Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и g-csf

Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и g-csf

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала и белка фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов (G-CSF), причем указанные конъюгаты образованы ковалентным связыванием между гидроксиалкилкрахмалом или производным гидроксиалкилкрахмала и белком. Настоящее изобретение также относится к способу получения этих конъюгатов и к применению этих конъюгатов.

В целом принято, что устойчивость белков можно улучшить и иммунный ответ против этих белков уменьшить, когда эти белки соединяются с полимерными молекулами. В документе WO 94/28024 описано, что физиологически активные белки, модифицированные полиэтиленгликолем (PEG), проявляют сниженную иммуногенность и антигенность и циркулируют в потоке крови значительно дольше, чем неконъюгированные белки, т.е. имеют сниженную скорость клиренса.

G-CSF представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 21 кДа, стабилизированный двумя внутрицепочечными дисульфидными связями и содержащий одну связанную с О углеводородную часть. Зрелый G-CSF имеет 174 аминокислоты. В организме животного G-CSF синтезируется стромальными клетками костного мозга, макрофагами и фибробластами. Его основная функция заключается в том, что он представляет собой фактор роста и дифференциации для нейтрофилов и их клеток-предшественников. Однако в данной области также известно, что G-CSF активирует зрелые нейтрофилы. Кроме того, он стимулирует рост/дифференциацию различных других гематопоэтических клеток-предшественников (в синергии с дополнительными гематопоэтическими ростовыми факторами) и содействует пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. Клинически G-CSF вводится для лечения недостаточности уровней нейтрофилов (вызванных, например, апластической анемией, миелодисплазией, СПИДом или химиотерапией).

В документе WO 02/09766, наряду с другими соединениями, описываются биологически совместимые белково-полимерные соединения, которые получают коньюгацией биологически активного белка с биологически совместимым полимерным производным. Используемые биологически совместимые полимеры представляют собой высоко реакционноспособные разветвленные полимеры, и полученные конъюгаты содержат длинный линкер между полимерным производным и белком. В качестве биологически совместимых полимеров описаны полимеры формулы (P-OCH₂CO-NH-CHR-CO-)_n-L-Qk-A, где P и Q представляют собой полимерные остатки, а k может быть равна 1 или 0. Для P и Q упоминаются полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиэтилен, политриметиленгликоль, полимолочная кислота и ее производные, полиакриловая кислота и ее производные, полиаминокислота, полифиниловый спирт, полиуретан, полифосфазен, поли(L-лизин), полиалкиленоксид, полиакриламид и растворимые в воде полимеры, такие как декстран или полисахарид. В качестве белков, среди других, упоминаются альфа, бета и гамма интерфероны, факторы крови, цитокины, такие как интерлейкины, G-CSF, GM-CSF. В примерах документа WO 02/09766 раскрыты только производные моно-, ди- и три-полиэтиленгликоля, которые соединены исключительно с интерфероном и эпидермальным ростовым фактором и человеческим гормоном роста.

В документе WO 94/01483 описаны конъюгаты биологически совместимого полимера, которые образованы ковалентным связыванием биологически неактивного полимера или полимерного производного с фармацевтически чистым, синтетическим гидрофильным полимером посредством определенных типов химических связей. В качестве природных полимеров и их производных раскрываются полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, протеогликаны, такие как хондроитинсульфаты А, В и С, хитин, гепарин, гепаринсульфат, декстраны, такие как циклодекстран, гидроксиэтилцеллюлоза, простой эфир целлюлозы и крахмала, липиды, такие как триглицериды и фосфолипиды. В качестве синтетических полимеров, наряду с другими, описаны полиэтилен и его производные, имеющие среднюю молекулярную массу от примерно 100 до примерно 100000. В качестве белков, связанных с полимером или полимерным производным, описаны цитокины и ростовые факторы, включая раскрытые интерфероны, факторы опухолевого некроза, интерлейкины, колониестимулирующие факторы, ростовые факторы, такие как экстракт остеогенного фактора, эпидермальный ростовой фактор, трансформирующий ростовой фактор, полученный из тромбоцитов ростовой фактор, кислотный фактор роста фибробластов и другие. Во всех рабочих примерах документа WO 94/01483 в качестве полимера используются производные полиэтиленгликолей.

