Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела

Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к моноклональному антителу к вирусу типа А гриппа и устройству для иммунологического анализа с использованием антитела.

Уровень техники

С древних времен грипп является наиболее широко распространяющимся во всем мире, периодически повторяющимся заболеванием. Каждый раз при широком распространении инфекции некоторое количество людей умирает от этого заболевания. В 1931 году вирус, вызывающий заболевание, был выявлен, что открыло дорогу к выяснению причин заболевания. Вирус, вызывающий грипп, классифицируют на три типа, а именно на типы А, В и С, в зависимости от антигенности растворимого нуклеопротеина (NP), локализованного в вирусе. Вирус А гриппа далее классифицируют на подтипы в зависимости от антигенности двух оболочечных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA).

С 1972 года для профилактики гриппа использовали вакцину, инактивированную формалином, после ее обработки эфиром. В последние годы помимо вакцины, используемой для профилактики гриппа, были разработаны лекарства против гриппа, которые в настоящее время широко используются. Такие терапевтические лекарства включают гидрохлорид амантадина, эффективный против вируса А гриппа, и занамивир (zanamivir) и фосфат осельтамивира (oseltamivir phosphate), эффективные против вирусов А и В гриппа.

При выборе терапевтических лекарств важно обнаружить вирус гриппа в образце, подтвердить, что он является причиной инфекции, и определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или типа В. Далее, в связи с тем, что вирус А гриппа является более заразным, чем вирус В гриппа, и вызывает возникновение серьезных симптомов, определение типа инфекционного вируса является особенно важным для ранней терапии.

Вирусы гриппа обычно определяли (детектировали), используя антитела к вирусу гриппа. Что касается антител к вирусу А гриппа, известны антитела для определения подтипа вируса, специфично распознающие НА или NA вируса, необходимые для производства вакцины после определения подтипа вируса, который, как ожидается, будет превалировать (см., например, ссылки на патентные источники 1 и 2). Аминокислотные последовательности нуклеопротеинов подтипов вируса А гриппа были определены и представлены в Национальной Медицинской Библиотеке (National Library of Medicine); базе данных Entrez Nucleotides и др.

В качестве устройства для детектирования вируса гриппа известно устройство проточного типа (см. ссылку на патентные источники 3), которое содержит твердую фазу, на которой может быть иммобилизован антиген вируса гриппа. В этом устройстве вирус гриппа, содержащийся в образце, взаимодействует с твердой фазой, затем антитело к вирусу А гриппа, меченное первым ферментом, и антитело к вирусу В гриппа, меченное вторым ферментом, взаимодействуют с твердой фазой. После этого добавляют субстраты для проведения реакции и визуально наблюдают окрашивание твердой фазы. Несмотря на то, что в этом устройстве используют антитела к нуклеопротеинам вирусов гриппа, процедура измерений является сложной, так что это устройство не является простым измерительным средством. Кроме того, известно устройство для иммунологического анализа (которое далее будет названо «иммунохроматографическим устройством»), в котором использовано моноклональное антитело к нуклеопротеину вируса гриппа (см. ссылку 1 на непатентную литературу).

С другой стороны, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором использована сходная с лентой основа (матрикс), через которую может быть осуществлен перенос жидкости. С помощью этого устройства можно легко и за короткое время измерить антитело или антиген в образце просто путем нанесения образца на заранее определенную область без специального устройства или сложной измерительной техники. Например, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором множество антигенов Treponema pallidum (TP антигены) связаны в зоне детектирования, и множество антител к TP, содержащихся в образце, можно определить в отдельных зонах детектирования (см. ссылку на патентные источники 4). Это устройство содержит множество зон детектирования, в которых, соответственно, связаны различные TP антигены. В этом устройстве различные антитела к TP определяются раздельно в одно измерение. Это позволяет определить время инфицирования, что используется при выборе терапевтического лекарства и пр.

