Композиции, содержащие фетальный гемоглобин и бактериальный эндотоксин и, необязательно, дополнительные компоненты печени плода

Композиции, содержащие фетальный гемоглобин и бактериальный эндотоксин и, необязательно, дополнительные компоненты печени плода

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящем описании упоминается ряд документов предшествующего уровня техники. Содержание этих документов, включая руководства производителей, приведено в настоящее описание в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к композиции, предпочтительно к фармацевтической композиции, содержащей эндотоксин, предпочтительно бактериальный эндотоксин, фетальный гемоглобин и, необязательно, дополнительные компоненты, такие как дополнительные компоненты печени плода, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что бактериальный эндотоксин и фетальный гемоглобин обладают ярко выраженной синергической медикобиологической активностью. Композиция по настоящему изобретению находит широкое применение, включая стимуляцию иммунной системы, предупреждение и/или лечение рака, инфекций, таких как вирусные инфекции и/или аллергии, а также восстановление возрастного иммунного дисбаланса.

В борьбе человека против таких заболеваний, как рак или тяжелые формы инфекций, а также против процессов старения пересадка эмбриональных органов, тканей или клеток все большее распространение находила в течение многих десятилетий в качестве профилактической или терапевтической меры. История “клеточной терапии” богата рассказами, описывающими восстановление здоровья, и сообщениями о эффектах омоложения [Lambert G. 1959; Schmid F., 1963]. Клинические эффекты, зачастую поразительные, в течение многих лет оценивались лишь по субъективным критериям, и факторы, ответственные за биоактивность ткани плода, до сих пор остаются невыявленными. Было высказано предположение, что клиническая активность компонентов, происходящих от тканей плода, обусловлена иммуногенными свойствами онкофетальных антигенов, перекрестно реагирующих с некоторыми мембранными структурами [H.Rohrer, 1987], что указывает на ксеногенность инъецируемого материала (овечьего материала по отношению к человеку) [Coggin J.H. et al., 1971; Renner H. 1977]. Таким образом, очевидно, что экстракты ткани плода обладают благоприятным лекарственным действием, и временами, их рекомендовали, в частности, для лечения или профилактики рака и некоторых инфекций. Лекарственный активный компонент в этих экстрактах тканей плода до сих пор не выявлен, несмотря на значительный интерес к этой области. Проблемы, связанные с выявлением таких композиций, очевидны. Уже больше века, предпринимаются попытки лечения рака путем инъекции жизнеспособных бактерий и/или бактерий, убитых нагреванием [Coley W. 1983]. Примерно 50 лет назад было показано, что эффект некроза опухоли при таком лечении обусловлен действием бактериального эндотоксина. Тот факт, что эндотоксин (липополисахарид, ЛПС) является наиболее активным противоопухолевым агентом, послужил весомым аргументом для возобновления экспериментальных исследований в этом направлении. Однако нежелательные побочные эффекты, обусловленные действием эндотоксина, ограничивают возможности более широкого и более общего применения этой терапии. Хорошо известно, что для борьбы с этими заболеваниями и для успешного подавления признаков старения было разработано множество других подходов. И тем не менее, рак, подобно инфекционным, а также аллергическим заболеваниям, и/или явлениям старения, остается серьезной проблемой современного общества, поскольку многие из этих подходов либо оказались неэффективными, либо они не дали обнадеживающих результатов. Таким образом, технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, является необходимость найти способы, которые могли бы гарантировать успех в борьбе против указанных заболеваний или против признаков старения. Решение указанной технической задачи достигается в вариантах осуществления изобретения, описанных в пунктах формулы изобретения.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к композиции, предпочтительно к фармацевтической композиции, содержащей эндотоксин, предпочтительно бактериальный эндотоксин, более предпочтительно энтеробактериальный эндотоксин или его эндотоксически активную часть, и фетальный гемоглобин, такой как гемоглобин, не содержащий гема, или одну его цепь(и) или сочетание(я) его цепей, и необязательно дополнительное соединение(я), такое как (глико)пептиды печени плода, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или наполнитель.

