Способ определения содержания йода в биосубстратах организмов

Способ определения содержания йода в биосубстратах организмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биологических и медицинских исследований, в частности к способам определения содержания йода в биосубстратах организмов, преимущественно человека или животного, и может быть использовано при исследовании йодного обмена в названных организмах.

Известен способ определения йода в йодсодержащих органических веществах, заключающийся в подготовке пробы из исследуемого органического вещества и в определении количества йода в ней (RU 2163377, G01N 27/48, опубл. 2001.02.20). Подготовку пробы осуществляют следующим образом: навеску исследуемого вещества смачивают раствором карбоната калия, прокаливают ее до полного озоления, смешивают полученную золу с водой и добавляют азотную кислоту и метанол. А для определения количества йода полученную пробу помещают в электрохимическую ячейку, осаждают ионы йода на ртутную поверхность электрода электрохимической ячейки при положительном потенциале на этом электроде, измеряют вольтамперную зависимость при изменении потенциала на электроде с ртутной поверхностью к нулевому значению, а о количестве йода судят по результатам измерений вольтамперной зависимости. Недостатком способа является 20-60% потерь йода в биологических субстратах при предварительной термической обработке образцов (Покровский А.А., Конь И.Я.. Ширина Л.И., Справочник диетолога / Под ред. Покровского А.А. - М.: Медгиз, 1981. С.96-98), а также значительное время измерений, так как измерение концентрации йода в одной пробе занимает 15-20 мин.

Известен способ вольтамперометрического измерения концентрации йода, основанный на предварительном нанесении металлической ртути на поверхность твердого электрода в виде тонкой пленки и последующем использовании этого электрода для электрохимического определения йода (RU 2238551, G01N 27/42, опубл. 2004.10.22). Способ позволяет измерять концентрацию йода в различных объектах с высокой точностью, сократить время анализа пробы и обеспечить экспрессность измерений. Однако способ не исключает работу с высокотоксичной металлической ртутью.

Известен способ определения содержания йода преимущественно в пищевых продуктах, продовольственном сырье и биологически активных добавках к пище (Методические указания. Методы контроля. Химические факторы. Вольтамперометрическое определение йода в пищевых продуктах. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ, № МУК 4.1.1187-03 от 26.01.03). Метод включает следующие этапы: отбор проб, подготовку проб для анализа способом сухой минерализации, разложение органических веществ путем сжигания пробы сырья или продукта в электропечи при контролируемой температуре, подготовку активного микротонкого слоя ртути на поверхности рабочего электрода или использование стационарного ртутного электрода. Количественное определение йода в виде йодида проводят инверсионным вольтамперометрическим методом путем регистрации величин максимальных катодных токов электрорастворения накопленной ртутно-йодидной соли на поверхности предварительно созданной электрохимическим концентрированием микротонкого слоя металлической ртути на рабочем электроде или на стационарном ртутном электроде в атмосфере инертного газа. Наличие сигнала при значениях потенциала от минус 190 до минус 280 мВ свидетельствует о наличии йодида. Высоты пиков на вольтамперограмме пропорциональны массовой концентрации йодидов-ионов в растворе.

Недостатками указанного способа определения йода являются 20 - 60% потерь йода в биологических субстратах при предварительной термической обработке образцов, а также работа с высокотоксичной металлической ртутью.

В основу изобретения положена техническая задача, заключающаяся в повышении точности исследования при проведении диагностических операций с отсутствием потерь йода в образцах при предварительной их подготовке к исследованию.

Указанная задача решается тем, что в способе определения содержания йода в биосубстратах организмов, преимущественно человека или животного, включающем забор образца биосубстрата, фиксацию и подготовку его для исследования и установление содержания в нем йода, согласно изобретению фиксацию образца осуществляют замораживанием при температуре -18…-20°С, перед исследованием образцы толщиной не более 1 мм подсушивают при температуре 100°С в течение 30…45 мин, затем на поверхность образца ионным напылением наносят платину толщиной слоя до 1 микрона, а исследование осуществляют микрорентгеноспектральным методом на спектрометре волновой дисперсии, при этом на образец направляют пучок первичных электронов и определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения, аналогичным образом определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения в стандартном образце с известным содержанием йода, а на основе сравнения количества квантов в образцах биосубстрата и стандартного вычисляют действительное содержание йода в биосубстратах организмов.

