Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул

Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии, преимущественно полимерной нанотехнологии.

В число значимых объектов полимерной нанотехнологии входят полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК). ПНМК обладают рядом интересных свойств. Из них наиболее ярким является полупроницаемость полиэлектролитной оболочки капсул - проницаемость для низкомолекулярных соединений и их мелких агрегатов и непроницаемость для высокомолекулярных веществ и крупных частиц (Antipov A.A., Sukhorukov G.В. // Advances in Colloid and Interface Science. 2004. V.111. №1-2. P.49-61.; Antipov A.A., Viera, E., et al. (2002). Controlled and sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. WO 0217888).

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о широких возможностях использования ПНМК в ряде областей техники, химии, физики, биотехнологии и фармакологии (Möhwald H., Donath E. and Sukhorukov G.В. In book: Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials (Ed. By G.Decher and J.B.Schlenoff). Wiley-VCH, 2002, P.363-392.; Fery A. Mohwald H., Sukhorukov G.В. // Progr. Polymer. Sci. 2005. V.30(8-9). P.885).

Показана возможность использования ПНМК для получения пролонгированных лекарственных средств (Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B., Mohwald H. (2002). A novel method for encapsulation of poorly water-soluble drugs: precipitation in polyelectrolyte multilayer shells. // Intern. J. Pharmaceutics, 242 (1-2):219-223). Полученные результаты свидетельствуют о преимуществе такого подхода по сравнению, например, с использованием микрогелей, мицелл или липосомного капсулирования. В отличие от последнего методом послойного полиэлектролитного капсулирования (ППК) формируется пространственно организованная надмолекулярная структура, устойчивая к действию кислорода и других окислителей. Привлекательность метода ППК для получения переносчиков и контейнеров биологически активных веществ и соответственно пролонгированных лекарственных средств, возможно, с адресной доставкой заключается и в его простоте. В самое последнее время с использованием метода послойного полиэлектролитного капсулирования начата разработка новых методов ферментативного определения концентраций анализируемого низкомолекулярного вещества в сложной биологической жидкости. Это направление исследований основано на работах по включению ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы (ПЭ-микрокапсулы).

В настоящее время имеется ряд подходов к загрузке белков в полиэлектролитные микрочастицы. Первый из них был предложен в 1999 году (Бобрешова М.Е., Сабурова Е.А. и др. // Биофизика. 2000. Т.44. №5. С.813-820). Этот способ включает в себя стадию образования микроагрегатов белка в процессе его высаливания и последующую стадию поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на эти микроагрегаты. Включение фермента в полиэлектролитную микрочастицу составляло ~ 70% от количества агрегатов белка, но его активность была заметно снижена и зависела от ряда факторов. Основной недостаток этого метода состоит в том, что содержащие фермент микрочастицы имеют неправильную форму и их размер невозможно проконтролировать.

Известен способ включения белка непосредственно в полые ПНМК, в оболочках которых специально создавались «поры» (оболочка разрыхлялась) добавлением органического растворителя, изменением солевого состава и pH среды для проникновения белка сквозь оболочку в капсулу. Количество включенного таким способом в капсулу белка составляло менее 10% и при этом его большая часть сосредотачивалась в оболочке микрокапсулы (Lvov Y., Antipov A.A., Mamedov A. et al. // Nanoletters 2001. V.1. №3. P.125-128).

Наибольшего внимания заслуживает предложенный недавно и принятый нами в качестве прототипа способ включения белков в полиэлектролитную микрокапсулу, основными стадиями которого являются предварительное формирование ядра капсулы - «кора», в виде микросферолита CaCO₃ с включенным в нее белком, последующей за этим стадией послойной сорбции поли электролита на такой кор. Окончательной стадией капсулирования белка является удаление CaCO₃ из капсулы добавлением ЭДТА или другого хелатного агента. Этим методом может включаться более 60% от добавленного в раствор белка. Подробно метод изложен в работе A.Petrov, D.Volodkin, G.Sukhorukov. Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation: A tool for protein encapsulation. // Biotechnol. Progr., 2005, v.27, p.918-925.