В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции (или “лекарственному препарату”), состоящей из эндотоксина или его эндотоксически активной части, фетального гемоглобина, или его единичной цепи(ей), или сочетания(ий) его цепей, и, необязательно, дополнительного(ых) соединения(й), и необязательно, наполнителя; или к фармацевтической композиции, содержащей эндотоксин или его эндотоксически активную часть, фетальный гемоглобин, или его единичную соединение(я), или комбинацию(и) его цепей, необязательно, дополнительного(ых) соединения(й), и фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или наполнитель.

Используемый в настоящем описании термин “фармацевтическая композиция” (который является синонимом используемого здесь термина “лекарственный препарат”) обычно используется в широком смысле, известном специалистам. В данной области этот термин предпочтительно означает любое вещество или сочетание веществ (как указано выше), необязательно, в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или наполнителями, предназначенными для лечения или профилактики заболеваний человека или животных. Другими словами, этот термин обозначает любое вещество или сочетание веществ (описанных выше), которые могут быть введены человеку или животному в соответствии с установленным клиническим диагнозом, или они могут быть введены в целях восстановления, коррекции или изменение физиологических функций организма человека или животного. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, но необязательно, указанная фармацевтическая композиция находится в продаже или допущена на фармацевтический рынок. Другими словами, в рамки настоящего изобретения также входят композиции, разрешенные для продажи Организацией торгового сотрудничества (ОТС) и предназначенные либо для восстановления, коррекции или изменения физиологических функций организма человека или животного, либо для профилактики, лечения или модуляции любых заболеваний, таких как заболевания, указанные в настоящей заявке, либо для улучшения общего состояния индивидуума или устранения признаков/причин старения (также смотри ниже).

Термин “эндотоксин” (липополисахарид, ЛПС) обозначает биологически активные соединения, продуцируемые, в основном, грам-отрицательными бактериями и составляющие основной компонент внешней бактериальной мембраны, из которой они могут быть выделены биологическим или химическим методом. Структура эндотоксинов подчиняется общей схеме, представленной на фигуре 1, например, для Salmonella enterica. Эндотоксины представляют собой амфифильные молекулы, состоящие из липидного компонента, называемого липидом А, и ковалентно связанного полисахарида. По своим генетическим, биосинтетическим, биологическим и структурным свойствам углеводная часть может быть, кроме того, разделена на проксимальную коровую область липида А и О-специфическую боковую цепь. Понятно, что в соответствии с настоящим изобретением эндотоксин, используемый в композиции по настоящему изобретению, может быть эндоксином любой грам-отрицательной бактерии. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный эндотоксин предпочтительно происходит от Esсherichia coli. В общих чертах, О-специфические цепи представляют собой гетерополимеры, состоящие из повторяющихся олигосахаридных звеньев (в энтеробактериях - до 50 звеньев), которые состоят из 2-8 мономеров. Коровая область ЛПС состоит из комплексного олигосахарида, а что касается ее структуры, то она менее вариабельна, чем О-специфическая цепь [Zähringer U. et al. 1994]. В энтеробактериях и в бактериях некоторых других семейств между внешней коровой областью, содержащей преимущественно пиранозидные гексозы, такие как D-глюкоза, D-галактоза, 2-амино-2-дезокси-D-глюкоза или 2-амино-2-дезокси-D-галактоза, и внутренней коровой областью могут наблюдаться определенные различия. Во всех грам-отрицательных бактериях внутренняя коровая область содержит 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновую кислоту (2-кето-дезокси-D-манно-октоновую кислоту, Кdo), а в большинстве случаев она содержит L-глицеро-D-манно-гептозу (Нер). Структурно липид А образует наиболее единообразную часть ЛПС. Он может быть отделен от углеводной части путем гидролиза слабой кислотой, приводящего к разрыву гликозидной связи между Кdo и липидом А, и поэтому липид А становится легко доступным для детального структурного анализа. Было установлено, что образцы липида А, полученные из E.coli, были такими же эндотоксически активными in vitro, так и на моделях животных как ЛПС, что указывает на то, что липид А представляет собой эндотоксически активную часть ЛПС. Это было однозначно подтверждено химическим синтезом липида А из E.coli и обнаружением полной биологической активности синтезированного продукта. На фигуре 2 показана химическая структура липида А ЛПС Esсherichia coli, представленная в форме неполной монофосфориловой структуры (МРLA). Зрелый липид А содержит дополнительную фосфорильную группу в гликозилированном положении восстановительного глюкозаминового остатка. Термин “ЛПС” включает S-форму и R-форму ЛПС и его субструктуры, такие как липид А и его неполные структуры.