В документе WO 96/11953 раскрыты химически модифицированные на N-конце белковые соединения и способы их получения. В частности, описаны композиции G-CSF, которые получены в результате присоединения растворимого в воде полимера по N-концу G-CSF. В контексте документа WO 96/11953 раскрыт также рекомбинантный интерферон типа 1, соединенный по N-концу с растворимыми в воде полимерами. Хотя в документе WO 96/11953 перечислено широкое разнообразие растворимых в воде полимеров (например, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры, или случайные сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида или полиоксиэтилированные полиолы), в рабочих примерах документа WO 96/11953 описаны только композиции соединенного с PEG G-CSF или рекомбинантного IFN (интерферона) типа 1.

В патенте США № 6555660 В2 раскрыты полипептидные конъюгаты, включающие полипептид, проявляющий активность G-CSF и имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, в которой конъюгат включает группу присоединения для не полипептидной части и, кроме того, включает, по меньшей мере, одну не полипептидную часть, присоединенную к группе присоединения полипептида. Не полипептидная часть может представлять собой полимер, такой как полиэтиленгликоль или олигосахарид. В патенте США № 6555660 В2 ясно и однозначно указано, что PEG пока является самой предпочтительной полимерной молекулой, поскольку у него есть лишь несколько реакционноспособных групп, способных к перекрестной сшивке, по сравнению с полисахаридами, такими как декстран.

В документе WO 97/30148 описываются полипептидные конъюгаты со сниженной аллергенностью, включающие молекулы полимерного носителя, имеющего 2 или более полипептидных молекул, связанных с ним. Эти конъюгаты представляют собой предпочтительно часть композиций, используемых на рынке продуктов для ухода. Указанные конъюгаты получают активацией молекулы полимерного носителя, взаимодействием двух или более полипептидных молекул с активированной молекулой полимерного носителя и блокировкой остаточных активных групп на конъюгате. В качестве молекулы полимерного носителя в документе WO 97/30148 перечислено их многочисленное разнообразие, включая такие различные группы соединений как натуральные или синтетические гомополимеры, такие как полиолы, полиамины, поликарбоновые кислоты и гетерополимеры, включающие, по меньшей мере, 2 различные группы присоединения. Приведены примеры, которые включают прямые PEG, разветвленные PEG, поливиниловые спирты, поликарбоксилаты, поливинилпирролидоны и поли-D,L-аминокислоты. Среди других соединений описаны также декстраны, такие как карбоксиметилдекстран, целлюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза или гидроксипропилцеллюлоза, гидролизаты хитосана, крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмалы или гидроксипропилкрахмалы, гликоген, агароза, гуаровая смола, инулин, пуллулан, ксантановая смола, каррагинин, пектин, альгиновая кислота и т.д. В качестве полипептидов ясно раскрыты только некоторые ферменты.

Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron, vol. 27 (1981), pp. 1723-1726 описывают химическую модификацию декстрана и гидроксиэтилкрахмала для получения замещенных альдегидом полимеров, которые могут взаимодействовать с гемоглобином с получением растворимых, связанных с полимером гемоглобинов. Было показано, что они способны связывать кислород, но эксперименты с перфузией сердца ясно показали, что связанные с полимером гемоглобины не подходили для использования в качестве заменителей крови.

В документе WO 99/49897 описаны конъюгаты гемоглобина, образованные взаимодействием полисахаридов, таких как декстран или гидроксиэтилкрахмал, с аминогруппами гемоглобина. В качестве функциональных групп полисахарида используются альдегидные группы, полученные окислительным раскрытием сахаридного кольца. В качестве предпочтительного восстанавливающего агента раскрыт боран диметиламина. Более того, документ WO 99/49897 исключительно ограничен гемоглобином.

