Способ подготовки пробы биологического материала для иммуноферментного анализа

Способ подготовки пробы биологического материала для иммуноферментного анализа

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы женщин с пролиферативными заболеваниями эндометрия путем исследования содержания цитокинов в аспиратах из полости матки.

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, часто гликозилированных, с молекулярной массой от 8 до 80 кД. Цитокины участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма и его гомеостаза. Изучение и оценка уровней цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток; о тяжести патологического процесса, о стадии развития ряда заболеваний [1].

Содержание цитокинов определяют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и в основном измеряют их уровни в естественных жидкостях: периферической крови, моче, слезной жидкости, жидкости десневых карманов, бронхоальвеолярном лаваже, эякуляте, смывах из полостей, спинномозговой или синовиальной жидкости и др. Определение цитокинов в биологических материалах, отличных по консистенции от жидкостей (например, в биоптатах тканей, аспиратах, выдыхаемом воздухе), вызывает определенные трудности, в связи с необходимостью подготовки проб для исследования.

Известен способ подготовки пробы биологической ткани для ИК-спектроскопии [2]. Биоптат ткани предстательной железы обрабатывают гексаметилдисилазаном на кипящей водяной бане в течение 1-2 ч с последующим высушиванием и спектроскопическим анализом.

Однако способ трудоемкий, требует взятие биоптата и не может быть использован для подготовки проб аспирата из полости матки.

Известен способ подготовки пробы периферической крови для ИФА, взятый в качестве прототипа [3]. В стерильных условиях производят забор 5 мл периферической крови из локтевой вены. В пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (гепарин) из расчета: на 1 мл крови - 5 Ед. гепарина. Гепарин тщательно перемешивают с кровью. Пробу центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. После этого, дозатором забирают 0,1 мл надосадочной жидкости и помещают в лунку планшета для определения содержания цитокинов с помощью ИФА. Исследование проводят по стандартной методике в соответствие с протоколом фирмы-производителя.

Однако данный способ подготовки пробы неприемлем для исследования аспирата из полости матки, т.к. аспират представляет собой неоднородную взвесь, состоящую из свернувшейся крови, секрета желез эндометрия и элементов эндометриальной ткани достаточно плотной консистенции, а для проведения ИФА требуется гомогенная жидкость.

Для повышения эффективности способа к 1 мл аспирата из полости матки добавляют 1,0 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и 0,1 мл неполярного детергента (например, Твин-60 или Тритон X), выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-30°С, центрифугируют 3-5 мин со скоростью 3000 об/мин и надосадочную жидкость забирают для последующего анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят забор аспиратов из полости матки с помощью одноразовых пластиковых катетеров. 1,0 мл аспирата помещают в пластиковую пробирку объемом 2,0 мл и добавляют 1,0 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и 0,1 мл неполярного детергента (например, Твин-60 или Тритон X), тщательно встряхивают и выдерживают 1 ч при температуре 20-30°С. Затем пробирку с пробой центрифугируют 3-5 мин. со скоростью 3000 об/мин. Дозатором забирают 0,1 мл светлой гомогенной надосадочной жидкости и помещают в лунку планшета для последующего ИФА. Исследование концентрации цитокинов производят согласно протоколу фирмы-производителя набора реагентов. Оптическую плотность определяют с помощью фотометра при длине волны 450 нм, проводят компьютерную обработку, результаты выражают в пикограммах на миллилитр (pg/ml).

Параметры способа определены опытным путем.

Оптимальное время взаимодействия пробы с детергентом - 1 ч. Если выдержать пробирку менее часа, то тканевой компонент осядет лишь частично и жидкой части экстракта выделится мало. Если дольше, то присоединяется угроза развития микроорганизмов в аспирате, что в последующем кардинально изменит пробу (табл.1).

Таблица 1 Зависимость концентрации цитокинов от времени выдержки при температуре 20°С
Время экстракции (мин)	Концентрация ИЛ-1β (пкг/мл)	Результат
10	5	Недостаточно времени для экстракции
20	8
30	10
40	12
50	20
60	30	Оптимальный результат (выбираем меньшее время)
70	30
80	30
90	25	Угроза развития микрофлоры и изменения пробы
100	20

Температура 20°С наиболее оптимальна для проведения экстракции и исследования концентрации цитокинов (табл.2).

