Способ культивирования клеток без компонентов животного происхождения

Способ культивирования клеток без компонентов животного происхождения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток животных, таких как клетки млекопитающих, в частности, культивирования диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как клетки млекопитающих или предпочтительно человека, без экзогенных компонентов первичного животного происхождения, и к клеточной культуральной среде, по существу не содержащей экзогенные компоненты первичного животного происхождения, подходящей для осуществления указанного способа. В частности, изобретение относится к клеточной культуральной среде, которая содержит по меньшей мере один, более предпочтительно несколько экзогенных факторов роста неживотного происхождения. Такая среда особенно подходит для культивирования диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток животных, например млекопитающих, или предпочтительно человека, например, с эффективностью, эквивалентной эффективности минимальной среды для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой. Настоящее изобретение также относится к способу культивирования диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток животных, например млекопитающих или предпочтительно человека, в среде по изобретению, включающему применение заменителя трипсина неживотного происхождения для пассирования клеток. Изобретение также относится к способу продуцирования вирусов, вирусных вакцин и тому подобного.

Предшествующий уровень техники

Клетки, зависимые от культуральной подложки, особенно диплоидные клетки, зависимые от культуральной подложки, используют в самых разных способах: для продуцирования продуктов, таких как вакцины и рекомбинантные белки, для нужд здравоохранения в крупномасштабных биопроцессах; для производства искусственных тканей, используемых в лечении человеческих ран; для экспериментальных исследований; в токсикологии in vitro; для скриннинга и тестирования новых лекарств и т.д.

Традиционно клетки, зависимые от культуральной подложки, культивируют в средах, содержащих сыворотку или другие компоненты животного происхождения в качестве заменителей сыворотки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА) или белковые гидролизаты. Сыворотку или компоненты животного происхождения используют также во время субкультивирования клеток и при криоконсервации клеток. Сыворотка является главным источником метаболитов, гормонов, витаминов, железа (трансферрин), транспортных белков, факторов прикрепления (например, фибронектина), факторов распластывания и роста. Она требуется для роста многих культур животных клеток in vitro. Кроме того, сыворотка действует в качестве буфера против разнообразных отклонений и токсических эффектов, таких как изменение рН, присутствие ионов тяжелых металлов, протеолитической активности или эндотоксинов. Альбумин является основным белковым компонентом сыворотки и оказывает несколько эффектов, которые способствуют росту и поддержанию клеток в культуре: он действует в качестве белка-носителя для ряда небольших молекул и в качестве переносчика жирных кислот, которые являются незаменимыми для клеток, но токсичными в несвязанной форме.

Диплоидные клетки, зависимые от культуральной подложки, стандартно выращивают на поверхности пластика, стекла или на микроносителях. Клетки прикрепляются и распластываются при помощи факторов прикрепления, таких как фибронектин (F.Grinnel & М.К.Feld Cell, 1979, 17, 117-129). Трипсин является одним из наиболее стандартных компонентов животного происхождения, используемых для открепления клеток в процессе клеточного пассирования (М.Schröder & P.Friedl), Methods in Cell Science, 1997, 19, 137-147; O.W.Mertens, Dev Biol Stand., 1999, Vol 99, p.167-180). После открепления клеток его необходимо заингибировать сывороткой или соевым ингибитором трипсина во избежание повреждения клеток. После открепления клетки высевают с меньшей плотностью на новую поверхность, где они могут размножаться и образовывать конфлуэнтный слой клеток перед следующим пересевом. Целью пассирования прикрепленных клеток является размножение и продуцирование достаточного количества клеток для осуществления вышеуказанных способов.

Существуют различные недостатки, связанные с использованием в этих способах сыворотки и компонентов животного происхождения, главным образом, их стоимость, варьирование их состава от партии к партии, их связь с более высоким риском загрязнения побочными агентами и последующие трудности, встречающиеся в технологии производства и выделения целевого продукта (например очистка, для того чтобы избавиться от сывороточных белков или введенных белков животного происхождения). Кроме того, как указанно выше, сообщают, что бессывороточная среда не подходит для зависимых от культуральной подложки диплоидных клеток (O.W.Mertens, Dev Biol Stand., 1999, Vol. 99, p.167-180; O.W.Merten, Dev. Biol. 2002, 101, 233-257).