Термин “эндотоксически активная часть” эндотоксина обозначает части, которые обладают, по крайней мере, 50%-ной, предпочтительно, по крайней мере, 75%-ной, более предпочтительно, по крайней мере, 90%-ной, например, по крайней мере, 95%-ной, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, 100%-ной эндотоксической активностью по сравнению с природным эндотоксином. Предпочтительно, чтобы указанная эндотоксически активная часть представляла собой липид А. Наиболее предпочтительной эндотоксически активной частью является монофосфорилированный липид А (MPLA), описанный ниже в описании и в примерах.

Под гемоглобином (Hb) в данной области понимают гемопротеин, имеющий молекулярную массу 64500 Да, главной биологической функцией которого является транспорт кислорода (О₂). Hb взрослого человека (зрелый Hb)(HbA) состоит из 4 полипептидов (двух α- и двух β-цепей) и одной гемогруппы. Фетальный Hb (HbF) состоит из двух α-цепей и двух γ-цепей. HbA синтезируется в костном мозге, тогда как HbF синтезируется, главным образом, в печени (и в селезенке) плода. В настоящем изобретении, термин “фетальный гемоглобин” означает тетрамерные формы HbF, а также не содержащий гема HbF. Сочетание цепей включают α-,γ-димеры. Мономеры включают в себя α- и γ-мономеры.

При проведении начальных экспериментов, которые послужили основой для создания по настоящему изобретению, было неожиданно обнаружено, что биологическая активность фракций, выделенных из экстракта печени плода (овец)(FSLE)(описание номенклатуры смотри в примере 1), связана с присутствием небольших количеств бактериального эндотоксина в количестве порядка 10 нг/г (100 Ед/г) FSLE. Если экстракт печени плода овец фракционируют на сефадексе G100, как описано в примере 2, то небольшие количества эндотоксина накапливаются в двух фракциях, называемых CLP1b и CLP2p, которые представляют собой наиболее активные препараты, используемые в биологическом анализе.

Сравнительный биологический анализ, проводимый с использованием очищенного эндотоксина, дал основание предположить о присутствии в CLP1b и CLP2p фактора, способного модифицировать активность эндотоксина. Такой фактор был идентифицирован здесь как фетальный гемоглобин, а в частности, был идентифицирован его γ-цепочечный компонент. Кроме того, было обнаружено, что эндотоксин и фетальный гемоглобин, при их взаимодействии друг с другом, обладают синергическим действием, то есть максимальной биологической активностью. При проведении сравнительных анализов было обнаружено, что фетальный гемоглобин и субъединицы, содержащие γ-цепь, являются значительно более активными, чем зрелый гемоглобин и субструктуры, содержащие β-цепь (смотри примеры 8 и 9). Было также обнаружено, что экстракт печени плода, кроме того, активно воздействует на эндотоксин и гемоглобин, возможно, с точки зрения их фармакологической толерантности, или продолжительности их активности in vivo, то есть их биологической динамики. Затем экстракт из ткани плода (печени) тщательно анализировали на такие дополнительные биологически активные факторы, которые, вероятно, имеют полипептидную природу (смотри белковый анализ экстракта печени плода, описанный в примерах 3.2.2 и в таблице 4). Различные сочетания эндотоксина, гемоглобина и FSLE также анализировали на медикобиологическую активность, такую как активация макрофагов, опухолевый цитостаз и противоопухолевую цитотоксичность, динамику продукции цитокинов, действие, замедляющее проявление признаков старения и тому подобного, в различных системах организма человека (смотри примеры 8, 12, 13, 15).