В этой работе предполагается, что полиэлектролитные оболочки, полученные описанным выше способом, инертны по отношению к заключенным в них белкам, в том числе ферментам.

Однако наши исследования показали, что многие полиэлектролиты вызывают инактивацию ферментов, которые по своей природе являются белком. Из полученных нами данных следует, что активность инкапсулированных белков в существенной степени определяется природой полиэлектролитов, составляющих оболочку, и может уменьшаться вплоть до полной инактивации.

Таким образом, метод принятый нами в качестве прототипа в том виде, как он представлен авторами, имеет серьезный недостаток, который состоит в том, что метод не предусматривает влияние полиэлектролитной оболочки на функции белка.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в обеспечении возможности сохранения активности белка, в частном случае фермента, при его инкапсулировании в полиэлектролитную оболочку.

Поставленная задача решена тем, что предложен способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул, включающий получение составных микросферолитов карбонатов щелочноземельных металлов и инкапсулируемых белков (ферментов), формирование капсул путем поочередной адсорбции на указанные составные микросферолиты противоположно заряженных полиэлектролитов и удаление указанных карбонатов щелочноземельных металлов из указанных капсул, в котором согласно изобретению предварительно проводят подбор по меньшей мере первой пары полиэлектролитов, поочередно исследуя влияние каждого полиэлектролита в растворе на активность инкапсулируемого белка.

При этом в качестве предпочтительных полиэлектролитов для формирования капсулы для определенного, заранее заданного белка отбирают полиэлектролиты, не влияющие в концентрации, оптимальной для формирования указанной капсулы, на активность этого белка либо имеющие эффективность ингибирования по меньшей мере одной функции белка до желаемого предела.

В частном случае осуществления способа тестирование полиэлектролита осуществляют при смешивании раствора белка с раствором полиэлектролита.

В частном случае осуществления способа в качестве белка берут фермент.

Влияние полиэлектролита на ингибирование фермента определяют при концентрации этого полиэлектролита, оптимальной для формирования указанной капсулы, обычно 1,5-3 мг/мл.

Для формирования капсулы берут полиэлектролиты как биодеградабельные, так и не способные к биодеградации поликатионы и полианионы, преимущественно линейной структуры.

Для формирования микросферолита (кора) преимущественно берут CaCO₃.

Карбонаты щелочных металлов из указанных капсул удаляют с помощью ЭДТА или другого хелатного агента или подкислением среды.

Сущность изобретения заключается в том, что предлагается формировать оболочку капсулы лишь из селективно подобранных полиэлектролитов. Такой подбор особенно важен для формирования первого слоя оболочки, поскольку он непосредственно контактирует с инкапсулированнным белком. Это обусловлено тем, что, как было нами экспериментально установлено, многие полиэлектролиты при взаимодействии с ферментом способны его инактивировать. Поэтому технология получения ПНМК, содержащих белки и в частном случае ферменты, должна включать в себя контроль за ингибиторным действием полиэлектролитов, используемых для конструирования оболочки капсулы.

Неочевидность предложенного изобретения состоит в том, что прежде чем осуществлять сложную процедуру формирования капсулы, в результате которой можно получить капсулу с неактивным белком, нами предложено предварительно проверять влияние каждого в отдельности полиэлектролита на функциональную активность инкапсулируемого белка.

Сущность изобретения подтверждена тем, что был исследован большой набор полиэлектролитов как биодеградабильных, так и небиодеградабильных в отличие от прототипа, в котором были получены капсулы, составленные лишь из небиодеградабильной пары - полиаллиламина (ПАА) и полистиролсульфоната (ПСС), а точнее капсулы с оболочкой состава (ПАА/ПСС)₅.