Для культуры клеток, зависимых от культуральной подложки, был разработан целый ряд сред с низким содержанием сыворотки или ее отсутствием, в частности для культуры диплоидных клеток, зависимых от культуральной подложки (М.Kan & I.Yamane, Journal of Cellular Physiology, 1982, 111, 155-162; S.P.Forester et al. Biotechnology and Bioengineering, 1992, Vol. 40, p.1039-1044). Попытки, осуществленные с такими средами, были неудовлетворительными главным образом из-за того, что диплоидные клетки, зависимые от культуральной подложки, которые не являются трансформированными, нуждаются скорее в сложных бессывороточных средах с добавлением нескольких факторов роста и гормонов, а также потому, что в способах продуцирования таких клеток сыворотку обычно используют по меньшей мере в течение фазы производства биомассы (O.W.Merten, Dev. Biol. 2002, 101, 233-257). Кроме того, эти среды все же содержат компоненты животного происхождения, подобные БСА, белковым гидролизатам, факторам роста, транспортным белкам, аминокислотам, витаминам и т.д. Было предпринято очень мало попыток разработки составов сред для зависимых от культуральной подложки клеток, которые совсем не содержат компонентов животного происхождения. Сообщают, что составы, которые обычно не содержат животных компонентов, не способны поддерживать скорость роста клеток, эквивалентную той, которая наблюдается в присутствии сыворотки, и что они позволяют провести лишь несколько стадий пересева перед тем, как наблюдается раннее старение культуры (B.J.Walthall & R.Ham Experimental Cell Research (1981) 134 303-311). Кроме того, первичные клеточные культуры из зависимых от культуральной подложки клеток почти всегда вовлекают дезагрегацию клеточных слоев или ткани с использованием протеазы, главным образом сериновой протеазы животного происхождения, что подразумевает риск загрязнения клеточной культуры случайным вирусом и обусловливает неприемлемую изменчивость в росте клеток из-за изменения ферментативной активности протеазы от партии к партии. Например, применение свиного/бычьего трипсина при пассировании культур клеток, зависимых от культуральной подложки, представляет собой хорошо известную методику (O.W.Mertens, Cytotechnology, 2000, 34, 181-183).

Поэтому в области культивирования диплоидных клеток, зависимых от культуральной подложки, существует необходимость в разработке клеточной культуральной среды, которая по существу не содержит, а предпочтительно абсолютно не содержит компонентов животного происхождения и подходит для осуществления способа культивирования диплоидных клеток, зависимых от культуральной подложки, с эффективностью, эквивалентной эффективности минимальной среды для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой, например, в терминах скорости клеточного роста, старения, клеточной морфологии, продуцирования белка или вируса по сравнению с этими параметрами, полученными в способах с использованием сыворотки.

Краткое изложение сущности изобретения

Было обнаружено, что применение клеточной культуральной среды, не содержащей по существу экзогенных компонентов первичного животного происхождения и содержащей по меньшей мере один экзогенный фактор роста неживотного вторичного происхождения, может с успехом заменить стандартную культуральную среду и бессывороточную среду, которые, как известно, содержат компоненты экзогенного первичного и/или вторичного животного происхождения.

Также обнаружили, что способ культивирования клеток, включающий применение указанной культуральной среды и дополнительно включающий пассирование клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, предпочтительно зависимых от культуральной подложки клеток, один или более раз в присутствии заменителя протеазы неживотного происхождения, также может быть осуществлен с уровнем эффективности, эквивалентным уровню эффективности, полученному в классическом способе, который осуществляют с использованием минимальной среды для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой.

Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к клеточной культуральной среде, по существу не содержащей, преимущественно абсолютно не содержащей экзогенные компоненты первичного животного происхождения, включающей по меньшей мере один, предпочтительно более чем один экзогенный фактор роста неживотного вторичного происхождения, выбранный из группы, состоящей из EGF (эпидермальный фактор роста), FGF (фактор роста фибробластов), трийод-L-тиронина и гидрокортизона, и по меньшей мере одного IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1) и/или инсулина неживотного вторичного происхождения. Указанная культуральная среда соответствующим образом адаптирована для культивирования зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, предпочтительно диплоидных клеток, например, с эффективностью, эквивалентной эффективности минимальной среды для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой.

Культуральная среда по изобретению возможно дополнительно содержит белковый гидролизат неживотного происхождения. Белковый гидролизат предпочтительно присутствует. Подходящим белковым гидролизатом является пшеничный гидролизат.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанной среды для культивирования зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, предпочтительно диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток, с эффективностью, эквивалентной эффективности, полученной с минимальной средой для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой.

Авторы неожиданно обнаружили, что среда по изобретению особенно подходит для культивирования зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, особенно диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток, например, с эффективностью (например, скорость клеточного роста, старение, клеточная морфология, продуцирование вирусов или белка), эквивалентной эффективности, полученной с минимальной средой для этого типа клеток, дополненной компонентами животного происхождения, например, сывороткой.

Таким образом, изобретение в особенности относится к способу продуцирования зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, предпочтительно диплоидных клеток, в клеточной культуральной среде по изобретению, при котором:

а) высевают указанные клетки в клеточную культуральную среду, как определено в любом из пп.1-9, и дают возможность клеткам прикрепиться к субстрату;

б) осуществляют сбор кондиционированной среды, образующейся на стадии (а), открепление клеточного слоя от его субстрата и диссоциацию клеток протеазой неживотного происхождения, получая таким образом клеточную суспензию;

в) инокулируют в указанную культуральную среду клеточную суспензию со стадии (б) в устройство для культивирования, включающее адгезивную подложку, обеспечивающую прикрепление клеток; и

г) выращивают клетки в той же культуральной среде.

Стадии от (б) до (г) можно повторять несколько раз.

Кроме того, способ возможно включает стадию замораживания клеток, собранных на стадии (б) для получения клеточного банка.

Также обнаружили, что указанный способ продуцирования клеток не требует каких-либо стадий адаптации перед культивированием клеток в среде, не содержащей экзогенные компоненты животного происхождения, и что отсутствие этой стадии адаптации не влияет на старение клеток.

Таким образом, другой аспект изобретения касается получения линии клеток, в частности линии диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, адаптированных для роста в культуральной среде по изобретению, и в особенности получения линии клеток, в частности линии диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, адаптированных для продуцирования биологически активного продукта, предпочтительно вируса, в частности живого вируса для применения в качестве вакцины.

Изобретение также относится к способу продуцирования вирусов в зависимых от культуральной подложки клетках животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, в клеточной культуральной среде, подходящей для продуцирования вирусов, причем указанная среда не содержит компоненты первичного животного происхождения, а содержит по меньшей мере один экзогенный фактор роста неживотного вторичного происхождения и возможно один белковый гидролизат неживотного происхождения, включающему стадии:

а) заражения клеток вирусом,

б) размножения вирусов, и

в) сбора вирусов.

Способ может включать одну или более чем одну стадию очистки собранного вируса. Вирус может быть подходящим образом приготовлен в виде вакцинного препарата с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом и/или адъювантом.

Подробное описание изобретения

В особенно предпочтительном воплощении клеточная культуральная среда по изобретению по существу не содержит, предпочтительно абсолютно не содержит экзогенные компоненты первичного животного происхождения, предпочтительно она не содержит экзогенные компоненты первичного и вторичного животного происхождения. Указанная среда подходящим образом адаптирована для культивирования зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких так млекопитающие или предпочтительно человек, особенно диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток, например, с эффективностью, которая эквивалентна, например, в терминах скорости клеточного роста, клеточной морфологии, старения или продуцирования вирусов, эффективности, полученной с минимальной средой для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой. Например, минимальную среду для клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, можно найти в каталоге АТСС (Американской коллекции типовых культур), а примеры минимальной среды для данных типов клеток дополнительно приведены в Таблице 1. Сыворотка, используемая для сравнительных целей, типично представляет собой бычью сыворотку, в частности, фетальную бычью сыворотку. Таким образом, эквивалентность лучше всего оценивать при сравнении с минимальной средой согласно Таблице 1, и содержащей бычью сыворотку, типично в концентрации 10% (об./об.).