Ссылки на патентные источники:

1: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №6-100594

2: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №7-304799

3: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №2001-124775

4: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №9-229938

Ссылки на непатентную литературу;

1: The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 2001; 75: 792-799

Раскрытие изобретения

Проблемы, на решение которых направлено данное изобретение

Несмотря на то, что антитела к нуклеопротеину вируса А гриппа широко используются в иммунохроматографических и других сходных способах, известные антитела обладают низкой реакционной способностью и специфичностью к вирусу А гриппа, так что они не могут быть признаны удовлетворительными для высокочувствительных иммунологических анализов. Кроме того, для выбора терапевтического лекарства против гриппа требуется антитело, которое не взаимодействует с вирусом В гриппа, но взаимодействует со всеми вирусами А гриппа, включая подтипы, в которых НА и NA мутировали.

Кроме того, существует потребность в устройстве, с помощью которого можно отличить вирус А гриппа от вируса В гриппа в одну операцию в течение короткого промежутка времени, без использования специального диагностического оборудования или измерительного устройства.

Следовательно, целью данного изобретения является получение антитела к вирусу А гриппа, обладающего высокой специфичностью. Другой целью данного изобретения является разработка устройства для иммунологического анализа, с помощью которого можно было бы специфично определить вирус А гриппа.

Способы решения проблем.

Авторы данного изобретения интенсивно изучали и преуспели в создании антитела к вирусу А гриппа, соответственно к нуклеопротеину вируса А гриппа, которое специфично взаимодействует с вирусом А гриппа, что и является целью данного изобретения. Авторами данного изобретения также было сделано заключение, что можно разработать устройство для иммунологического анализа, с помощью которого можно определить вирус А гриппа, при этом отличая его от вируса В гриппа, за счет использования этого антитела к вирусу А гриппа.

Таким образом, в данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу А гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, имеющим молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа, и которое практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу А гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса А гриппа, в которой антитело к вирусу А гриппа иммобилизуется на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является описанным выше моноклональным антителом по данному изобретению.

Результат изобретения.

В данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу А гриппа, которое иммунологически взаимодействует с вирусом А гриппа, но не взаимодействует с вирусом В гриппа. С помощью иммунологических анализов с использованием моноклонального антитела к вирусу А гриппа по данному изобретению можно определить (детектировать) или количественно измерить вирус А гриппа, при этом отличая его от вируса В гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором используют описанное выше моноклональное антитело к вирусу А гриппа по данному изобретению. С помощью устройства для иммунологического анализа по данному изобретению вирус А гриппа можно легко детектировать, при этом отличая его от вируса В гриппа. Следовательно, ожидается, что данное изобретение внесет значительный вклад в диагностику и терапию гриппа.

Краткое описание чертежей.

На Фиг.1 приведены результаты экспериментов, в которых моноклональные антитела по данному изобретению взаимодействовали с антигенами, фракционированными методом белкового блоттинга.

На Фиг.2 приведена рестрикционная карта экспрессионной плазмиды (pW6A), которую использовали в Примере 4.

На Фиг.3 приведены номера аминокислот фрагментов А1-А7, полученных фрагментацией А фрагмента гриппа H1N1.

На Фиг.4 приведена картина окрашивания кумасси (СВВ) и результаты белкового блоттинга для подтверждения реакционной способности по отношению к FVA2-11.

На Фиг.5 приведены аминокислотные последовательности (80-140) нуклеопротеинов подтипов вируса А гриппа.

На Фиг.6 представлено схематичное изображение в сечении варианта выполнения измерительного устройства согласно данному изобретению.

На Фиг.7 приведен вид сверху, показывающий пример состояния (режима работы), когда измерительное устройство по данному изобретению помещено в кассету.

На Фиг.8 приведено поперечное сечение, выполненное по линии А-А', показанной на Фиг.7.

Наилучший вариант выполнения изобретения.

Как описано выше, моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, причем нуклеопротеин имеет молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа. Тот факт, что антитело вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, имеющим молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа, может быть подтвержден методом белкового блоттинга, включающим гель-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с использованием вируса А гриппа в качестве образца. Согласно данным белкового блоттинга (см. Примеры ниже), моноклональное антитело по данному изобретению распознает нуклеопротеин, имеющий молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа.