Нами была изучена способность к инактивации белков для 8 различных полиэлектролитов, 4 биодеградабильных и 4 небиодеградабильных. Такие исследования по инактивации проводились преимущественно на двух ферментах: уреаза и лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Были получены зависимости активности этих ферментов от концентрации полиэлектролитов.

Анализ этих зависимостей привел к выводу, что наиболее простым критерием выбора полиэлектролитов для инкапсулирования является величина активности фермента при добавлении полиэлектролита в среду с концентрацией 1,5-3,0 мг/мл, Потеря активности фермента при этом не должна превышать 50% от исходного значения.

Для лучшего понимания изобретения ниже приведены примеры конкретного осуществления предлагаемого способа со ссылками на прилагаемые чертежи, где

На фиг.1 показана зависимость активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) от концентрации биодеградабельных полиэлектролитов: декстрансульфат (ДС), полифосфат (ПФ), полиуридилат (ПУ) и полиаденилат (ПА). Реакционная смесь для определения активности ЛДГ: пируват 1 мМ; NADH 0,2 мМ; ЛДГ 0,5 мкг/мл; 0,05 М трис-HCl буфер pH 6,2.

На фиг.2 показана зависимость активности ЛДГ от концентрации небиодеградабельных полиэлектролитов: зависимость активности ЛДГ от концентрации полиэлектролитов - полистиролсульфонат (ПСС), полиаллиламин (ПАА), полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА), полиметакрилат (ПМ). Реакционная смесь для определения активности ЛДГ: пируват 1 мМ; NADH 0,2 мМ; ЛДГ 0,5 мкг/мл; 0,05 М трис-HCl буфер pH 6,2.

На фиг.3 показана зависимость активности уреазы от концентрации небиодеградабельных полиэлектролитов: полистиролсульфонат (ПСС), полиаллиламин (ПАА) и полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА). Условия определения активности уреазы: уреаза 0,5 мкг/мл, мочевина 125 мМ, бромкрезол фиолетовый 0,015 мМ, pH 6,2.

На фиг.4 приведена диаграмма, иллюстрирующая активность уреазы, заключенной в микрокапсулы, образованные из разных небиодеградабельных полиэлектролитов. Состав капсул: ПСС(ПСС/ПАА)₃ - 1, ПСС(ПСС/ПДАДМА)₃ - 2.

На фиг.5 приведена диаграмма, иллюстрирующая активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), заключенной в микрокапсулы, образованные из разных биодеградабельных и небиодеградабельных полиэлектролитов. Состав капсул: (ПАА/ПСС)₃ - 1; (ПДАДМА/ПСС)₃ - 2; (ПАА/ДС)(ПАА/ПСС)₂ - 3; (ПАА/ДС)₂(ПАА/ПСС) - 4, (ПАА/ДС)₃ - 5.

Примеры осуществления изобретения

Для подтверждения возможности осуществления предлагаемого изобретения использовали следующие реактивы:

- лактатдегидрогеназу (Е.С.1.1.1.27) (ЛДГ) из скелетных мышц свиньи (изоформа M₄) выделяли согласно методу, используемому в работе (Сабурова Е.А., Хечинашвили Н.Н. и Елфимова Л.И. Полиол-белковые взаимодействия. Микрокалориметрические исследования денатурации лактатдегидрогеназы. Молек. биол. 1996, т.30. С.1219-1228);

- уреазу (Е.С.3.5.1.5, jack bean) использовали фирмы Fluka, №94285 с активностью 97,0 U/mg;

- полистиролсульфонат натрия (ПСС, 70 кДа), полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМА, 100-200 кДа) и полиаллиламин гидрохлорид (ПАА, 70 кДа) фирмы Aldrich (Germany);

- полиметакрилат натрия, полифосфат натрия декстрансульфат (ДС, 10 кДа) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) фирмы Sigma (Germany);

- хлорид кальция (CaCl₂·2H₂O), карбонат и хлорид натрия фирмы Реахим (Россия).