Таблица 1
Тип клеток	Минимальная среда*	Сыворотка
MRC-5(ATCCCCL-171)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
AGMK	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle) или М199	Фетальная бычья сыворотка, 10%
VERO(ATCC CCL-81)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle) или М199	Фетальная бычья сыворотка, 10%
MDCK (ATCC CCL-34)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
CHO(ATCC CCL-61)	ATCC среда Хэма (Ham) F12K	Фетальная бычья сыворотка, 10%
WI-38 (ATCC CCL-75)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
DBS-FRhL-2 (ATCC CCL-160)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
MRC-9 (ATCC CCL-212)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
IMR-90 (женские, ATCC CCL-186)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 10%
IMR-91 (мужские, Национальный институт старения - NIA)	Минимальная поддерживающая среда (MEM-Eagle)	Фетальная бычья сыворотка, 15%
*минимальная среда с добавлением аминокислот и витаминов согласно инструкциям ATCC или NIA

Под “скоростью клеточного роста” подразумевают среднюю скорость, с которой клетки растут в период от их оттаивания из клеточного банка до их старения. Ее выражают в Удвоении Популяции (УП)/день и получают путем расчета отношения количества Удвоений Популяции, наблюдаемого в период от оттаивания клеток до их старения, ко времени (выраженном в днях), прошедшем между оттаиванием клеток и их старением. Эквивалентная скорость клеточного роста по изобретению означает скорость роста, которая составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% или выше от скорости роста, полученной для клеток, культивируемых в минимальной среде для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой, обычно бычьей сывороткой, в концентрации 10% (используемой в качестве контроля). Наиболее предпочтительной является скорость клеточного роста, которая выше скорости, полученной для клеток, культивируемых в среде, содержащей сыворотку.

Под “клеточной морфологией” подразумевают морфологию клеток, оцениваемую при помощи оптической микроскопии. Эквивалентная эффективность в терминах морфологии означает, что клетки сохранили морфологию, которую они демонстрировали при культивировании в присутствии бычьей сыворотки. В качестве примера, клетки MRC-5 будут сохранять их фибробластную природу после культивирования в среде по настоящему изобретению.

Под “старением” подразумевают потерю репликативной способности клеток, наблюдаемую после постоянного фиксированного числа удвоений популяции (уровень удвоения популяции, УУП), которое обычно называют пределом Хэйфлика (Hayflick limit) (Harry Rubin, Nature Biotechnology, 2002, 20, 675-681). Эквивалентное старение по изобретению означает старение, которое составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% или выше от старения клеток, культивируемых в минимальной среде для этого типа клеток, дополненной подходящей сывороткой, обычно бычьей сывороткой, в концентрации 10% (используемой в качестве контроля). Наиболее предпочтительным является старение, которое происходит при УУП, более высоком, чем УУП, наблюдаемый у клеток, культивируемых в среде, содержащей сыворотку. Типично для клеток MRC-5, которые являются предпочтительными, старение получают от примерно УУП60 до примерно УУП75 для клеток, культивируемых в присутствии сыворотки, как описано выше.