Как уже было отмечено выше, моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело» в данном описании означает, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело на таком уровне, чтобы ее можно было детектировать, и даже если антитело вступает в реакцию антиген-антитело, то степень взаимодействия оказывается очевидно меньше, чем степень взаимодействия с вирусом А гриппа, так что специалистам ясно, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа» в данном описании означает, что антитело практически не вступает в реакцию антиген-антитело не только с нуклеопротеином вируса В гриппа, но также и с белками или другими компонентами вируса В гриппа. В предпочтительном варианте выполнения моноклональное антитело по данному изобретению также практически не взаимодействует с вирусом С гриппа.

Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению взаимодействует с эпитопом, присутствующем в области между 59-й аминокислотой (далее обозначенной как «5аа») и 130-й аминокислотой («130аа») нуклеопротеина вируса А гриппа. Аминокислотная последовательность вируса А гриппа известна и описана, например, в GenBank Accession №ITY238021 и др. Аминокислотные последовательности участка 59аа-140аа нуклеопротеинов различных подтипов вируса А гриппа показаны на Фиг.5. Так как одно и тоже моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса А гриппа, то, согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения, моноклональное антитело взаимодействует с эпитопом на участке, имеющим общую последовательность и гидрофильную структуру, например, на участке 90аа-95аа, 111аа-115аа, 120аа-123аа или аналогичных в аминокислотных последовательностях, приведенных на Фиг.5, или моноклональное антитело взаимодействует с эпитопом, включающим эти участки и имеющим общую последовательность.

Согласно предпочтительному варианту выполнения моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса А гриппа. На поверхности частицы вируса А гриппа расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N), причем вирус А гриппа разделяют на подтипы в зависимости от различий в структурах Н и N. Моноклональное антитело по данному изобретению предпочтительно вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеинами по крайней мере следующих подтипов вируса А гриппа: H1N1, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H5N2, H6N2, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, H15N8 и H5N1, и, более предпочтительно, с нуклеопротеинами всех подтипов вируса А гриппа.

Согласно предпочтительному варианту выполнения моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с патогенами других инфекционных заболеваний, симптомы которых хотя бы частично сходны с симптомами гриппа. Таким образом, предпочтительное моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело, например, с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы 1-3), RS (респираторно-синцитиальным) вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы 1-3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes. Streptococcus sp.(группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae.

Хорошо известно, что с помощью расщепления антитела папаином или пепсином можно получить фрагменты антитела, обладающие способностью связываться с соответствующим антигеном, такие как Fab фрагмент и F(ab')₂ фрагмент (которые в данном описании названы «антигенсвязывающими фрагментами»). Согласно данному изобретению антигенсвязывающие фрагменты моноклонального антитела по данному изобретению можно использовать таким же образом, как и моноклональное антитело, что находится в рамках данного изобретения.

Моноклональное антитело по данному изобретению можно получить традиционным гибридомным способом, используя нуклеопротеин вируса А гриппа в качестве иммуногена. В связи с тем, что в качестве иммуногена используется нуклеопротеин вируса А гриппа, может быть использована любая вирусная культуральная среда, вакцина против НА гриппа, НА антиген для HI и рекомбинантный антиген до тех пор, пока нуклеопротеин присутствует в большом количестве и может служить в качестве иммуногена. Для того чтобы ингибировать высоко иммуногенные НА и NA, присутствующие в антигене, нуклеопротеин очищают с помощью ультрацентрифугирования (см., например, J. Biochem.; 102:1241-1249, 1987), или можно использовать антиген, обработанный протеазой (см., например, J. Immunol. Methods; 180:107-116, 1995).

Моноклональное антитело можно получить с помощью гибридомы, полученной иммунизацией животного антигеном, содержащим описанный выше нуклеопротеин вируса А гриппа, и слиянием животной клетки, продуцирующей моноклональное антитело, с опухолевой клеткой.