Проведение подготовки образца путем фиксации его замораживанием при температуре -18…- 20°С, подсушивания при температуре 100°С в течение 30…45 мин исключает сжигание образцов, что позволяет избежать потерь йода, т.к. температура плавления йода 113°С, и использовать непосредственно образцы биосубстратов для дальнейшего исследования.

Нанесение на поверхность подсушенного образца ионного напыления платины до 1 микрона обеспечивает возможность стекания заряда с нетокопроводящего материала, а размер толщины образца не более 1 мм обеспечивает ускоренное и равномерное высушивание образца.

Осуществление исследования микрорентгеноспектральным методом спектрометром волновой дисперсии на сканирующем электронном микроскопе путем сравнения количества выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения в образцах биосубстрата и стандартного вычисляют действительное содержание йода в биосубстратах организмов, что повышает точность исследования при диагностике. Повышенная точность диагностики необходима для правильного выбора лечения после тщательного обследования пациентов при всем разнообразии методов лечения.

С учетом того, что в последние десятилетия в структуре эндокринных заболеваний неуклонно прогрессирует патология щитовидной железы, которая большей частью сопровождается серьезными отклонениями в функционировании репродуктивной системы, а на основе предлагаемого способа определения содержания йода возможно проведение более точной коррекции тиреоидного статуса при выявлении патологии щитовидной железы.

Способ осуществляют следующим образом.

Отобранные образцы биосубстрата замораживают в холодильной камере при температуре -18…-20°С. Перед исследованием образцы разрезают на элементы толщиной не более 1 мм, которые подсушивают при температуре 100°С в течение 30…45 мин, а затем на поверхность образца ионным напылением наносят платину толщиной слоя до 1 микрона.

Далее образец помещают в колонну электронного микроскопа и анализатором волновой дисперсии определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения. Аналогичным образом определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения в стандартном образце с известным содержанием йода, а на основе сравнения количества квантов в образцах биосубстрата и стандартного вычисляют действительное содержание йода в биосубстратах организмов.

Пример осуществления способа

В лаборатории электронной микроскопии был проведен количественный рентгеноспектральный микроанализ образцов ткани эндометрия в различные фазы менструального цикла, а также при гиперпластических процессах эндометрия (полипах эндометрия и гиперпластических процессах эндометрия - простая, типичная, сложная гиперплазия без атипии). Забор образцов ткани эндометрия проводился во время раздельного диагностического выскабливания при патологии эндометрия на 22-24 день менструального цикла, а также путем аспирационных биопсий эндометрия у пациенток с бесплодием или в рамках диспансерного наблюдения больных с хроническим эндометритом вне обострения. Образцы ткани эндометрия были помещены в холодильную камеру, установлена температура -18°С. Через некоторое время элементы образцов толщиной 0,8 мм подсушивали при температуре 80°С в течение 45 минут, а затем на их поверхность ионным напылением нанесли платину толщиной слоя до 1 микрона.

Далее образец поместили в колонну микроскопа, откачали воздух до вакуума 10^-5-10^-6 степени, дали накал на катод и ускоряющее напряжение. Начинается электронная эмиссия. Узкий пучок электронов, сформированный электромагнитными линзами, попадает на поверхность образца, проходит внутрь ткани образца, взаимодействуя с атомами и электронами. В результате взаимодействия выделяется с поверхности образца характеристическое рентгеновское излучение, соответствующее длине волны йода, которое фиксируют волновым спектрометром, подсчитывая при этом количество квантов рентгеновского излучения за определенный промежуток времени (например, 10 или 15 с). За такой же промежуток времени (10 или 15 с соответственно) в тех же условиях подсчитывают количество квантов рентгеновского излучения на стандартном образце с известным содержанием йода. После подсчета количества квантов рентгеновского излучения на испытуемом и на стандартном образцах на основе пропорции «количество квантов - % йода» определяют действительное содержание йода в образце.