Документ WO 03/074087 относится к способу сочетания белков с полученным из крахмала модифицированным полисахаридом. Гидроксиалкилкрахмал, который оказывает соединяющее действие между белком и полисахаридом, представляет собой ковалентную связь, которая образована между концевой альдегидной группой или функциональной группой, полученной в результате химической модификации указанной концевой альдегидной группой молекулы гидроксиалкилкрахмал, и функциональной группой белка. В качестве реакционноспособной группы белка раскрыты тиогруппы и карбоксильные группы, а альдегидные группы белка не упомянуты. Более того, хотя приведено многочисленное разнообразие возможностей различных связей в виде многих перечней, включающих различные функциональные группы, теоретически подходящие различные линкерные молекулы и различные химические методики, рабочие примеры описывают только 2 альтернативы: во-первых, используется окисленный гидроксиэтилкрахмал и соединяется непосредственно с белками, используя активацию этилдиметиламинопропилкарбодиимидом (EDC), или используется неокисленный гидроксиэтилкрахмал и соединяется непосредственно с белком, образующим основание Шиффа, которое в последующем восстанавливается в соответствующий амин. Так, рабочие примеры документа WO 03/074087 не раскрывают индивидуальный конъюгат, соединенный через тиогруппу или карбоксигруппу белка, и не описывают конъюгат, включающий гидроксиэтилкрахмал, белок и одну или несколько линкерных молекул. Кроме того, в рабочих экспериментах не используется молекула G-CSF.

Поэтому целью настоящего изобретения является предоставление конъюгатов гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и G-CSF, которые еще не описаны в предшествующем уровне техники.

Еще одной целью настоящего исследования является предоставление способов получения этих конъюгатов.

Поэтому настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, включающего белок и полимер или его производное, причем полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), а белок представляет собой фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF), причем способ включает взаимодействие, по меньшей мере, одной функциональной группы А полимера или его производного, по меньшей мере, с одной функциональной группой Z белка и посредством этого образуя ковалентную связь, где Z выбрана из группы, состоящей из аминогруппы, тиоловой группы, альдегидной группы и кетогруппы, и

- где, в случае, если Z представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, то А включает аминогруппу, образующую указанное соединение с Z, или

- где, в случае, если Z представляет собой аминогруппу, то А выбрана из группы, состоящей из реакционноспособной карбоксигруппы и альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы,

-- где, в случае, если А представляет собой альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, то способ, кроме того, включает введение А в полимер для получения производного полимера,

--- взаимодействием полимера, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, одна функциональная группа которого взаимодействует с полимером и, по меньшей мере, одной другой функциональной группой из которых является альдегидная группа, кетогруппа или полуацетальная группа, или представляет собой функциональную группу, которая, кроме того, химически модифицирована для получения альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы, или

--- окислением полимера для получения, по меньшей мере, одной, в частности, по меньшей мере, двух альдегидных групп, или

-- где, в случае, если А представляет собой реакционноспособную карбоксигруппу, способ, кроме того, включает введение А в полимер для получения производного полимера,

--- селективным окислением полимера на его восстанавливающем конце и активацией полученной карбоксигруппы, или

--- взаимодействием полимера по его неокисленному восстанавливающемуся концу со сложным карбоновым эфиром, или

- где в случае, если Z представляет собой тиоловую группу, то А включает

-- малеимидогруппу или

-- галогенацетильную группу,

образуя указанную связь с Z.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, который можно получить описанным выше способом.

G-CSF можно получить химическими синтетическими способами, или он может быть получен из любого человеческого (см., например, Burgess, A.W. et al. 1977, Stimulation by human placental conditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrow cells. Blood 49 (1977), 573-583; Shah, R.G. et al. 1977, Characterization of colony-stimulating activity produced by human monocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes, Blood 50 (1977), 811) или из другого источника-млекопитающего, и его можно получить очисткой из природных источников, подобных плаценте человека, крови человека или мочи человека. Кроме того, множество эпителиальных карцином, клеток острого миелолейкоза и различных линий опухолевых клеток (карцином мочевого пузыря, медуллобластом) способны экспрессировать этот фактор.

Кроме того, экспрессия G-CSF охватывает также вариант G-CSF, в котором одна или несколько аминокислот (например, от 1 до 25, предпочтительно от 1 до 10, предпочтительнее от 1 до 5, наиболее предпочтительно 1 или 2) были заменены другой аминокислотой, которая проявляет активность G-CSF (см., например, Riedhaar-Olson, J.F. et al. 1996, Identification of residues critical to the activity of human granulocyte colony-stimulating factor, Biochemistry 35:9034-9041 1996; патенты США 5581476; 5214132; 5362853; 4904584). Измерение активности G-CSF описано в данной области (измерение активности G-CSF in vitro см., например, Shirafuji, N. et al.1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119; измерение активности G-CSF in vivo см., например, Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research 51, 3710-3714, 1991). Другие публикации, где описаны тесты измерения активности G-CSF, представляют собой патент США № 6555660; Nohynek, G.J. et al.1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and nonneutropenic CD rats, Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39; 259-266.