Кроме того, было обнаружено, что соединения, полученные из FSLE, при их пероральном введении, также обладают биологической активностью (у мышей). Таким образом, пероральное введение подходящей комбинации этих отличающихся друг от друга биологически активных веществ, таких как эндотоксин, гемоглобин и FSLE (полипептиды), может послужить началом для их более широкого и более эффективного клинического применения, например для лечения рака, инфекций, аллергии и иммунного дисбаланса, связанного со старением.

Компоненты (фармацевтической) композиции по настоящему изобретению могут быть получены различными способами получения, однако выбор конкретных указанных ниже методов не исключает возможного применения других методов, а представляет лишь предпочтительный вариант осуществления изобретения, где такими методами являются экстракция из печени плода активных компонентов, которые находятся в ткани печени плода, так как биологически аккумулируются в ней; или химическое получение из доступных источников, например получение эндотоксина из культур грам-отрицательных бактерий или гемоглобина крови пупочного канатика; при этом отдельные цепи, такие как γ-цепь, а также их сочетания могут быть получены методами генной инженерии. Таким образом, компоненты препарата, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, могут быть получены из природных источников методами рекомбинантной ДНК/биохимического синтеза или методами химического синтеза, а также любыми их сочетаниями. Взаимодействие компонентов препарата может происходить после синтеза.

Что касается методов рекомбинантного получения, то нуклеиновая кислота, кодирующая указанный (поли)пептид, может быть использована в стандартном способе экспрессии, используя различные клетки-хозяева и экспрессирующие векторы (смотри, например, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989, “Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2001).

Как правило, во всех вариантах осуществления изобретения указанной клеткой-хозяином, используемой для способов рекомбинантного получения, может быть прокариотическая или эукариотическая клетка. Полинуклеотид или вектор, присутствующие в данной клетке-хозяине, могут быть либо интегрированы в геном такой клетки-хозяина, либо они могут присутствовать вне хромосомы. Термин “прокариотический” относится ко всем бактериям, которые могут быть трансформированы или трансфецированы вышеуказанной молекулой нуклеиновой кислоты или вектором. Прокариотическими хозяевами могут быть грам-отрицательные, а также грам-положительные бактерии, такие как, например, Esсherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин “эукариотический” относится к дрожжам рода Saccharomyces, в частности к дрожжам вида S. cerevisiae, к высшим растениям, грибам, насекомым и предпочтительно к млекопитающим, таким как клетки человека. Кроме того, для крупномасштабного получения белковых соединений, содержащихся в композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы трансгенные животные, а предпочтительно млекопитающие, содержащие указанные клетки-хозяева.