Результаты исследования приведены в таблице. Содержание йода в щитовидной железе, эндометрии и миометрии

	Миометрий (n=18) (1)	Эндометрий (n=14) (2)	Щитовидная железа (n=11) (3)
Масс % йода (10-2)	4,1±0,6	3,7±0,5*	29,4±7,4**,***
* (1):(2) р<0,05
** (3):(1) р<0,05
*** (3):(2) р<0,05

Повышение точности исследования можно подтвердить сопоставлением данных, полученных по предлагаемому способу, с данными, приведенными в известных источниках. По известным исследованиям щитовидная железа отличается большим содержанием йода (~ в 100 раз) по сравнению с другими органами. Наряду со сложным определением обменного баланса, заключающимся в сопоставлении получаемого организмом извне йода и расходовании последнего, чрезвычайно важно знание равнодействующей йодного обмена, совершающегося в организме. В известном способе (Капланский С. БМЭ / Под ред. Бакулева А.Н. - М.: Медгиз, 1959. - Т.11 - С.1072-1077) указано, что соотношение среднего содержания йода в щитовидной железе к концентрации йода в печени, скелетных и сердечной мышцах, коже и яичниках составляло 35 мг % к 100 мкг %,; в почках и костной ткани - соответственно к 30 мкг % (при определении в золе исследуемого материала); выделившийся йод оттитровывали в кислой среде 0,1 н. или 0,01 н. р-ром тиосульфата натрия в присутствии индикатора (крахмального клейстера), т.е. содержание йода в щитовидной железе по отношению к содержанию йода в других биосубстратах составляет порядок 1/100 (см. описание стр.6). Такое соотношение подтверждается данными и в других источниках информации (Л.А.Якобсон. К физиологии и патологии йодного обмена у человека и др.).

В соответствии с предлагаемом способом при количественном рентгеноспектральном микроанализе соотношение среднего содержания йода в щитовидной железе к концентрации йода в других биосубстратах, например, миометрии и эндометрии, составило 29,4·10^-2 масс % йода к 3,9·10^-2 масс % йода соответственно, т.е. составляет порядок 1/10 и дает действительную картину о содержании йода в исследуемом биосубстрате какого-либо органа.

Эти данные свидетельствуют об уменьшении потерь йода в биосубстратах организмов, подготовленных предлагаемым способом и исследуемых микрорентгеноспектральным методом спектрометром волновой дисперсии. Количественные характеристики, по которым определяется содержание йода, - это количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения в стандартном и исследуемом образцах, которые подсчитывают. В предлагаемом способе в качестве приемника квантов применяется проточный пропорциональный счетчик излучения двухкамерного типа, продуваемый аргон-метановой смесью.

Сравнивая количество квантов характеристического рентгеновского излучения йода, входящего в состав исследуемого биосубстрата, с количеством квантов, полученных от стандартного материала с известным содержанием йода за одинаковый промежуток времени, можно составить пропорцию и подсчитать содержание йода в биосубстрате:

В процессе работы микроскопа из исследуемого материала выделяется два вида рентгеновского излучения:

первый - он имеет дискретный характер - кванты, количество которых можно подсчитать за определенный промежуток времени;

второй - непрерывный вид энергии определенной длины волны - имеет форму пиков, высота которых зависит от содержания элемента в данном месте исследуемого материала.

Примеры этих спектров в виде пиков приведены на чертеже: а) спектр, снятый со стандартного материала с известным содержание йода; б) спектр, снятый с эндометрия; в) спектр, снятый со щитовидной железы. Изображения обозначают : первый пик слева - фоновый; второй пик слева - соответствует содержанию йода в исследуемом материале.

Предлагаемый способ обеспечивает получение более точных результатов измерения йода в биосубстратах организмов. Заявителем разработан принципиально новый способ определения содержания йода в биосубстратах организмов, преимущество которого перед известными способами определения содержания йода в образцах заключается в сведении к минимуму, а в некоторых случаях к исключению потерь йода при предварительной подготовке образцов к исследованию.

Способ определения содержания йода в биосубстратах организмов, преимущественно человека или животного, включающий забор образца биосубстрата, фиксацию и подготовку его для исследования и установление содержания в нем йода, отличающийся тем, что фиксацию образца осуществляют замораживанием при температуре (-18)…(-20)°С, перед исследованием образцы толщиной не более 1 мм подсушивают при температуре 100°С в течение 30…45 мин, далее на поверхность образца ионным напылением наносят платину толщиной слоя до 1 мкм, а исследование осуществляют микрорентгеноспектральным методом спектрометром волновой дисперсии, при этом на образец направляют пучок первичных электронов и определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения, аналогичным образом определяют количество выделенных квантов характеристического рентгеновского излучения в стандартном образце с известным содержанием йода, а на основе сравнения количества квантов в образцах биосубстрата и стандартного вычисляют действительное содержание йода в биосубстратах организмов.