Предпочтительно G-CSF получен рекомбинантно. Это включает экспрессию последовательностей экзогенной ДНК прокариотического или эукариотического хозяина, полученных геномным или цДНК клонированием или синтезом ДНК. Подходящие прокариотические хозяева включают различные бактерии, такие как E. coli. Подходящие эукариотические хозяева включают дрожжи, такие как S. cerevisiae, и клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка и клетки обезьян.

Рекомбинантное получение белка известно в данной области. В целом, это включает трансфекцию клеток хозяина соответствующим вектором экспрессии, культивацию клеток хозяина в условиях, которые обеспечивают возможность получения белка и очистки белка из клеток хозяина. Подробную информацию можно найти, например, в публикациях Souza, L. M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 1986 232:61-65, 1986; Nagata, S. et.al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319:415-418, 1986; Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn J Cancer Res. 1987 78(11):1179-1181.

В предпочтительном варианте осуществления G-CSF имеет аминокислотную последовательность человеческого зрелого G-CSF

(см., например, Nagata, S. et. al. 1986. Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor. Nature 319:415-418, 1986) и может, кроме того, содержать метионин на его амино-конце, который затем приводит к получению белка из 175 аминокислот. Кроме того, вместо метионина G-CSF может содержать сериновый или треониновый остаток.

G-CSF, используемый в способах настоящего изобретения, и конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут включать одну углеводородную боковую цепь, присоединенную к G-CSF посредством связанного с О гликозилирования в положении Thr 133, т.е. G-CSF гликозилирован (V. Gervais et al., Eur. J. Biochem. 1997, 247, 386-395). Структура углеводородной боковой цепи может представлять собой NeuNAc(альфа2-3)Gal(бета-3)[NeuNAc(альфа2-6)]GalNAc и (альфа2-3)Gal(бета1-3)GalNAc (NeuNAc=N-ацетилнейраминовая кислота, GalNAc = N-ацетилгалактозамин).

Была предложена модификация G-CSF и других полипептидов с тем, чтобы ввести, по меньшей мере, одну дополнительную углеводородную цепь, по сравнению с нативным полипептидом (патент США № 5218092). В зависимости от используемого хозяина продукт экспрессии G-CSF может быть гликозилирован углеводородами млекопитающих или другими эукариотическими углеводородами. Обычно, когда G-CSF получают в эукариотических клетках, белок гликозилируется после трансляции. Следовательно, углеводородная боковая цепь может быть присоединена к G-CSF во время биосинтеза в клетках млекопитающего, особенно человека, насекомого или дрожжей.

Рекомбинантный человеческий G-CSF (rhG-CSF) в целом используется для лечения различных форм лейкопении. Так, в продаже препараты G-CSF имеются под названиями филграстим (Gran® и Neupogen®), ленограстим (Neutrogin® и Granocyte®) и нартограстим (Neu-up®). Gran® и Neupogen® являются негликозилированными и получены в рекомбинантных клетках E.coli. Neutrogin® и Granocyte® являются гликозилированными и получены в рекомбинантных клетках СНО и Neu-up® является негликозилированным с пятью аминокислотами, замещенными в N-концевой области интактного rhG-CSF, полученного в рекомбинантных клетках E.coli.

В качестве гликозилированного белка может использоваться любой гликозилированный G-CSF, такой как Granocyte®. В качестве не гликозилированного белка может использоваться любой негликозилированный G-CSF, такой как Neupogen® в способах и конъюгатах в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, в положении -1 G-CSF может содержать метиониновый аминокислотный остаток, сериновый остаток или треониновый остаток.

В контексте настоящего изобретения термин «гидроксиалкилкрахмал» (HAS) относится к производному крахмала, которое было замещено, по меньшей мере, одной гидроксиалкильной группой. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал настоящего изобретения имеет строение в соответствии с формулой (I)

где восстанавливающий конец молекулы крахмала показан в неокисленной форме, а концевое сахаридное звено показано в ацетальной форме, который, в зависимости, например, от растворителя, может быть в равновесии с альдегидной формой.

