31%, в желчи - на 41%, а каталазная активность крови возрастала на 39% по сравнению с данными у животных контрольной группы и не уступал, а некоторых случаях превосходила фармакотерапевтичекое действие препарата сравнения.

Таблица 1
Влияние гепатопротекторного фитоэкстракта "тиг-да" на содержание продуктов ПОЛ и состояние антиокислительной защиты организма при повреждении печени белых крыс тетрахлорметаном (7 сутки)
Группы животных	МДА, в гомогенате печени, нмоль/г	МДФ в желчи, ед. ОП	Каталаза, мкат/л
Интактная	0.36±0.02	1.00±0.01	1.42±0.11
Контрольная (тетрахлорметан)	0.76±0.05	1.99±0.19	1.03±0.25
"Тиг-да"	0.50±0.04*	1.18±0.11*	2.98±0.25*
Холосас	0.55±0.02	1.55±0.09	3.00±0.20
Примечание: * - разница достоверна по сравнению с контролем при Р<0.05

Пример 2.

300 г надземной части горечавника бородатого, 300 г надземной части зубчатки обыкновенной, измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83), 300 г плодов яблони ягодной, 100 г корней софоры желтоватой измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 15 л 50% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:15, с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 50% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения (1-й слив - 10.95 л, 2-й слив - 11.35 л, 3-й слив - 9.95 л). Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 315.3 г готового продукта, что составляет 31.53% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.12%.

Во второй серии экспериментов исследовали биохимические показатели сыворотки крови при повреждении печени крыс четырехлористым углеродом.

Опыты проводили на 48 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 170-180 г, которых содержали в условиях естественного светового режима и на стандартной диете при свободном доступе к воде и пище. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1.

Таблица 2
Группы животных	АЛТ, мкмоль/млч	ACT, мкмоль/мл ч	ЩФ, ед. Бод.	Общий билирубин, ммоль/л
Интактная	1.81±0.18	1.29±0.03	13.57±1.29	5.04±0.45
Контрольная (тетрахлорметан)	2.63±0.24	1.74±0.09	17.02±1.15	13.50±0.14
"Тиг-да"	1.81±0.18*	1.25±0.06*	15.75±1.58	10.44±0.11*
Холосас	2.34±0.13	1.80±0.05	17.0±1.50	12.55±0.12

Повреждение печени крыс четырехлористым углеродом сопровождалось развитием синдрома цитолиза (табл.2). Как следует из таблицы, под влиянием тетрахлорметана отмечалось повышение активности трансаминаз в сыворотке крови, а также возрастала активность щелочной фосфатазы, что свидетельствовало о развитии синдромов цитолиза и холестаза.

"Тиг-да" препятствовал развитию характерных для CCl₃-гепатита метаболических нарушений. В результате терапии активность АЛТ снижалась на 32%, ACT - на 29%. Наряду с этим испытуемое средство предотвращало развитие проявлений холестатического синдрома. Так, "тиг-да" снижал у крыс с токсическим гепатитом содержание билирубина в крови на 23% по сравнению с показателями в контроле и не уступал, а некоторых случаях превосходил фармакотерапевтическое действие препарата сравнения.

Пример 3

300 г надземной части горечавника бородатого, 300 г надземной части зубчатки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83), 300 г плодов яблони ягодной, 100 г корней софоры желтоватой измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 16 л 50% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:16, с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 50% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения (1-й слив - 11.85 л, 2-й слив - 11.65 л, 3-й слив - 10.00 л). Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 306.1 г готового продукта, что составляет 30.6% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.05%.

Гепатопротекторную активность полученного продукта определяли при экспериментальном остром гепатите, вызванном тетрациклином [1, 2]. Опыты проводили на 48 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 170-180 г, которых содержали в условиях естественного светового режима и на стандартной диете при свободном доступе к воде и пище. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1. Данные эксперимента приведены таблице 3.

Гепатопротекторный экстракт благоприятно влиял на выведение конечных продуктов печеночной детоксикации, обладал гипоазотемическим действием. Так на 14 сутки развития экспериментального гепатита "тиг-да" снижал уровень остаточного азота на 30%, креатинина - на 28%, мочевины - на 51% по сравнению с данными в контроле. Одновременно в моче повышалось содержание продуктов белково-азотистого обмена: креатинина - на 17%, мочевины - на 49% по сравнению с данными контрольной группы. При этом "тиг-да" оказывал влияние на большинство биохимических показателей и был эффективнее или не уступал по своей эффективности препарату сравнения.