Под “зависимыми от культуральной подложки клетками животных” или “зависимыми от культуральной подложки клетками человека” подразумевают либо клетки, происходящие из клеточных линий, либо клетки, происходящие из животных или человеческих тканей, которые нуждаются в твердой подложке для нормального роста и размножения. Твердая подложка по существу представляет собой поверхность для роста, такую как поверхность пластика или стекла. Примерами подходящих твердых подложек являются: чашки Петри, флаконы для тканевых культур, клеточные фабрики, роллерные флаконы или микроносители. Для целей изобретения поверхность не покрыта каким-либо белком животного происхождения, или пептидами, происходящими из таких белков. Клетки прикрепляются и распластываются путем адгезии, т.е. благодаря секреции их аутокринных факторов адгезии. Предпочтительные клетки, зависимые от культуральной подложки, представляют собой диплоидные клетки. Не ограничивающие примеры диплоидных клеток, зависимых от культуральной подложки, можно найти в каталоге АТСС (WI 38: CCL-75, MRC-5: CCL-171, IMR-90: CCL-186, DBS-FRhL-2: CCL-160, MRC-9: CCL-212) или в каталоге NIA (TIG-1 и TIG-7, разработанные для банка стареющих клеток NIA, TIG-1 репозитарный номер AG06173; IMR-91: l91 L). Предпочтительными клетками являются MRC-5, WI-38, FRhL-2, MRC-9, а наиболее предпочтительной клеточной линией является MRC-5.

“Среда, по существу не содержащая” используется в отношении среды, включая свежую и кондиционированную среду, которая не содержит сыворотку или каких-либо экзогенные компоненты первичного животного происхождения (таких как, например, БСА). Такая свежая среда или кондиционированная среда может содержать следы экзогенных компонентов вторичного животного происхождения. Под "средой, не содержащей компоненты животного происхождения" подразумевают среду, которая не содержит сыворотку или любые экзогенные компоненты как первичного животного происхождения (такие как, например, БСА), так и вторичного животного происхождения. Экзогенные компоненты первичного животного происхождения включают, например, компоненты, происходящие от коров (включая телят), человека (такие как человеческий сывороточный альбумин - ЧСА) или свиней. Компоненты вторичного животного происхождения определяют как компоненты, которые на одной из стадий их производства находятся в контакте с продуктом животного происхождения. В частности, часто используемые компоненты вторичного животного происхождения представляют собой рекомбинантные факторы роста, такие как инсулин, EGF и FGF и IGF-1. Эти рекомбинантные факторы роста, которые могут продуцироваться в E.соli, находятся в контакте с бычьими или свиными компонентами, используемыми для ферментации с подпиткой и/или для ферментативных расщеплений. Следы компонентов вторичного животного происхождения находятся в пределах менее 1%, предпочтительно менее 0,5%, более предпочтительно менее 0,01%, наиболее предпочтительно менее 0,001%, однако, предпочтительнее всего их отсутствие (0%). Минимальные бессывороточные среды и среды, не содержащие компоненты животного происхождения, имеются в продаже или могут быть приготовлены путем смешивания каждого из отдельных компонентов. Они подходящим образом дополнены факторами роста неживотного происхождения. Согласно настоящему изобретению предпочтительно используют среду, которая абсолютно не содержит экзогенные компоненты животного происхождения. Хотя среда, абсолютно не содержащая экзогенные компоненты животного происхождения, является предпочтительным воплощением, все указанные компоненты могут быть заменены компонентами вторичного животного происхождения (такими как факторы роста, пшеничный пептон, аминокислоты, протеаза и т.д., как перечислено выше) без какого-либо влияния на эффективность способа.

Под “животного происхождения” или “происходящим из животных” подразумевают млекопитающих, например, человека, а также животных, не являющихся млекопитающими, таких как насекомые, рыбы, птицы, земноводные и пресмыкающиеся.

Термин “экзогенный” предназначен для обозначения компонента неживотного происхождения, который был добавлен в среду, в отличие от компонента, обозначаемого как “эндогенный”, который секретировался клеткой. Поэтому при сравнении термин “эндогенный” относится к компоненту, который синтезируется и секретируется (аутокринная секреция) клеткой для обеспечения ее прикрепления, распластывания и роста на подходящем субстрате (фибронектин, коллаген, протеогликаны, факторы роста…) (M.R.Koller & E.T.Papoutsakis, Bioprocess Technol., 1995, 60, 61-110).