Описанная выше гибридома может быть получена следующим способом. Нуклеопротеин вируса А гриппа, полученный как описано выше, который предполагают использовать в качестве антигена, внутрибрюшинно или внутривенно вводят животному, такому, как мышь, дробно, несколько раз с промежутками от 2 до 3 недель вместе с полным адъювантом Фрейнда (Freund's complete adjuvant). Затем осуществляют слияние клеток селезенки или аналогичных клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми клетками, которые могут расти in vitro, такими, как клетки линии миеломы.

Слияние можно осуществить, используя полиэтиленгликоль согласно традиционному способу Kohler и Milstein (Nature, vol.256, 495, 1975), или используя вирус Sendai или сходный вирус.

Отбор гибридом, продуцирующих антитело, которое распознает нуклеопротеин вируса А гриппа, из полученных слиянием клеток можно провести следующим образом. Те из полученных слиянием клеток, которые остаются живыми в HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) среде и/или НТ (гипоксантин, тимидин) среде, могут быть отобраны в качестве гибридом способом ограниченного разбавления. Затем гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, которое специфично распознает нуклеопротеин вируса А гриппа, можно отобрать с помощью EIA (иммуноферментного анализа) или сходным способом, причем культуральная среда гибридомы взаимодействует с высокоочищенным нуклеопротеином вируса А гриппа, иммобилизованным на аналитической плашке, а затем дополнительно взаимодействует с анти-мышиным иммуноглобулином (Ig) или аналогичным.

В приведенных ниже Примерах описано множество полученных предпочтительных моноклональных антител по данному изобретению, и три из них были названы гибридома FVA2-3, гибридома FVA2-6 и гибридома FVA2-11, соответственно. Эти гибридомы были депонированы в Международном Патентном Депозитарии Организмов (International Patent Organism Depositary), Национальном Институте Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Япония), в качестве международного депонирования в соответствии с Будапештским Соглашением. Таким образом, гибридома FVA2-3 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-3» под инвентарным номером FERM ВР-10066 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19437); гибридома FVA2-6 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-6» под инвентарным номером FERM BP-10067 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM Р-19438); и гибридома FVA2-11 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-11» под инвентарным номером FERM ВР-10068 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19439).

Каждую из описанных выше гибридом можно выделить путем культурирования гибридомы в среде, обычно используемой для клеточных культур, а моноклональное антитело можно выделить из супернатанта культуры. В альтернативном варианте моноклональное антитело можно выделить путем введения гибридомы животному того вида, от которого она была получена, для аккумулирования в нем асцита и путем выделения моноклональных антител из асцита.

Для выделения моноклональных антител можно использовать традиционные способы очистки. Примеры таких способов очистки включают гель-проникающую хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с использованием белка А и аналогичные способы.

Было подтверждено, что моноклональные антитела, полученные описанным выше способом, взаимодействуют с нуклеопротеином вируса А гриппа и с различными подтипами вируса А гриппа. Они вступают в реакцию с 38 исходными штаммами (см. Таблицу 3 ниже) вируса А гриппа людей, лошадей, уток, индюков, тюленей, кур, чаек, диких уток и пр., и исходные штаммы можно определить, используя моноклональные антитела по данному изобретению. С другой стороны, была протестирована перекрестная реактивность с микроорганизмами, например, аденовирусом (типы 1-7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. Взаимодействие не было обнаружено.