Векторами могут быть, в частности, плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги, обычно используемые в генной инженерии и содержащие полинуклеотиды по настоящему изобретению. При этом предпочтительно, чтобы указанный вектор был векторам экспрессии и/или ген-переносящим вектором или вектором, обеспечивающим доставку в определенную мишень. Экспрессирующие векторы, происходящие от вирусов, таких как ретровирусы, вирусы коровьей оспы, адено-ассоциированный вирус, герпесвирусы или коровий папиломавирус, могут быть использованы для доставки полинуклеотидов или вектора в популяцию клеток-мишеней. Для конструирования рекомбинантных вирусных векторов могут быть использованы способы, хорошо известные специалистам в данной области; смотри, например, способы, описанные в руководстве Sambrook et al.,(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, NY, Sambrook, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Альтернативно, полинуклеотиды и векторы могут быть введены в липосомы для доставки в клетки-мишени. Векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды, могут быть перенесены в клетку-хозяина хорошо известными способами, которые могут изменяться в зависимости от клетки-хозяина. Так, например, для прокариотических клеток обычно используется метод трансфекции с использованием хлорида кальция, тогда как для других клеток-хозяев могут быть использованы методы трансфекции, опосредуемой фосфатом кальция или DЕАЕ-декстраном, или метод электропорации, смотри выше Sambrook. Такие векторы могут содержать другие гены, такие как маркерные гены, которые позволяют проводить отбор указанного вектора в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях. При этом предпочтительно, чтобы последовательность, кодирующая указанный полипептид, была функционально присоединена к регулирующим экспрессию последовательностям, что позволяло бы осуществлять экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанного полинуклеотида предусматривает транскрипцию полинуклеотида в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, а предпочтительно в клетках млекопитающих, хорошо известны специалистам в данной области. К ним обычно относятся регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции и, необязательно, поли-А-сигнал, обеспечивающий терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта, и/или интрон, который, кроме того, усиливает экспрессию указанного полипептида. Дополнительные регуляторные элементы могут включать в себя усилители транскрипции, а также трансляции и/или природные или гетерологичные промоторные области. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, содержат, например, промоторы PL, lac, trp или tac в E.coli, и примерами регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, являются промотор АОХ-1 или GAL-1 в дрожжах или промотор CMV, SV40, RSV (вируса саркомы Рауса), энхансер CMV, энхансер SV40 или интрон глобина в клетках млекопитающих и других животных. Помимо элементов, ответственных за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы могут содержать сигналы терминации транскрипции, такие как SV40-poly-A-сайт или tk-poly-A-сайт, находящийся в нуклеотидной последовательности после сайта экспрессии полинуклеотида. Кроме того, в зависимости от используемой системы экспрессии в кодирующую последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, могут быть добавлены лидерные последовательности, способные доставлять данный полипептид в данный компартмент клетки или обеспечивать его секрецию в среду и эти последовательности хорошо известны специалистам. Лидерная(ые) последовательность(и) подвергается(ются) сборке в соответствующей фазе вместе с последовательностями трансляции, инициации и терминации, а предпочтительно лидерная последовательность способна направлять секрецию транслированного белка или его части в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. Гетерологичная последовательность может, но необязательно, кодировать гибридный белок, включая С- или N-концевой идентифицирующий пептид, обладающий нужными свойствами, например способностью стабилизировать или облегчать очистку экспрессированного рекомбинантного продукта. В этом контексте подходящими экспрессирующими векторами являются векторы, известные специалистам, такие как вектор для экспрессии кДНК Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, система клонирования Echo^TM (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL) или pRevTet-On/pRevTet-Off или pCI (Promega). Предпочтительно, чтобы последовательности регуляции экспрессии представляли собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева, однако могут быть также использованы регуляторные последовательности прокариотических хозяев.

Компонент гемоглобина (включая отдельную цепь(и) или сочетание(я) цепей) по настоящему изобретению может быть получен методом, предусматривающим культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для синтеза указанного (поли)пептида (то есть пептида, содержащего до 30 аминокислот, или полипептида, содержащего более чем 30 аминокислот) и выделения и/или отделения указанного (поли)пептида либо из супернатанта, либо из клеток организма.

В частности, трансформированные/трансфецированные хозяева могут быть выращены в биореакторах и культивированы методами, хорошо известными специалистам в данной области и применяемыми для достижения оптимального клеточного роста. Затем гемоглобиновый компонент и, необязательно, другие белки могут быть выделены из культуральной среды, из клеточных лизатов или из клеточных мембранных фракций. После экспрессии указанный белок может быть очищен в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам в данной области, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную колоночную хроматографию, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и тому подобное; смотри работу Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982). Для фармацевтического применения предпочтительными являются, в основном, чистые полипептиды, обладающие, по крайней мере, примерно 90-95%-ной гомогенностью, а наиболее предпочтительными являются полипептиды, обладающие 98-99%-ной гомогенностью или выше.

Очищенные (частично) компоненты могут быть смешаны в любом нужном соотношении (по массе). Чистый эндотоксин и чистый фетальный гемоглобин могут быть также добавлены в определенных количествах к данному количеству экстракта печени плода (FSLE) с получением композиций по настоящему изобретению.