Предпочтительно клеточная культуральная среда не содержит экзогенные компоненты первичного животного происхождения, а содержит по меньшей мере один экзогенный фактор роста неживотного вторичного происхождения, предпочтительно по меньшей мере два, более предпочтительно по меньшей мере три или более факторов роста. Соответственно клеточная культуральная среда содержит по меньшей мере один экзогенный фактор роста неживотного происхождения, выбранный из группы, состоящей из: EGF, FGF, трийод-L-тиронина и гидрокортизона, и по меньшей мере один IGF-1 и/или инсулин неживотного вторичного происхождения. Соответственно культуральная среда содержит комбинацию EGF, FGF, трийод-L-тиронина и гидрокортизона неживотного вторичного происхождения и по меньшей мере один IGF-1 и/или инсулин неживотного вторичного происхождения. Термин “фактор роста” относится к белку, пептиду или полипептиду, или комплексу полипептидов, включая цитокины, которые необходимы для роста клеток, которые могут продуцироваться клеткой в процессе культивирования и которые могут влиять на саму клетку и/или множество других соседних или удаленных клеток, например, путем стимуляции клеточного прикрепления и роста. Некоторые, но не все, факторы роста являются гормонами. Примерами факторов роста являются инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), включая IGF-1, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), включая основной FGF (bFGF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-alpha), происходящие из тромбоцитов факторы роста (PDGFs), фактор роста нервов (NGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-beta), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин 6 (IL-6), трийод-L-тиронин и гидрокортизон. Предпочтительные факторы роста включают, например, EGF, FGF (предпочтительно bFGF), IGF-1 или инсулин, трийод-L-тиронин и гидрокортизон, и могут быть использованы либо по одиночке, либо предпочтительно в комбинации. Предпочтительная культуральная среда содержит EGF, FGFb, IGF-1 или инсулин, трийод-L-тиронин и гидрокортизон неживотного происхождения. Тем не менее, более предпочтительным является то, чтобы все компоненты клеточной культуральной среды по изобретению, такие как компоненты, перечисленные в Таблице 3, не имели первичного или вторичного животного происхождения.

В еще более предпочтительном воплощении культуральная среда дополнительно содержит белковый гидролизат неживотного прпоисхождения, предпочтительно белковый гидролизат, происходящий из растений или дрожжей. Под “белковым гидролизатом” или “белковым пептоном” подразумевают, как принято в данной области, очищенный препарат белкового гидролизата или его грубой фракции, который, следовательно, не содержит белка. Термин “безбелковый” предназначен для обозначения отсутствия какого-либо функционально активного белка, но он, однако, возможно не исключает нефункциональных пептидов, которые могут происходить именно из белковых гидролизатов. Особенно подходящая фракция гидролизата содержит белковый гидролизат пшеничный пептон, например ферментативный гидролизат, состоящий из пептидов в диапазоне до 10000 дальтон, с большей частью 80% пептидов в диапазоне от 300 до 1000 дальтон. Концентрация белкового гидролизата в культуральной среде, когда он присутствует, варьирует от 0 до 10 г/л, предпочтительно от 1 до 5 г/л, особенно предпочтительно 2,5 г/л. Конкретно, белковый гидролизат происходит из растений (например риса, кукурузы, пшеницы, сои, гороха, хлопчатника, картофеля) или дрожжей. Предпочтительный растительный белковый гидролизат по изобретению представляет собой белковый гидролизат пшеничный пептон.

Альтернативно, клеточная культуральная среда по изобретению относится к “свежей среде”, “кондиционированной среде” или к смеси обеих сред. “Свежая среда” относится к любой клеточной культуральной среде, имеющейся в продаже или приготовленной из отдельных компонентов, которые не были использованы для культивирования каких-либо клеток. Согласно предпочтительному аспекту изобретения, подразумевают, что свежая среда относится к имеющейся в продаже среде или среде, приготовленной из отдельных компонентов, как описано выше. Эта среда по изобретению, которая не содержит животных компонентов первичного происхождения и которая дополнена по меньшей мере одним экзогенным фактором роста неживотного вторичного происхождения, как описано здесь выше, и возможно, но предпочтительно, белковым гидролизатом неживотного происхождения, таким как пшеничный белковый гидролизат.