Моноклональное антитело согласно данному изобретению можно использовать в иммунологических анализах для определения (детектирования) или количественного измерения вируса А гриппа. Иммунологические анализы сами по себе хорошо известны, и можно использовать любой из известных способов иммунологических исследований. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по типу реакции, их можно разделить на сэндвичевые иммунологические анализы, конкурентные иммунологические анализы, иммунологические анализы, основанные на агглютинации, белковый блоттинг и пр. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по использованной метке, их можно разделить на флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноферментные анализы, радиоиммунологические исследования, иммунологические анализы, основанные на использовании биотина, и пр. Можно использовать любой из этих способов. Более того, диагноз можно получить с помощью иммуногистоокрашивания. В тех случаях, когда в иммунологическом исследовании используют меченое антитело, можно использовать любой из хорошо известных способов, т.к. сами по себе способы мечения антител хорошо известны. Известно, что расщепление антитела с помощью папаина или пепсина приводит к получению фрагмента антитела, такого, как Fab фрагмент или F(аb')₂ фрагмент, обладающего способностью связываться с соответствующим антигеном (такой фрагмент в описании назван «антигенсвязывающим фрагментом»), Антигенсвязывающие фрагменты антитела по данному изобретению также могут быть использованы тем же образом, как и само антитело по данному изобретению.

Такие иммунологические исследования сами по себе хорошо известны из уровня техники, поэтому нет необходимости разъяснять их в данном описании. Если коротко, в сэндвичевых иммунологических анализах, например, антитело по данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на твердом носителе (подложке) как первое антитело. Первое антитело затем вступает в реакцию с образцом, а после промывки твердого носителя получившийся в результате комплекс взаимодействует со вторым антителом, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа по данному изобретению. После промывки твердого носителя измеряют второе антитело, связанное с твердым носителем. Если пометить второе антитело ферментом, флуоресцентным соединением, радиоактивным соединением, биотином и т.д., то измерить количество второго антитела, связанного с твердым носителем, можно, измеряя количество метки. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых содержит известную концентрацию нуклеопротеина, после чего для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренного количества метки от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, наложив измеренное количество на калибровочную кривую. Следует заметить, что первое антитело и второе антитело можно поменять. В иммунологических анализах, основанных на агглютинации, антитело согласно данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на частицах, таких, как латексные частицы, и частицы взаимодействуют с образцом, после чего проводят измерение оптической плотности. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых имеет известную концентрацию нуклеопротеина, и для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренной оптической плотности от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, сравнив измеренную оптическую плотность с калибровочной кривой.

В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором использовано моноклональное антитело согласно данному изобретению, с помощью которого вирус А гриппа можно легко определить, при этом отличая его от вируса В гриппа.

Устройство для иммунологического анализа содержит зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу А гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса А гриппа, в которой антитело к вирусу А гриппа иммобилизуется на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является описанным выше моноклональным антителом по данному изобретению. Образец, нанесенный в зоне нанесения образца, вступает в реакцию антиген-антитело с меченым антителом, находящимся в зоне меченого реагента, за счет чего формируется меченый комплекс антиген-антитело. Этот комплекс антиген-антитело переносится проявителем, поступающим из зоны подачи проявителя, в зону детектирования вируса А гриппа. Антитело к вирусу А гриппа иммобилизовано на матриксе и меченый комплекс антиген-антитело вступает в реакцию антиген-антитело, так что меченый комплекс антиген-антитело оказывается иммобилизованным на матриксе. Иммобилизован ли комплекс антиген-антитело в зоне детектирования вируса А гриппа или нет, оценивают по наличию метки. Проявитель, проходящий через зону детектирования вируса А гриппа, абсорбируется в зоне поглощения (впитывания) проявителя. Зона нанесения образца и зона меченого реагента могут быть одной и той же зоной (в этом случае образец наносят на зону меченого реагента). В устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело или антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса А гриппа - является моноклональным антителом по данному изобретению. Одно из антител может быть также поликлональным антителом. Так как множество молекул нуклеопротеина вируса А гриппа обычно связываются или соединяются друг с другом, вирус А гриппа можно определить, даже если меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса А гриппа, являются тем же самым моноклональным антителом.

Составные части (компоненты) устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению ниже будут описаны по отдельности.