Термин «гидроксиалкилкрахмал», используемый в настоящем изобретении, не ограничивается соединениями, где концевая углеводородная часть включает гидроксиалкильные группы R₁, R₂ и/или R₃, как изображено для краткости в формуле (I), но также относится к соединениям, в которых, по меньшей мере, одна гидроксигруппа, которая присутствует или в концевой углеводородной части, и/или в остающейся части молекулы крахмала HAS', замещена гидроксиалкильной группой R₁, R₂ и/или R₃.

Возможен также гидроксиалкилкрахмал, включающий две или более различные гидроксиалкильные группы.

По меньшей мере, одна гидроксиалкильная группа, включенная в HAS, может содержать две или более гидроксигруппы. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, по меньшей мере, одна гидроксиалкильная группа, включенная в HAS, содержит одну гидроксигруппу.

Выражение «гидроксиалкилкрахмал» также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В этом контексте предпочтительно, чтобы алкильная группа была замещена галогеном, особенно фтором. Или арильной группой. Кроме того, гидроксигруппа гидроксиалкильной группы может быть превращена в сложный или в простой эфир.

Кроме того, вместо алкила можно использовать линейные или разветвленные замещенные или незамещенные алкеновые группы.

Гидроксиалкилкрахмал представляет собой эфирное производное крахмала. Кроме указанных эфирных производных, также другие производные крахмала можно использовать в контексте настоящего изобретения. Например, могут использоваться производные, которые включают этерифицированные гидроксигруппы. Эти производные могут, например, представлять собой производные незамещенных моно- или дикарбоновых кислот с 2-12 атомами углерода или их замещенных производных. Особенно полезными являются производные незамещенных монокарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, особенно производные уксусной кислоты. В этом контексте предпочтительны ацетилкрахмал, бутилкрахмал и пропилкрахмал.

Кроме того, предпочтительны производные незамещенных дикарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода.

В случае производных дикарбоновых кислот полезно, чтобы вторая карбоксигруппа дикарбоновой кислоты была также этерифицирована. Кроме того, производные сложных моноалкиловых эфиров дикарбоновых кислот также подходят в контексте настоящего изобретения.

Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот замещающие группы могут быть предпочтительно такими же, как указано выше для замещенных алкильных остатков.

Методики этерификации крахмала известны в данной области (см., например, (Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, в частности, глава 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, используется гидроксиалкилкрахмал в соответствии с формулой (I). В формуле (I) конкретно описанное сахаридное кольцо и остаток, обозначенный как HAS', вместе представляют предпочтительную молекулу гидроксиалкилкрахмала. Другие структуры сахаридного кольца, содержащиеся в HAS', могут быть такими же или отличными от конкретно описанного сахаридного кольца.

Что касается остатков R₁, R₂ и R₃ в соответствии с формулой (I), то нет конкретных ограничений. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, R₁, R₂ и R₃ представляют собой независимо водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 2 до 10 атомов углерода в соответствующем алкильном остатке. Предпочтительны водород и гидроксиалкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов. Предпочтительнее гидроксиалкильная группа имеет от 2 до 6 атомов углерода, предпочтительнее от 2 до 4 атомов углерода, еще предпочтительнее от 2 до 4 атомов углерода. Поэтому «гидроксиалкилкрахмал» предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, причем гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал являются особенно предпочтительными, а гидроксиэтилкрахмал является особенно наиболее предпочтительным.

Алкильная, арильная, аралкильная и алкарильная группа может быть линейной или разветвленной и подходящим образом замещенной.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где R₁, R₂ и R₃ представляют собой независимо водород или линейную или разветвленную гидроксиалкильную группу с 1-6 атомами углерода.

Таким образом, R₁, R₂ и R₃ предпочтительно могут представлять собой гидроксигексил, гидроксипентил, гидроксибутил, гидроксипропил, такой как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2-гидроксиизопропил, гидроксиэтил, такой как 2-гидроксиэтил, причем водород и 2-гидроксиэтильная группа особенно предпочтительны.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где R₁, R₂ и R₃ представляют собой независимо водород или 2-гидроксиэтильную группу, причем особенно предпочтителен вариант осуществления, где, по меньшей мере, один остаток R₁, R₂ и R₃ представляет собой 2-гидроксиэтил.