Исходная доза фармацевтической композиции для внутримышечной инъекции, полученной, например, с использованием FSLE, может составлять 680 мг (определенная как разовая доза), из которых приблизительно 300 мг составляет белок; приблизительно 320 мг составляет небелковое вещество; и 60 мг составляет хлорид натрия. Одна доза этого материала содержит приблизительно 6 нг эквивалентов ЛПС. Из 690 мг FSLE после фракционирования на сефадексе G-100 получали приблизительно 20 мг CLP1b/2p (~3%). Limulus-тест (LAL) этого материала показал, что в 20 мг полученного вещества, которые являются частью стандартной внутримышечной инъекции, содержится приблизительно 2 мкг (2×10⁴ МЕ) эквивалентов ЛПС.

Максимальная переносимая доза (МТD) выделенного ЛПС (в.в.) для человека составляет, в целом, порядка 0,05-0,1 мкг (приблизительно 1 нг/кг массы тела). Соответствующая разовая доза FSLE, содержащая 620 мг органического вещества, соответственно, содержит в среднем максимально переносимую дозу (МТD) 20-40 (в.в.) ЛПС, которая при ее внутримышечной инъекции не вызывает субъективных побочных эффектов.

Таким образом, в зависимости от способа введения инъецируемая разовая доза может содержать 10-100 нг (в.в.) или 0,2-2 мгк (внутримышечно, подкожно или интрадурально) или до 1 мг (перорально) эквивалентов ЛПС, 0,001-10 мг (или более) фетального гемоглобина или неполных структур, таких как предпочтительно структуры, содержащие γ-цепь, и ~0,1-500 мг (или более) гликопротеина (полипептидов) печени плода.

Композиция по настоящему изобретению может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или наполнитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны специалистам в данной области, и такими носителями являются изотонические растворы забуференных фосфатом физиологических растворов, вода, эмульсии, такие как эмульсии типа “масло в воде”, смачивающие агенты различных типов, стерильные растворы и тому подобное. Композиции, содержащие такие носители, могут быть получены хорошо известными стандартными способами. Эти композиции в зависимости от способа введения могут быть получены в виде жидкостей, гелей, сиропов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул или драже. Такие композиции могут быть введены индивидууму в подходящей дозе. Введение подходящих композиций может быть осуществлено различными путями, например внутривенным, подкожным, внутримышечным, местным, чрескожным, интраназальным или пероральным путями. Схема введения лекарственного средства может быть определена лечащим врачом и зависит от клинических факторов. Как хорошо известно специалистам-медикам, дозы для каждого определенного пациента зависят от множества факторов, включая, в частности, вводимое соединение: общего состояния здоровья пациента, массы тела, площади поверхности тела, возраста, пола, времени и пути введения и других совместно вводимых лекарственных средств. Как указывалось выше, типичная доза для введения человеку может, например, составлять от 0,01 до 1000 мкг эквивалентов ЛПС в зависимости от пути введения. Однако если принять во внимание вышеуказанные факторы, то можно предусматривать дозы ниже или выше этих типичных пределов, особенно рассматривая эти факторы в отношении перорального введения. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают по технологии, принятой Федеральным законодательством и удовлетворяющей требованиям стандартам GMP. Примеры наполнителей также хорошо известны специалистам в данной области, и такими наполнителями являются любые более или менее инертные вещества, которые добавляют в композицию препарата для придания данному лекарственному средству подходящей консистенции или формы. Примерами наполнителей являются, но не ограничиваются ими, лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза и компоненты сахаров.