Матрикс

Матрикс в виде ленты в устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению изготовлен из водопоглощающего материала, в котором жидкость может перемещаться за счет капиллярных сил. Примеры водопоглощающих материалов включают в себя целлюлозу и ее производные, такие, как целлюлоза и нитроцеллюлоза, и фильтровальную бумагу, изготовленную из одного стекловолокна или включающую стекловолокно, мембраны и пористые материалы, Несмотря на то, что размер матрикса не ограничен, предпочтительными являются матриксы в форме полоски (ленты) шириной примерно от 3 мм до 10 мм и длиной примерно от 30 мм до 100 мм, так как они удобны в обращении. Для предотвращения неспецифичной адсорбции белков, присутствующих в образце, на матриксе в процессе измерения, часть или весь матрикс можно блокировать сывороточным животным белком, таким, как бычий сывороточный альбумин (БСА, BSA), казеином, сахарозой и др.

Зона детектирования

В зоне детектирования можно задать участок детектирования вируса А гриппа, на котором на матриксе иммобилизовано антитело к вирусу А гриппа. По крайней мере, одно из следующих - антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на этом участке детектирования, или меченое антитело к вирусу А гриппа, описанное ниже, - является моноклональным антителом по данному изобретению, причем предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению. Антитело к вирусу А гриппа в зоне детектирования предпочтительно размещено на матриксе в форме линии, перпендикулярной направлению перемещения потока жидкости (продольному направлению матрикса) для измерения с высокой чувствительностью. Подходящее поликлональное антитело, используемое в качестве поликлонального антитела к вирусу А гриппа, может быть выбрано из коммерчески и легко доступных поликлональных антител.

Антитело к вирусу А гриппа в зоне детектирования представляет собой описанное выше антитело, причем моноклональные антитела могут быть использованы индивидуально или в комбинации. Антитело к вирусу А гриппа может быть антителом к IgG или IgM, или может быть Fab, F(ab')₂ или аналогичным, являющимся антигенсвязывающим фрагментом этих антител.

Антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на участке детектирования, может быть физически адсорбировано непосредственно в зоне детектирования матрикса, или может быть зафиксировано с помощью химической связи, например ковалентной. В альтернативном варианте антитело к вирусу А гриппа может быть связано с нерастворимым в воде носителем, а носитель может содержаться в матриксе. Примеры нерастворимых носителей включают частицы, полученные путем осаждения смеси желатина, аравийской камеди и гексаметафосфата натрия (Японская патентная публикация №63-29223), полистирольные латексные частицы, стекловолокно и пр. Моноклональное антитело к вирусу А гриппа может быть связано с нерастворимым носителем за счет описанного выше химического связывания или физической адсорбции.

В зоне детектирования помимо участка детектирования вируса А гриппа с помощью антитела к вирусу А гриппа может быть задан участок детектирования вируса В гриппа с помощью антитела к вирусу В гриппа. Такой участок детектирования вируса В гриппа может быть расположен вблизи от участка детектирования вируса А гриппа либо до («выше»), либо после («ниже») него по направлению потока проявителя. Антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на участке детектирования вируса В гриппа, может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и может, как и в случае антитела к вирусу А гриппа, быть иммобилизовано на матриксе за счет химической связи или физической адсорбции.

Как было отмечено ранее, предпочтительно задать участок детектирования вируса В гриппа в дополнение к участку детектирования вируса А гриппа, для того, чтобы одновременно определять (измерять) вирус А гриппа и вирус В гриппа. Такие участки детектирования расположены после («ниже») зоны меченного ферментом реагента, зоны нанесения образца и зоны подачи проявителя, и до («выше») зоны поглощения проявителя, по направлению потока жидкости в матриксе. Участки детектирования могут быть заданы на матриксе в виде множества линий, каждая из которых имеет ширину от примерно 0.5 мм до 5 мм, причем эти линии расположены близко друг от друга. В случае использования матрикса с шириной около 5 мм участки детектирования можно задать посредством нанесения антитела и антигена, обычно в количестве примерно от 0.1 мкг до 10 мкг, соответственно, и высушивания матрикса.

