Способ определения иммунных комплексов у белых мышей в условиях стресса

Способ определения иммунных комплексов у белых мышей в условиях стресса

Реферат

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в лабораторной диагностике.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) являются важным компонентом системы гуморального иммунитета. В состав ЦИК входят антигены и антитела к ним, компоненты системы комплемента и антиглобулиновые факторы. В норме ЦИК быстро удаляются из крови и выводятся из организма.

Известен способ определения циркулирующих мелких, средних и крупных иммунных комплексов в плазме крови, основанный на преципитации комплексов антиген-антитело в полиэтиленгликоле различной концентрации с последующим фотометрическим определением плотности преципитата (Иммунологические методы исследования. - М.: Изд-во «Мир», 1988, с.489-503).

Недостатком способа является то, что с помощью него невозможно определить концентрацию иммунных комплексов, осажденных в сосудах и тканях паренхиматозных органов. При развитии иммунно-опосредованного патологического процесса иммунные комплексы (ИК) длительно циркулируют в кровотоке, происходит их фиксация на стенках кровеносных сосудов, что приводит к функциональным и морфологическим повреждениям внутренних органов и тканей. Поэтому важной проблемой диагностики иммунокомплексной патологии являются не только мониторинг циркулирующих иммунных комплексов в периферической крови, но, в большей степени, возможность исследования количества иммунных комплексов в тканях, что делает возможным изучение патогенетических механизмов развития иммунокомплексных заболеваний, определение тропности ИК к различным тканям организма. Диагностическое значение имеет определение тканевых ИК разной молекулярной массы (низкой, средней, высокой).

Технический результат заключается в совершенствовании методов лабораторной диагностики иммуноопосредованных заболеваний, а также расширение функциональных возможностей способа.

Технический результат достигается тем, что в способе определения иммунных комплексов у белых мышей в условиях стресса путем центрифугирования биологической ткани и последующим определением в ней иммунных комплексов методом преципитации комплексов антиген-антитело в полиэтиленгликоле при помощи фотометрического измерения оптической плотности преципитата, что на первом этапе выделяют паренхиматозный орган для исследования, на втором этапе готовят экстракт ткани паренхиматозного органа путем его гомогенезации перед центрифугированием, на третьем этапе в полученном экстракте определяют концентрацию мелких, средних и крупных иммунных комплексов.

Способ осуществляют следующим образом. На первом этапе под эфирным наркозом животных декапитируют, после чего извлекают головной мозг, печень и тимус. Ткани промывают в охлажденном 0,9% физиологическом растворе хлористого натрия, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают на аналитических весах. На втором этапе для получения гомогенатов навеску биологических тканей растирают со стеклом в фарфоровых ступках на холоде при температуре 10-12 градусов Цельсия. Для экстрагирования используют 0,05 М Трис-НС1-буфер (рН 7,4) в соотношении 1:8 по объему. Полученные гомогенаты центрифугируют при 1500 оборотах в минуту в течение 10-12 минут. На заключительном этапе надосадочную жидкость забирают микродозатором. Определение концентрации иммунных комплексов (ИК) разной молекулярной массы проводят следующим образом: исследуемые экстракты каждого вида биологической ткани разводят 0,1 М боратным буфером (рН 8,4) в соотношении 1:24. К разведенному экстракту, разделенному на 3 части, добавляют равные объемы 2,5%; 4% или 5,5% раствора полиэтиленгликоля для определения крупных, средних и мелких иммунных комплексов соответственно. Смеси выдерживают при температуре 20-22 градуса Цельсия в течение 1 часа. Концентрацию иммунных комплексов определяют на фотометре при длине волны 540 нм и выражают в единицах оптической плотности.

Апробация проведена на 76 половозрелых белых нелинейных мышах обоего пола, из которых половину составляли интактные животные, а у половины воспроизводили иммобилизационный стресс. Установлено, что последовательное выделение, гомогенизация, экстракция и фотометрия экстракта тканей паренхиматозных органов (головного мозга, печени и тимуса) позволяет достоверно определять концентрацию иммунных комплексов в этих тканях.

В качестве примера осуществления способа с получением конкретных значений концентрации мелких, средних и крупных иммунных комплексов приводим значения исследуемых показателей, полученных при проведении экспериментальных исследований на интактных и стрессированных животных табл.1.

Таблица 1
№ п/п	Исследуемые иммунные комплексы	Интактные животные (n=10)	Животные, находившиеся в течение 5 суток в состоянии иммобилизационного стресса (n=10)
1		Тимус	4,0±0,4	Тимус	6,0±0,7*
	мелкие	Печень	5,1±0,5	Печень	7,2±1,1*
		Головной мозг	2,2±0,3	Головной мозг	1,9±0,3
2		Тимус	2,0±0,4	Тимус	3,2±0,3*
	средние	Печень	3,1±0,4	Печень	4,1±0,4*
		Головной мозг	1,01±0,2	Головной мозг	1,3±0,2
3		Тимус	0,9±0,2	Тимус	1,1±0,4
	крупные	Печень	1,3±0,1	Печень	1,4±0,5
		Головной мозг	0,6±0,2	Головной мозг	0,7±0,1
Примечание: * - различия при сравнении с группой интактных животных достоверны при р<0,05.

Предлагаемый способ позволяет совершенствовать метод лабораторной диагностики иммунноопосредованных заболеваний. Кроме того, раширяются функциональные возможности способа за счет возможности использования его для определения концентрации иммунных комплексов не только в крови, но и в тканях паренхиматозных органов.

Способ определения иммунных комплексов у белых мышей в условиях стресса путем центрифугирования биологической ткани и последующего определения в ней иммунных комплексов методом преципитации комплексов антиген-антитело в полиэтиленгликоле при помощи фотометрического измерения оптической плотности преципитата, отличающийся тем, что на первом этапе выделяют паренхиматозный орган для исследования, на втором этапе готовят экстракт ткани паренхиматозного органа путем его гомогенизации перед центрифугированием, на третьем этапе в полученном экстракте определяют концентрацию мелких, средних и крупных иммунных комплексов.