Пример 1. Подбор полиэлектролитов для получения микродиагностикума, содержащего фермент

Под микродиагностикумом здесь и далее понимается инкапсулированный в полиэлектролитную нано- или микроразмера капсулу фермент, пригодный для анализа в многокомпонентной биологически активной среде, какой является, например, кровь, моча, спинномозговая жидкость и т.д., низкомолекулярного вещества - субстрата, ингибитора или активатора инкапсулированного фермента.

1.1. Подбор полиэлектролитов для микродиагностикума, содержащего в качестве фермента лактатдегидрогеназу (ЛДГ)

Подбор полиэлектролитов для получения микродиагностикума осуществляли исходя из их инактивирующего действия на фермент.

Для этого определяли активность свободной лактатдегидрогеназы в присутствии полиэлектролита по реакции восстановления пирувата в присутствии NADH по изменению оптической плотности в полосе поглощения NADH при 340 нм как описано в справочной литературе (Passonneau J.V., Lowry O.H. In: Methods of Enzymatic Analysis (Edited by Bergmeyer H.U.), V.3, N.Y., Acad. Press, 1974. P.1452).

Для определения активности ЛДГ концентрацию ЛДГ в свободном (растворенном) состоянии измеряли спектрофотометрически, используя известные для ЛДГ молярные коэффициенты экстинкции: ε_{280 HM} ^1мг/мл=1,29 согласно расчетам, используя программу (http://cn.expasy.org/sprot/).

При изучении степени инактивации ЛДГ полиэлектролитом в реакционную смесь добавляли необходимое количество полиэлектролита, предварительно растворенного в воде и дотитрованного до pH 6.2.

На фиг.1 показана зависимость активности ЛДГ от концентрации биодеградабельных полиэлектролитов: декстрансульфат (ДС), полифосфат (ПФ), полиуридинилат (ПУ) и полиаденилат (ПА). Реакционная смесь для определения активности ЛДГ: пируват 1 мМ; NADH 0,2 мМ; ЛДГ 0,5 мкг/мл; 0,05 М трис-HCl буфер pH 6,2.

Из приведенных на фиг.1 данных видно, что среди исследованных нами биодеградабельных полиэлектролитов для ЛДГ наиболее сильным ингибитором является полианион полифосфат, хотя концентрация его при 50%-тном ингибировании ЛДГ (12,5 мг/мл) превышает концентрацию полиэлектролита, используемую в процессе приготовления капсул (2,5 мг/мл). Таким образом, все эти биодеградабельные полиэлектролиты являются претендентами для формирования оболочки капсулы, содержащей ЛДГ.

На фиг.2 показана зависимость активности ЛДГ от концентрации небиодеградабельных полиэлектролитов: полистиролсульфонат (ПСС), полиаллиламин (ПАА), полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА), полиметакрилат (ПМ). Реакционная смесь для определения активности ЛДГ: пируват 1 мМ; NADH 0,2 мМ; ЛДГ 0,5 мкг/мл; 0,05 М трис-HCl буфер pH 6,2.

Как видно из фиг.2, среди исследованных нами небиодеградабельных полиэлектролитов для ЛДГ наиболее сильным ингибитором является полианион полистиролсульфонат, концентрация его при 50%-тном ингибировании ЛДГ составляет 5 мкг/мл. Остальные исследованные полиэлектролиты являются допустимыми для приготовления оболочки в указанных пределах их концентраций. Таким образом, все эти небиодеградабельные полиэлектролиты являются претендентами для формирования оболочки капсулы, содержащей ЛДГ, а полистиролсульфонат требует изоляции от прямого контакта с ЛДГ и, следовательно, допустим для использования только во внешних слоях оболочки капсулы.