Таблица 3.
Влияние гепатопротекторного сбора "тиг-да" на основные биохимические показатели сыворотки крови белых крыс при повреждении печени четыреххлористым углеродом (14 сутки опыта).
Показатели	группы животных
	Интактная	Контрольная (CCl4)	"тиг-да"	Холосас
АЛТ, мкмоль/мл ч	0.68±0.11	4.04±0.18	2.85±0.18*	3.02±0.20
ACT, мкмоль/мл ч	0.41±0.05	2.40±0.13	1.73±0.11*	1.89±0.10
Общий белок, г/л	7.45±0.11	6.33±0.08	6.80±0.17	6.00±0.50
Тимоловая проба, ед. помутн.	1.36±0.19	6.76±1.07	3.50±0.25*	3.46±0.12
Бета-липопротеиды, усл. ед.	90.0±2.5	182.0±13.5	119.0±4.5*	154.4±10.2
Холестерин, ммоль/л	6.2±0.2	9.1±0.7	7.0±0.1*	8.8.±0.5
ЩФ, ед. Бод.	14.4±1.0	27.0±1.6	16.2±1.0*	17.9±1.4
Билирубин общий, ммоль/л	0.53±0.03	4.98±0.16	2.08+0.11*	2.77±0.10
Билирубин прямой ммоль/л	0.22±0.02	2.48±0.10	2.04±0.01	2.00±0.02
Билирубин непрямой ммоль/л	0.31±0.04	2.50±0.07	2.04±0.01	2.00±0.01
Остаточный азот в крови, ммоль/л	57.00±3.44	98.78±3.55	70.00±2.10*	68.22±1.55
Креатинин в сыворотке крови, мкмоль/л	74.20±2.75	138.90±13.01	100.41±5.60*	113.76+11.22
Креатинин в моче, мкмоль/л	912.11±76.60	781.02±32.16	914.16±15.50*	800.00±40.56
Мочевина в сыворотке крови, моль/л	6.06±0.56	12.01±1.33	9.17±0.13*	10.12±1.00
Мочевина в моче, ммоль/л	321.60±8.51	201.05±10.88	300.00±23.40*	311.12±23.45

На основании качественного фитохимического анализа в полученном сухом экстракте установлено наличие:

Дубильных веществ

0.05 г экстракта растворяют в 5 мл воды дистиллированной. К 2 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора железо-аммониевых квасцов, появляется черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества).

3. Фенолкарбоновых кислот

Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:

А. н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2)

Б. 15% уксусная кислота

При просмотре хроматограммы в УФ-свете, после обработки парами аммиака, идентифицированы со стандартными образцами:

кофейная кислота - R_f=0.80 (A), 0.42 (Б);

хлорогеновая кислота - R_f=0.67 (A), 0.70 (Б).

4. Иридоидов.

Одномерной восходящей хроматографией на пластинке "Силуфол УФ-254", в системе растворителей: этилацетат-изопропанол-вода (65:12:5,5). При просматривании хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм идентифицирован со стандартным образцом триандрин, R_f=0.5.

1. Флавоноидов

1.1. 0.1 г экстракта растворяют в 50 мл 50% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желто-зеленое окрашивание (флавоноиды).

1.2. Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:

А. 15% раствор уксусной кислоты

Б. н-Бутанол-уксусная кислота-вода (40:12:28)

При просмотре хроматограммы в УФ-свете до и после проявления 5% спиртовым раствором алюминия хлорида обнаружены:

кверцетин - R_f=0.22 (А), 0.73 (Б);

гиперозид - R_f=0.36 (A), 0.61 (Б);

лютеолин - 7 гликозид - R_f=0.20 (A), 0.41 (Б);

идентификацию проводили со стандартными образцами.

2. Количественное определение

Около 0.05 г (точная навеска) экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл теплой воды (40-60°С), прибавляют 5.2 мл 96% спирта, доводят объем раствора до метки водой (раствор А). 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% спирте, доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл раствора А, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) лютеолина. 1 мл приготовленного раствора ГСО лютеолина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Раствором сравнения является раствор, состоящий из 1 мл ГСО лютеолина, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин и абсолютно сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле:

,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора ГСО лютеолина;

m - масса экстракта в граммах;

m₀ - масса ГСО лютеолина в граммах;

W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.

Примечание. Приготовление раствора ГСО лютеолина: около 0.05 г (точная навеска) ГСО лютеолина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 4.72±0.18%.

Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получать продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты.

Для выявления оптимальных технологических режимов нами были изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций.

Таблица 4
Метрологические характеристики определения экстрактивных веществ и суммы флавоноидов
	f		S	P	t
Содержание экстрактивных веществ	9	27.9	0.9447	95	2.26	0.6752	2.42
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин	9	1.31	0.0783	95	2.26	0.0559	4.27

Количественная оценка проводилась по выходу экстрактивных веществ [3, 4] и суммы флавоноидов. Метрологические характеристики представлены в таблице 4.

В качестве экстрагентов были использованы вода и этиловый спирт различных концентраций (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96%).

Как видно из таблицы 5, 50-55% спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет добиться максимального выхода суммы флавоноидов с учетом выхода экстрактивных веществ.