Зона меченого реагента

Зону меченого реагента можно задать путем нанесения меченого антитела к вирусу А гриппа на зону, созданную на матриксе, причем таким образом, чтобы меченое антитело сохраняло свою подвижность. Эта зона может быть сформирована до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя из зоны подачи проявителя. Эта зона может быть сформирована путем нанесения меченного ферментом реагента на матрикс или посредством ламинирования водопоглощающей подложки, содержащей меченный ферментом реагент, или путем включения меченного ферментом реагента в часть или весь матрикс, который плотно контактирует с подложкой. В качестве водопоглощающей подложки может быть использована подложка, которую используют для зоны нанесения образца (описана ниже).

По крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению, и предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению. Помимо меченого антитела к вирусу А гриппа могут быть использованы его фрагменты, как и в случае описанного выше антитела в зоне детектирования.

Меченое антитело к вирусу А гриппа можно получить путем связывания антитела с меткой. Примеры меток включают ферменты, коллоидные металлические частицы, окрашенные латексные частицы, люминесцентные соединения, флуоресцентные соединения и пр. В качестве фермента могут быть использованы различные ферменты, используемые в иммунологических исследованиях (иммуноферментных анализах, EIA). Примеры ферментов включают щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-D-галактозидазу и др. Примеры коллоидных металлических частиц включают коллоидное золото, коллоидный селен и др.

Метку и антитело к вирусу А гриппа можно соединить известными способами, используя ковалентную или нековалентную связь. Примеры способов связывания включают глутаральдегидный метод, периодатный метод, малеимидный метод, пиридилдисульфидный метод, а также способы, в которых используют различные сшивающие агенты (см., например, "PROTEIN, NUCLEIC АСID AND ENZYME" («Белок, нуклеиновая кислота и фермент»), Extra Edition (дополнительный выпуск), т.31, стр.37-45 (1985)). В способах, в которых применяют сшивающий агент, могут быть использованы, например, N-сукцинимидил-4-малеимид-масляная кислота (GMBS), N-сукцинимидил-6-малеимид-гексановая кислота, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновая кислота и другие аналогичные соединения. В способах, в которых применяют ковалентное связывание, могут быть использованы функциональные группы антитела. Альтернативно, меченое антитело к вирусу А гриппа можно получить описанными выше способами связывания после введения функциональной группы, такой, как тиольная группа, амино группа, карбоксильная группа, гидроксильная группа и др. В способах, основанных на нековалентном связывании, может быть использована физическая адсорбция и др.

В тех случаях, когда вирус типа В гриппа определяют одновременно с детектированием вируса типа А гриппа, как было указано выше, меченое антитело к вирусу В гриппа вводят в зону меченого реагента для подготовки устройства. Меченое антитело к вирусу А гриппа и меченое антитело к вирусу В гриппа, содержащиеся в зоне меченого реагента, могут находиться либо в матриксе, либо в водопоглощающей подложке, либо они могут содержаться и в матриксе, и в водопоглощающей подложке. В случае одновременного определения вируса А гриппа и вируса В гриппа, в связи с тем, что используют большие количества меченых реагентов, для измерений с высокой чувствительностью меченные ферментом реагенты индивидуально или в комбинации полезно вводить и в матрикс, и в подложку. Несмотря на то, что количество меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от ожидаемого количества изучаемого вещества в образце, обычно оно составляет от примерно 0.01 мкг до 5 мкг в расчете на сухой вес. При введении меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа в зону меченного ферментом реагента, их можно использовать вместе со стабилизатором, агентом, регулирующим солюбилизацию, и пр.

Зона нанесения образца

Зону нанесения образца можно задать на матриксе после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя, без введения реагента или сходного вещества. Зону нанесения образца также можно задать в: 1) заранее заданной области (месте) после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны меченного ферментом реагента по направлению потока проявителя, 2) заранее заданной области (месте) после зоны меченого реагента и до зоны детектирования по направлению потока проявителя, или 3) заранее заданном месте зоны меченого реагента. В устройстве, в котором зону нанесения образца формируют в зоне меченного ферментом реагента, предпочтительно вводить водопоглощающую подложку, содержащую ферментную метку для эффективного проведения исследования, как было опи