Гидроксиэтилкрахмал (HES) наиболее предпочтителен для всех вариантов осуществления настоящего изобретения.

Поэтому настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал и полимерное производное представляет собой производное гидроксиэтилкрахмала.

Гидроксиэтилкрахмал (HES) представляет собой производное природного амилопектина, и он разрушается альфа-амилазой в организме. HES представляет собой замещенное производное углеводородного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% мас. HES проявляет преимущественные биологические свойства и используется в качестве средства для замещения объема крови и при гемодилюционной терапии в клиниках (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278;. и Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,494-498).

Амилопектин состоит из глюкозных частей, где в основной цепи присутствуют альфа-1,4-гликозидные связи, и в ответвляющихся участках обнаруживаются альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы определяются главным образом типом гликозидных связей. Вследствие альфа-1,4-гликозидной связи в виде «зарубки» получаются спиральные структуры примерно с шестью мономерами глюкозы на один виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера можно модифицировать замещением. Введение гидроксиэтильной группы может быть достигнуто посредством щелочного гидроксиэтилирования. Подбором условий реакции можно использовать различную реакционную способность соответствующей гидроксигруппы у незамещенного мономера глюкозы в отношении гидроксиэтилирования. Благодаря этому факту специалист может в некоторой степени повлиять на тип замещения.

HES главным образом характеризуется распределением молекулярной массы и степенью замещения. Существуют две возможности описания степени замещения:

1. Степень можно описать относительно части замещенных мономеров глюкозы в отношении всех глюкозных частей.

2. Степень замещения можно описать в виде молярного замещения, где описывается количество гидроксиэтильных групп на одну глюкозную часть.

В контексте настоящего изобретения степень замещения, обозначенная как DS, относится к молярному замещению, как описано выше.

Растворы HES присутствуют в виде полидисперсных композиций, где каждая молекула отличается от другой в отношении степени полимеризации, количества и типа участков ответвления и типа замещения. Поэтому HES представляет собой смесь соединений с различной молекулярной массой. Следовательно, определенный раствор HES определяется средней молекулярной массой с помощью статистического средства. В этом контексте M_n рассчитывается в виде арифметической средней величины, зависящей от количества молекул. Альтернативно M_w (или MW), средняя величина массы, представляет единицу, которая зависит от массы HES.

В контексте настоящего изобретения гидроксиэтилкрахмал может предпочтительно иметь среднюю молекулярную массу (среднюю величину массы) от 1 до 300 кДа. Гидроксиэтилкрахмал может, кроме того, проявлять предпочтительную молярную степень замещения от 0,1 до 0,8 и предпочтительное соотношение между замещением

С₂:С₆ в диапазоне от 2 до 20 в отношении гидроксиэтильных групп.

Термин «средняя молекулярная масса», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к массе, определенной в соответствии с Sommermeyer et al, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; и Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,494-498.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от 1 до 300 кДа, предпочтительнее от 2 до 200 кДа, предпочтительнее от 4 до 130 кДа, предпочтительнее от 4 до 70 кДа.

Примером HES со средней молекулярной массой примерно 130 кДа является Voluven® от компании Fresenius. Voluven® представляет собой искусственный коллоид, используемый, например, для замещения объема, используемого при терапевтическом показании для лечения и профилактики гиповолемии. Характеристиками Voluven® являются средняя молекулярная масса 130000 +/- 20000 Да, молярное замещение 0,4 и соотношение С2 : С6 примерно 9:1.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, как описано выше, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиалкилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу от 4 до 70 кДа.

Предпочтительными диапазонами средней молекулярной массы являются: от 4 до 70 кДа, или от 10 до 70 кДа, или от 12 до 70 кДа, или от 18 до 70 кДа, или от 50 до 70 кДа, или от 4 до 50 кДа, или от 10 до 50 кДа, или от 12 до 50 кДа, или от 18 до 50 кДа, или от 4 до 18 кДа, или от 10 до 18 кДа, или от 12 до 18 кДа, или от 4 до 12 кДа, или от 10 до 12 кДа или от 4 до 10 кДа.