Таблица 5
Выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-стандарт в зависимости от типа и концентрации экстрагента
Экстрагент	Выход экстрактивных веществ, %	Выход суммы флавоноидов, %
Вода	17.23	0.74
Спирт этиловый: 20%	18.71	0.75
	30%	19.33	0.77
	40%	20.92	0.80
	50%	21.46	0.85
	60%	23.48	0.97
	70%	22.63	0.91
	80%	19.30	0.87
	90%	17.02	0.85
	96%	16.29	0.83

Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили отдельно для каждого вида сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ. На основании полученных данных (таблица 6) и с учетом того, что слишком мелкое измельчение растительного материала ведет к загрязнению извлечения труднофильтруемыми высокомолекулярными соединениями, измельчение каждого вида сырья следует проводить отдельно до размера частиц: для плодов яблони ягодной и корней софоры желтоватой - не более 3 мм, для надземных частей горечавника бородатого и зубчатки поздней - не более 5 мм.

Таблица 6
Выход экстрактивных веществ в зависимости от размера частиц сырья
Диаметр частиц, мм	плоды яблони ягодной	Выход экстрактивных веществ, %
корневища и корни софоры желтоватой	надземная часть горечавника бородатого	надземная часть зубчатки поздней
0.5	21.22	32.84	28.13	17.45
1.0	20.93	32.37	27.71	18.22
3.0	19.54	30.22	27.48	17.19
5.0	14.17	25.26	26.32	16.38
7.0	13.48	23.44	22.78	13.87
10.0	13.21	21.13	20.22	11.92

В связи с тем, что в исходном растительном сырье содержатся термолабильные вещества (витамины, иридоиды), изучение влияния температуры на процесс экстракции проводили в интервале температур от 20 до 60°С. Данные представлены в таблице 7, оптимальная температура - 60±5°С.

Таблица 7
Выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в зависимости от температуры экстракции
Температура экстракции, °С	Выход экстрактивных веществ, %	Выход суммы флавоноидов, %
20	16.52	0.87
30	18.04	0.96
40	21.63	1.03
50	25.41	1.14
60	28.27	1.18

При изучении влияния соотношения сырье-экстрагент на процесс экстракции установлено (таблица 8), что с увеличением количества экстрагента возрастает выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов, но рост этот для соотношений 1:16 и выше незначителен, поэтому для предотвращения дополнительного расхода экстрагента выбрано соотношение, равное 1:(14-16) (с учетом коэффициента водопоглощения).

Таблица 8
Выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в зависимости от соотношения сырье: экстрагент
Соотношение сырье:экстрагент	Выход экстрактивных веществ, %	Выход суммы флавоноидов, %
1:8	не смачивается
1:10	24.23	1.12
1:12	27.86	1.19
1:14	29.11	1.21
1:16	30.15	1.21
1:18	30.72	1.22
1:20	31.91	1.23
1:25	32.42	1.25

Для определения продолжительности и необходимого количества экстракций установлено время достижения равновесных концентраций экстрактивных веществ и флавоноидов в системе сырье-экстрагент в ходе трехкратной экстракции. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 40% этиловым спиртом в соотношении 1:14 на водяной бане при температуре 60°С и постоянном перемешивании в колбе с обратным холодильником. Извлечения, полученные через определенные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90 мин) в процессе трех экстракций, анализировали на содержание экстрактивных веществ и флавоноидов. Установлено, что равновесные концентрации устанавливаются при 1-м и 2-м контактах фаз через 60 мин, при 3-м контакте фаз через 30 мин (таблица 9). Трехкратная экстракция обеспечивает достаточно полное истощение сырья - извлекается до 96% действующих веществ.

Таблица 9
Выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в зависимости от времени экстрагирования
Время, мин	Выход экстрактивных веществ, %	Выход суммы флавоноидов, %
	контакт фаз
I	II	III	I	II	III
15	16.43	5.27	3.03	0.47	0.19	0.11
30	19.32	7.80	3.65	0.62	0.27	0.12
45	21.08	7.56	3.58	0.56	0.25	0.12
60	25.82	9.74	3.76	0.82	0.32	0.11
75	26.05	9.67	3.52	0.83	0.31	0.12
90	25.78	9.75	3.64	082	0.31	0.12

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой гепатозащитной активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (флавоноидов).

Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Источники информации

1. Венгеровский А.И., Головина Е.Л., Буркова В.Н., Саратиков А.С. Энтеросорбенты усиливают гепатозащитное действие эплира при экспериментальном токсическом гепатите // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т.64. - №1. - С.46-48.

2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М., 1972. - 388 с.1.

3. Государственная Фармакопея СССР. Вып.1. Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

4. Государственная Фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.

5. Королюк М.А., Иванова Л.И, Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - №1. - С.16-19.

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х томах. T.1. - 11-е изд. Стер. - М.: Медицина, 1988. - 624 с прототип стр.545

7. Меньшиков В.В., Делекторнская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / Под. Ред. В.В.Меньшикова - М., 1987. - 368 с.

Способ получения средства, обладающего гепатозащитной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют сбор лекарственных растений, состоящий из надземной части горечавника бородатого 30%; надземной части зубчатки поздней 30%; плодов яблони ягодной 30%; корней софоры желтоватой 10%, который экстрагируют 50-60%-ным этиловым спиртом в соотношении растительный материал-экстрагент, равном 1:(14-16), два раза по 60 мин, а третий раз - 30 мин при температуре 55-65°С.