На фиг.3 показана зависимость активности уреазы от концентрации небиодеградабельных полиэлектролитов: полистиролсульфонат (ПСС), полиаллиламин (ПАА) и полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА). Условия определения активности уреазы: уреаза 0,5 мкг/мл, мочевина 125 мМ, бромкрезол фиолетовый 0,015 мМ, pH 6,2.

Из фиг.3 видно, что для уреазы, в отличие от ЛДГ, поликатион - полиаллиламин, является наиболее сильным ингибитором: 50%-тное ингибирование уреазы происходит при малых концентрациях этого полиэлектролита (доли мкг/мл).

Таким образом, проведенные эксперименты показывают, что при построении полиэлектролитной оболочки белковой ПНМК наилучшими полиэлектролитными парами являются для ЛДГ ПАА/ДС и ПАА/ПСС, для уреазы ПСС/ПАА и ПСС/ПДАДМА в указанной последовательности наслоения. На основе этого нами были сконструированы лактатдегидрогеназные и уреазные микрокапсулы с разным полиэлектролитным составом и числом слоев.

Пример 2. Получение микродиагностикума с использованием биодеградабельных и небиодеградабельных полиэлектролитов с учетом их инактивирующего действия

А) Получение микродиагностикума, содержащего уреазу

К 0,33 М раствору CaCl₂, содержащему 2,0 мг/мл уреазы и интенсивно перемешиваемому на магнитной мешалке, быстро добавляли равный объем 0,33 М раствора Na₂CO₃. Смесь перемешивали в течение 30 с, после чего перемешивание прекращали, а образовавшуюся суспензию выдерживали 15 мин до полного просветления надосадочной жидкости. В результате этой процедуры получали составной микросферолит CaCO₃-уреаза. Этот процесс «созревания» микросферолитов контролировали с помощью светового микроскопа.

Затем надосадочную жидкость декантировали, осадок промывали водой. Количество включенного в сферолит белка - фермента, определяли спектрофотометрически при сравнении абсорбции (λ=280 нм) исходных растворов белка и супернатанта, отобранного при осаждении указанных микросферолитов CaCO₃-уреаза. Содержание белка определяли также по методу Бредфорда (Anal. Bioch. 1976. V.72. P.248-254) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 (λ=595 нм).

Далее на составных микросферолитах CaCO₃-уреаза, используя их как коровые частицы, формировали мультислойные полиэлектролитные микрокапсулы путем поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на коровые частицы.

В качестве полиэлектролитов использовали в качестве полианиона полистиролсульфонат (ПСС) и в качестве поликатиона полиаллиламин (ПАА) или полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА), которые готовили с концентрацией 2 мг/мл в 0,5 М растворе NaCl. Исходя из полученных нами данных по инактивирующему действию полиэлектролитов на ферменты (Пример 1) адсорбцию первого слоя производили, используя неинактивирующий полиэлектролит для уреазы полистиролсульфонат (ПСС) и далее соответственно противоположную ему пару - полиаллиламин (ПАА) или полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА). Число слоев с неинактивирующими полиэлектролитами задавали в каждом случае индивидуально исходя из дополнительных задач.

Затем на завершающей стадии неорганический компонент составного микросферолита CaCO₃ растворяли в ЭДТА.

Формирование микрокапсул проводили с использованием охлажденных (5-10°С) растворов в условиях поддержания нейтральной pH. Для предотвращения агрегации частиц в процессе адсорбции полиэлектролитов суспензию микрочастиц периодически через каждые 5 мин обрабатывали ультразвуком в течение 1-3 с. При этом за агрегацией частиц следили с помощью светового микроскопа. После адсорбции на коровую частицу каждого полиэлектролитного слоя суспензию центрифугировали при 1 тыс. об/мин и осадок тщательно промывали от несвязавшегося полиэлектролита. Процедуру промывки повторяли трижды. Затем после заданного числа послойной адсорбции полиэлектролитов коровую частицу растворяли в 0,2 М растворе ЭДТА при pH 7,5 в течение 12 ч.