Таблица 2. Зависимость концентрации цитокинов от температуры
Т°С	Концентрация ИЛ-1β (пкг/мл)	Результат
10	15
15	20
20	35	Оптимальное время (выбираем меньшее)
25	35
30	35
35	30
40	10

Пробу центрифугируют 3-5 мин со скоростью 3000 об/мин. Это наиболее оптимальные время и скорость центрифугирования, которые обеспечивают исчезновение мутности (экстинции - Е) и, следовательно, выделение светлого гомогенного экстракта в аспирате из полости матки (нефелометрия) (табл.3).

Таблица 3 Зависимость показателя экстинции нефелометрии от времени и скорости центрифугирования
Скорость центрифугирования (об/мин)	Время центрифугирования (мин)	Е (мутность) (%)	Результат
1000	0	100	Мутность сохранена
1	90
2	80
3	75
4	60
5	55
1500	0	100	Мутность сохраняется
1	80
2	75
3	55
4	35
5	20
3000	0	100	Мутность исчезла
1	40
2	20
3	0
4	0
5	0

Пример 1. Больная С., 45 лет. Дs: простая гиперплазия эндометрия. Для определения степени прогрессии неопластического процесса эндометрия предложено исследовать содержание цитокинов в полости матки.

Для этого произведен забор аспирата из полости матки с помощью одноразового катетера. 1,0 мл аспирата поместили в пластиковую пробирку объемом 2,0 мл. В пробирку добавили 1 мл фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,1 мл неполярного детергента - Тритон Х и тщательно перемешали содержимое. Пробу оставляют при температуре 23°С на 1 час. Через 1 ч пробу отцентрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 3 мин. Дозатором забрали надосадочную жидкость и 0,1 мл несли в иммунологический планшет. Исследование содержания ИЛ-1β провели методом иммуноферментного анализа в соответствии с протоколом фирмы-производителя набора реагентов («Вектор-Бест», г.Новосибирск) с помощью стандартного «ридера» при длине волны 450 нм («ASYS Hitech GmbH», Австрия). Содержание ИЛ-1β составило 235,7 пкг/мл, что свидетельствует о доброкачественном течении гиперпластического процесса.

Пример 2. Больная А., 40 лет, с Дs: атипичная гиперплазия эндометрия.

Забор аспирата и подготовку пробы произвели вышеописанным способом. В качестве неполярного детергента использовали Твин-60. Методом ИФА провели определение содержания фактора некроза опухолей. Концентрация ФНОα составила 878,5 пкг/мл, что свидетельствует о высоком риске развития злокачественного процесса.

Пример 3. Больная А., 49 лет, с Дs: умереннодифференцированная аденокарцинома?

Провели определение содержания цитокинов в аспирате из полости матки в соответствии с примером 2. Концентрация ФНОα составила 2241,4 пкг/мл, что свидетельствует о вероятном течении злокачественного процесса в эндометрии.

С помощью данного способа проведено исследование цитокинов в аспиратах из полости матки у 80 больных с пролиферативными заболеваниями эндометрия. Воспроизводимость способа составила 95%.

Список литературы

1. Заридзе Д.Т. Канцерогенез, - М.: Медицина, 2004. - 580 с.

2. Патент РФ 2018829 МПК G01N 33/48 Способ диагностики заболеваний предстательной железы.

3. Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. - М.: Медицина, 1982. - 420 с.

Способ подготовки пробы биологического материала для иммуноферментного анализа, включающий забор материала и центрифугирование, отличающийся тем, что в качестве биологического материала берут аспират из полости матки, добавляют к нему фосфатный буфер (рН 7,4) и неполярный детергент в соотношении 100:1, выдерживают при температуре 20-30°С в течение 1 ч, центрифугируют 3-5 мин при скорости 3000 об./мин и надосадочную жидкость отбирают для последующего анализа.