Как указывалось выше и в соответствии с настоящим изобретением, было неожиданно обнаружено, что препарат, содержащий эндотоксин, фетальный гемоглобин или его отдельную(ые) цепь(и) или комбинацию(и) этих цепей, например гемоглобин без гема, и, необязательно, другие компоненты экстракта печени плода, может обладать благоприятным биологическим эффектом, а в частности, он может использоваться для лечения рака, инфекций, вызванных патогенами и, в частности, вирусами, аллергии и для замедления процессов старения. Настоящее изобретение также предлагает новую концепцию, заключающуюся в том, что физиологическое и in vivo взаимодействие эндотоксина и гемоглобина, присутствующего в печени плода овцы, позволяет получить препарат, обладающий благоприятным эффектом, включая ингибирование роста опухоли и активацию иммунной системы. В результате было обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением, такие препараты, после их выделения предпочтительно из ткани печени плода или после их получения предпочтительно химическими методами или методами, используемыми в молекулярной биологии, также обладают терапевтически эффективным действием при их введении взрослым млекопитающим, включая человека (смотри примеры 8, 12, 13, 15). Как описано ниже в разделе “Примеры”, такие препараты возможно получить из экстрактов гомогенатов печени плода, и было показано, что эти экстракты обладают сильным активирующим действием на макрофаги, индуцируют опухолевую цитотоксичность в клеточной системе человека, ингибируют рост опухоли, а также способствуют устранению нарушений иммунной системы, ассоциированных с процессами старения, и ее восстановлению до статуса иммунной системы молодых людей. Очевидно, что эти препараты могут отвечать за многие благоприятные клинические эффекты, присущие ткани печени плода, применяемой в так называемой “клеточной терапии”. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может быть использована в качестве средства для нейтрализации побочных реакций после облучения, например, в качестве вспомогательного средства, предотвращающего или снижающего негативные побочные эффекты при лечении опухолей облучением. При этом следует отметить, что во всех вышеуказанных применениях композиция по настоящему изобретению хорошо переносилась или предположительно хорошо переносилась пациентами, которые ее принимали. Как очевидно из приведенного выше описания, композиция по настоящему изобретению может быть с успехом использована для лечения или предупреждения различных заболеваний широкого ряда, а также как средство против преждевременного старения. Хотя широкий спектр различных клинических применений данной композиции является до некоторой степени неожиданным, однако еще более удивительным является тот факт, что композиция по настоящему изобретению обнаруживает гетерогенный характер ее полезной лекарственной активности. Эти данные являются неожиданными, несмотря на тот факт, что биологическая активность зрелого гемоглобина или его производных была изучена ранее. Было показано, что зрелый гемоглобин стимулирует рост бактерий [Dunn et al., 1983], активирует комплемент [Kaca, W., 1995] и индуцирует TNFα в моноцитах [Carillo, E., 2002]. Было также обнаружено, что зрелый гемоглобин также взаимодействует с эндотоксином [Roth R.J. & Levin J., 1999]. В частности, при одновременном использовании эндотоксина и гемоглобина наблюдалась повышенная токсичность. Этот эффект был объяснен как опосредуемое эндотоксином увеличение биологической активности гемоглобина [White, C.T., 1986], или альтернативно, как опосредуемое гемоглобином усиление активности эндотоксина [Su, D. et al., 1999]. В этих исследованиях ЛПС и гемоглобин анализировали в различных анализах in vitro, проводимых, в основном, с использованием мононуклеарных клеток, либо их ввели мышам или кроликам внутривенно или внутрибрюшинно. Препараты гемоглобина, которые использовали в этих предшествующих исследованиях, содержат неочищенный человеческий безстромальный и коровий гемоглобин (SFH), человеческий перекрестно-сшитый α,α-Hb, полимеризованный коровий гемоглобин (Biopure 2) и его химические модификации. До настоящего времени не проводилось каких-либо исследований фетального гемоглобина, его димера α,γ-цепи или очищенных α- и γ-цепей, из которых заявитель в данной области мог бы почерпнуть хоть какую-нибудь информацию. В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что фетальный гемоглобин, или димер α,γ-цепи, или мономер γ-цепи, взятые вместе с эндотоксином, обладает значительно выраженным синергическим действием, чем вместе с HbA или с его субструктурами. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что синергическое действие также возникает с гемоглобином, не содержащим гема (глобином). Этот факт противоречит имеющимся ранее предположениям, а именно тем, что отрицательно заряженный ЛПС взаимодействует с Fе²⁺-ионами, присутствующими в геме. Другой неожиданностью явился тот факт, что для взаимодействия с эндотоксином не требуется присутствия полной глобиновой структуры, а достаточно лишь α,γ-цепи или одной γ-цепи. Поскольку димеры α,β-цепи в сочетании с ЛПС обладают вполне умеренной синергической активностью, то очевидно, что этот биологический эффект оптимально опосредуется γ-цепью. Однако в случае использования гем-содержащего миоглобина какого-либо усиления биологического эффекта фетального гемоглобина или его неполных структур не наблюдалось (данные не приводятся). Внутривенное введение HbA и ЛПС приводит к возникновению сильных биологических эффектов. В противоположность этому препараты по настоящему изобретению, вводимые внутримышечно или перорально, являются нетоксичными и оказывают лишь благоприятное действие.