В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне от более чем 4 кДа и ниже 70 кДа, например, примерно 10 кДа, или в диапазоне от 9 до 10 кДа, или от 10 до 11 кДа, или от 9 до 11 кДа, или примерно 12 кДа, или в диапазоне от 11 до 12 кДа, или от 12 до 13 кДа, или от 11 до 13 кДа, или примерно 18 кДа, или в диапазоне от 17 до 18 кДа, или от 18 до 19 кДа, или от 17 до 19 кДа, или примерно 50 кДа, или в диапазоне от 49 до 50 кДа, или от 50 до 51 кДа, или от 49 до 51 кДа.

Что касается степени замещения (DS), то она составляет предпочтительно, по меньшей мере, 0,1, предпочтительнее, по меньшей мере, 0,2, и предпочтительнее, по меньшей мере, 0,4. Предпочтительными диапазонами DS являются от 0,1 до 0,8, предпочтительнее от 0,2 до 0,8, предпочтительнее от 0,3 до 0,8 и еще предпочтительнее от 0,4 до 0,8, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,7, предпочтительнее от 0,2 до 0,7, предпочтительнее от 0,3 до 0,7 и предпочтительнее от 0,4 до 0,7. Особенно предпочтительными величинами DS являются, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, причем более предпочтительными являются 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 0,6, 0,7 или 0,8, еще более предпочтительными являются 0,3, 0,4, 0,5 0,6, 0,7 или 0,8, и особенно предпочтительными являются, например, 0,4 и 0,7.

Особенно предпочтительными комбинациями молекулярной массы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно, гидроксиэтилкрахмала, и степени его замещения DS являются, например, 10 кДа и 0,4, или 10 кДа и 0,7, или 12 кДа и 0,4, или 12 кДа и 0,7, или 18 кДа и 0,4, или 18 кДа и 0,7, или 50 кДа и 0,4, или 50 кДа и 0,7.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидроксиэтилкрахмал (используемый, а также содержащийся в описанных здесь конъюгатах) имеет молекулярную массу от примерно 20 кДа до примерно 130 кДа (т.е. примерно 40 кДа, примерно 50 кДа, примерно 60 кДа, примерно 70 кДа, примерно 80 кДа, примерно 90 кДа, примерно 100 кДа, примерно 110 кДа, примерно 120 кДа, примерно 130 кДа), предпочтительно среднюю молекулярную массу от примерно 30 кДа до примерно 100 кДа, предпочтительнее от примерно 40 до примерно 70 кДа, и степень замещения от 0,4 до 0,8, предпочтительнее от 0,5 до 0,8.

В этом контексте термин «примерно 30 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 25 до 34 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 кДа или 34 кДа.

В этом контексте термин «примерно 40 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 35 до 44 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43 кДа или 44 кДа.

В этом контексте термин «примерно 50 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 45 до 54 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53 или 54 кДа.

В этом контексте термин «примерно 60 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 55 до 64 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63 кДа или 64 кДа.

В этом контексте термин «примерно 70 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 65 до 74 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 66, 67, 68, 59, 71, 72, 73 кДа или 74 кДа.

В этом контексте термин «примерно 80 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 75 до 84 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83 кДа или 84 кДа.

В этом контексте термин «примерно 90 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 85 до 94 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 86, 87, 88, 89, 41, 92, 93 кДа или 94 кДа.

В этом контексте термин «примерно 100 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 95 до 104 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103 кДа или 104 кДа.

В этом контексте термин «примерно 110 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 105 до 114 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113 кДа или 114 кДа.

В этом контексте термин «примерно 120 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 115 до 124 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123 кДа или 124 кДа.

В этом контексте термин «примерно 130 кДа» подразумевается как относящийся к средней молекулярной массе в диапазоне от 125 до 134 кДа, т.е. включая также крахмалы, имеющие среднюю молекулярную массу 126, 127, 128, 129, 131, 132, 133 кДа или 134 кДа.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 30 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 40 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 60 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 70 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 80 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гидроксилэтилкрахмал, а также описанные здесь способы, использующие гидроксилэтилкрахмал), который имеет среднюю молекулярную массу примерно 90 кДа и степень замещения 0,4, или 0,5, или 0,6, или 0,7, или 0,8, предпочтительно 0,6, 0,7 или 0,8.

Соответственно, описанный выше вариант осуществления включает гидроксиэтилкрахмал (и описанные здесь конъюгаты, включающие гид