На фиг.4 приведена диаграмма, иллюстрирующая активность V_max инкапсулированной уреазы. Состав капсул с уреазой: ПСС (ПСС/ПАА)₃ - 1, ПСС(ПСС/ПДАДМА)₃ - 2. Условия реакции для определения активности уреазы такие же, как в описании к фиг.3.

Титр капсул, содержащих уреазу, составлял 1,2*10⁶ капсул/мл.

Б) Получение микродиагностикума, содержащего лактатдегидрогеназу

Получение микрокапсул, загруженных ЛДГ, осуществляли так же, как описано в части А этого примера для уреазы, за исключением выбора противоположно заряженных полиэлектролитных пар. Принципиальным различием было включение в некоторые слои оболочки капсулы в качестве полианиона неинактивирующего полиэлектролита - декстрансульфата. Были изучены микродиагностикумы с включенным ЛДГ, содержащие оболочки, в состав которых входили как биодеградабельные, так и небиодеградабельные полиэлектролиты, имеющие следующий состав: (ПАА/ПСС)₃, (ПАА/ДС)(ПАА/ПСС)₂, (ПАА/ДС)₂(ПАА/ПСС), (ПАА/ДС)₃, а также содержащие поликатион ПДАДМА вместо ПАА: (ПДАДМА/ПСС)₃.

На фиг.5 представлена диаграмма, иллюстрирующая активность V_max инкапсулированной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), заключенной в микрокапсулы, полученные, как описано соответственно в части Б примера 2, из разных поликатионов и разных полианионов.

Состав капсул с ЛДГ: (ПАА/ПСС)₃ - 1; (ПДАДМА/ПСС)₃ - 2; (ПАА/ДС)(ПАА/ПСС)₂ - 3; (ПАА/ДС)₂(ПАА/ПСС) - 4, (ПАА/ДС)₃ - 5.

Условия определения активности ЛДГ: пируват 1 мМ, NADH 0,2 мМ, 0,05 М фосфатный буфер pH 6,2. Титр капсул, содержащих ЛДГ, составлял 1,2*10⁶ капсул/мл.

Среди разных полиэлектролитных оболочек наиболее оптимальной для функционирования микродиагностикума с ЛДГ оказалась оболочка (ПАА/ДС)₂ПАА/ПСС.

Такой цикл аналитических исследований можно выполнить и на других микрокапсулах с любой активностью инкапсулированного фермента, которую чувствуют существующие в настоящее время методы.

1. Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул, включающий получение составных микросферолитов карбонатов щелочноземельных металлов и инкапсулируемого белка, формирование капсул путем поочередной адсорбции на указанные составные микросферолиты противоположно заряженных полиэлектролитов, и удаление указанных карбонатов щелочноземельных металлов из указанных капсул, отличающийся тем, что предварительно проводят подбор, по меньшей мере, первой пары непосредственно контактирующих с инкапсулируемым белком полиэлектролитов, поочередно исследуя влияние каждого полиэлектролита в растворе на активность инкапсулируемого белка, и отбирают полиэлектролиты, не влияющие в концентрации оптимальной для формирования указанной капсулы на активность этого белка, либо имеющие эффективность ингибирования, по меньшей мере, одной функции белка до желаемого предела.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в частном случае в качестве белка берут фермент, при этом потеря активности фермента не должна превышать 50% от исходного значения.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что составные микросферолиты карбонатов щелочноземельных металлов и инкапсулируемых белков получают преимущественно путем копреципитации.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что карбонаты щелочных металлов из указанных капсул удаляют с помощью ЭДТА или другого хелатного агента или подкислением среды.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для формирования капсулы берут в качестве полиэлектролитов как биодеградабельные, так и неспособные к биодеградации поликатионы и полианионы, преимущественно линейной структуры.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют контроль активности белка после адсорбции желаемого количества слоев полиэлектролитов.