Подразумевают, что “кондиционированная среда” обозначает среду, которая была использована одной клеточной культурой и которую вновь используют для другой культуры. Эта кондиционированная среда включает высвобожденные первой культурой эндогенные стимулирующие рост вещества, эндогенные факторы прикрепления и специфические эндогенные питательные вещества.

Таким образом, в другом аспекте изобретения предложен способ получения кондиционированной культуральной среды, включающий объединение свежей культуральной среды по изобретению с зависимыми от культуральной подложки клетками животных или предпочтительно человека, для получения кондиционированной культуральной среды.

Если не указано иначе, свежую среду, кондиционированную среду и смесь обеих сред будут обозначать как “культуральная среда”.

Таблица 2 показывает диапазон концентраций и предпочтительные концентрации фактора(ов) роста и белкового гидролизата, добавленных в свежую среду. Соответственно, концентрация факторов роста, когда они присутствуют, в подходящей клеточной культуральной среде по изобретению такая, как определено в Таблице 2.

Таблица 2
Фактор роста	Предпочтительная концентрация (мг/л)	Диапазон концентраций (мг/л)
EGF	0,005	0,00001-0,3
FGFb	0,003	0,00001-0,1
ТЗ (трийод-L-тиронин)	0,066	0-1
Гидрокортизон	1	0-10
IGF-1	0,1	0,00001-5
или инсулин	5	0,1-1000
Пшеничный пептон гидролизат	2500	0-10000

Будет понятно, что в зависимости от типа культивируемых клеток и эффективности, которую нужно достичь, свежая культуральная среда по изобретению может быть возможно дополнена ингредиентами, традиционно присутствующими в культуральной среде и имеющими неживотное происхождение. Подходящими ингредиентами являются, например, аминокислоты (включая заменимые), витамины, нуклеотиды/нуклеозиды, жирные кислоты, антибиотики и стабилизаторы окисления, которые все имеют неживотное происхождение.

Подходящими свежими средами являются стандартные среды, не содержащие животных компонентов, такие как среды на основе DMEM (high-glucose Dulbecco′s Modified Eagle′s Media, модифицированная Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы), MEM (Minimum Essential Medium Eagle, минимальная поддерживающая среда Игла), Medium 199, RPM-I 1640 - все имеются в продаже от, среди прочих, Life-technologies-Gibco-BRL, BioWittaker, Sigma-Aldrich, и, кроме того, адекватно дополненные фактором(ами) роста и возможно белковым гидролизатом неживотного происхождения, как изложено выше. Квалифицированный специалист поймет, что исходную среду нужно выбирать в соответствии с типом культивируемых клеток. Предпочтительная имеющаяся в продаже свежая среда представляет собой Ультра-МЕМ, имеющуюся в продаже от BioWhittaker (кат. №12-745F). Альтернативно, в зависимости от типа клеток, которые нужно культивировать, свежая среда представляет собой среду без животных компонентов, приготовленную из отдельных компонентов, и содержит (список не является исчерпывающим) источник углеводов, ингредиенты неорганических солей, следы элементов, аминокислоты (включая заменимые), витамины, нуклеотиды/нуклеозиды, жирные кислоты, антибиотики, стабилизаторы окисления и воду, подходящим образом дополненную экзогенными факторами роста неживотного происхождения и возможно, но предпочтительно, белковым гидролизатом неживотного происхождения, как изложено выше. Пример базовой композиции такой среды дан в Примере I и Таблице 3.

Указанные среды подходят для культивирования клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, в особенности зависимых от культуральной подложки клеток животных, таких как млекопитающие или предпочтительно человек, предпочтительно диплоидных, зависимых от культуральной подложки клеток, что представляет собой другой аспект изобретения.