Эндотоксин, присутствующий в экстрактах плода, может возникать от бактериальной флоры материнского организма, но находится в биологически скрытой форме, хотя заявитель не предполагает ограничиваться какой-либо теорией в этой области. Это подтверждается наблюдением, что биологически активные фракции при поддержании их при 37°С в течение 0,5-2 часа (в примерах, они названы как CLP1b и 2р) обладают в 30-40 раз большей противоопухолевой активностью. Наряду с этими изменениями наблюдается параллельное увеличение (до 75 раз) концентрации свободного эндотоксина, то есть эндотоксина, определяемого в Limulus-тесте (в пробе с лизатом амебоцитов). Таким образом, очевидно, что дополнительная биологическая активность ЛПС может проявляться при кратковременном инкубировании гомогената печени при температуре организма. И хотя заявитель не предполагает ограничиваться какой-либо теорией, однако следует отметить, что в этом случае печень плода овцы, по-видимому, содержит небольшие количества (пикограмм/миллиграмм) эндотоксина в физическом состоянии агрегации, в котором, как показал Limulus-тест, он является почти неактивным, то есть он почти не обладает биологической активностью. При взаимодействии агрегированного эндоткосина с фетальным гемоглобином, что можно наблюдать после внутримышечного или перорального введения, этот эндотоксин преобразуется в свою биологически активную форму, также обладающую благоприятными клиническими эффектами, описанными для композиции по настоящему изобретению. Эта композиция может действовать как депо, из которого может динамично высвобождаться биологически активный эндотоксин. Таким образом, действие эндотоксина может быть ослаблено и, следовательно, может лучше переноситься пациентом.

Композиция по настоящему изобретению, предназначенная для клинического применения, предпочтительно содержит минимальное количество 0,001-10 мг фетального гемоглобина или отдельных цепей или комбинацию этих цепей и 0,01-1000 мкг эндотоксина или его эндотоксически активной части.

Композиция по настоящему изобретению может содержать эндотоксин одного или нескольких типов (например, бактериальную S- и R-форму ЛПС или субструктуры) и фетальный гемоглобин одного или нескольких типов (субструктуры) или дополнительные (поли)пептиды. Таким образом, композиция может быть гомогенной или гетерогенной.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению указанный фетальный гемоглобин или отдельная(ые) цепь(и) или сочетания(й) этих цепей выделяют из ткани плода млекопитающего, не являющегося человеком.

В соответствии с настоящим изобретением термин “указанный фетальный гемоглобин или его отдельная(ые) цепь(и) или сочетание(я) этих цепей, выделенные из ткани плода млекопитающего, не являющегося человеком”, предпочтительно обозначает, что указанный препарат получают непосредственно из указанной ткани путем очистки. Альтернативно, указанный термин означает, что указанный препарат является идентичным или, в основном, идентичным препарату, непосредственно выделенному из указанной ткани, но продуцированному рекомбинантным или (полу)синтетическим способом.

В особенно предпочтительном варианте композиции по настоящему изобретению указанная ткань плода млекопитающего, не являющегося человеком, взята у овцы, козы, лошади или коровы.

Хотя в прилагаемых здесь примерах (описывающих предпочтительный способ получения ингредиентов указанной композиции) экстракты, выделенные из ткани плода овцы,