В предпочтительном аспекте изобретения также предложен способ продуцирования зависимых от культуральной подложки клеток животных или предпочтительно человека, предпочтительно диплоидных клеток, в культуральной среде по изобретению, при котором:

а) высевают указанные клетки в клеточную культуральную среду, как определено в любом из пп.1-9, и дают возможность клеткам прикрепиться к субстрату;

б) осуществляют сбор кондиционированной среды, образующейся на стадии (а), открепление клеточного слоя от его субстрата и диссоциацию клеток протеазой неживотного происхождения, получая таким образом клеточную суспензию;

в) инокулируют в указанную культуральную среду клеточную суспензию со стадии (б) в устройство для культивирования, включающее адгезивную подложку, обеспечивающую прикрепление клеток; и

г) выращивают клетки в той же культуральной среде;

д) возможно повторяют стадии от (б) до (г).

Возможно, способ включает стадию замораживания клеток, собранных на стадии (б), чтобы получить клеточный банк.

Протеазу, используемую на стадии (б), возможно, инактивируют после обработки.

В зависимости от типа клеток и от эффективности способа культивирования клеток, которую нужно достичь, специалист поймет, что используемая культуральная среда, особенно на стадиях (а) и (в), может быть либо свежей средой, либо кондиционированной средой, происходящей из предыдущей культуры, либо смесью свежей и кондиционированной среды. В этой смеси соотношение между свежей культуральной средой и кондиционированной культуральной средой варьирует от 1:0 (100% свежей среды) до 0:1 (100% кондиционированной среды). Кондиционированная среда предпочтительно составляет от 0 до примерно 75% общего объема среды. Предпочтительным соотношением между свежей культуральной средой и кондиционированной культуральной средой является 1:1 (50% свежей/50% кондиционированной), еще более предпочтительным - примерно от 7:1 (87,5% свежей/12,5% кондиционированной) до 1:7, наиболее предпочтительным - примерно от 3:1 (75% свежей/25% кондиционированной) до 1:3, а самым предпочтительным - 3:1 (75% свежей/25% кондиционированной). Предпочтительные соотношения предпочтительно поддерживают на протяжении всего способа культивирования при каждой смене среды.

Протеаза представляет собой протеазу неживотного происхождения, то есть протеазу, очистку которой производят не из животного источника. Протеаза может быть рекомбинантного происхождения, но предпочтительно бактериального, дрожжевого или растительного происхождения, если возможно, неживотного вторичного происхождения. Подразумевают, что протеаза рекомбинантного происхождения означает любую протеазу, которую продуцируют при помощи методов рекомбинантных ДНК, включая применение микроорганизма, например, бактерии, вируса, дрожжей, растений и т.д. для ее продуцирования. Предпочтительные протеазы включают: цистеиновую эндопептидазу; нейтральную грибковую протеазу (из A.oryzae); нейтральную бактериальную протеазу (из Bacillus subtilis) (описанную в Brocklehurst, К. et al., Cysteine proteinases. In New Comprehensive Biochemistry Vol.16, Hydrolytic Enzymes; Neuberger, A. & Brocklehurst, K., eds, pp.39-158 (1987) Elsevier, Amsterdam); сериновые протеазы, такие как трипсиноподобные протеазы (такие как rProtease от Invitrogen, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072. Номер по каталогу поставщика 02-106) или рекомбинантный трипсин (такой как Trypzean, рекомбинантный трипсин, продуцируемый в кукурузе, Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845. Код производителя: TRY). Протеазы из семейства трипсиноподобных протеаз обычно обнаруживают у прокариот, животных и вирусов, но неожиданно, что они до сих пор не обнаружены у растений. Эти ферменты участвуют в разнообразных физиологических процессах, наиболее известными из которых являются пищеварение, оплодотворение, каскад свертывания крови и процессы развития. Считают, что они дивергировали от общего белка-предшественника. Эти ферменты широко описаны в литературе (A.J.Greer, "Comparative modelling methods - application to the family of mammalian serine proteases" Proteins, Vol.7, p.317-334, 1990) и могут быть разделены на несколько семейств на основании их структуры (А.Sali & Т.Blundell, "definition of general topological equivalence in protein structures" J. Mol. Biol., 212, p.403-428, 1990). Подх