Способ ферментации растительного материала и культивирования бактерий, экстракт ферментированного растительного материала, порошок экстракта ферментированного растительного материала и их применение

Способ ферментации растительного материала и культивирования бактерий, экстракт ферментированного растительного материала, порошок экстракта ферментированного растительного материала и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа ферментации и культивирования для получения иммуностимулятора, который безопасен при добавлении в лекарственные препараты, препараты для животных, квазилекарства, косметику, продукты питания, функциональные продукты питания, кормовые продукты и моющие средства для млекопитающих, включая людей (особенно домашних животных, домашних питомцев и т.п.), птиц (особенно выращиваемых цыплят, домашних птиц и т.п.), амфибий, рептилий, рыб (особенно выращиваемых рыб, домашних рыбок и т.п.) и беспозвоночных, способа получения экстракта ферментированного растения, экстракта ферментированного растения, содержащего иммуностимулятор, полученный способом ферментации и культивирования, порошка, содержащего иммуностимулятор, полученный из экстракта ферментированного растения, и композиции экстракта ферментированного растения, содержащей экстракт ферментированного растения.

Предшествующий уровень техники

Актуальной проблемой является обеспечение предотвращения заболевания и способов терапии, включая технологию профилактики инфицирования млекопитающих, включая человека (особенно домашних животных, домашних питомцев и т.п.), птиц (особенно выращиваемых цыплят, домашних птиц и т.п.), амфибий, рептилий, рыб (особенно выращиваемых рыб, домашних рыбок и т.п.) и беспозвоночных. Более того, для достижения этого чрезвычайно необходимы способы без использования химических реагентов, без загрязнения окружающей среды, без получения резистентных бактерий и накапливания в человеческом организме. Авторы настоящего изобретения уже обнаружили для перечисленных выше проблем, что иммуностимуляторы растительного происхождения, такие как водный экстракт пшеницы, надежно предотвращают заболевание и имеют терапевтический эффект (патентный документ 1, непатентный документ 1). Также для достижения указанного выше эффекта авторы настоящего изобретения установили, что существует возможность использовать низкомолекулярные липополисахариды, полученные из Pantoea agglomerans, который является симбиотической бактерией для пшеницы (непатентный документ 2). При этом недавние исследования показали, что различные вещества в дополнение к липополисахаридам проявляют иммунопотенциирующий (иммуностимулирующий) эффект, и это множество натуральных материалов, содержащих иммуностимулятор, привлекло внимание.

Технология ферментации с использованием микроорганизмов используется обычно не только в пищевой промышленности, но также и в более широких областях. Ферментация широко применялась для получения спиртов, включая вина, получения соусов из сои и паст из бобов сои, продуктов ферментации молока, таких как сыры, и для получения лекарственных препаратов. Существует много микроорганизмов, используемых для этих видов ферментации, и примерами являются дрожжи рисового солода (гриб) и молочные бактерии, но редки случаи применения грамотрицательных бактерий. В основном ферментация является явлением, при котором органическая материя разлагается под действием микроорганизма, и подразумевает, в широком смысле, образование микроорганизмом полезного вещества (непатентный документ 3). Примеры использования микроорганизмов в ферментации включают виноделие. Виноделие является технологией ферментации с использованием адгезии дрожжей к кожице винограда и ее продуктом является спирт. В технологии ферментации с использованием микроорганизма известны использование как таковых грамотрицательных бактерий, ферментации метана с использованием метановых бактерий, уксусной ферментации с использованием уксусных грибков и ферментации этанола (ферментация текилы) из корневища американской агавы, с применением Zymomonas mobilis, но едва ли известна ферментация культуры с использованием съедобного растения в качестве материала и микроорганизма, характеризующегося симбиотическим взаимодействием с растением, и данный иммуностимулятор никогда не привлекал внимания как продукт ферментации. Кроме того, способ ферментации и культивирования с целью получения иммуностимулятора никогда не привлекал внимания.

При этом, при проведении ферментации с помощью микроорганизма, в основном, существуют условия питания для роста микроорганизма, которым ферментируемый субстрат должен соответствовать. То есть присутствие веществ, потребляемых микроорганизмом в качестве питательных веществ, необходимо, например в качестве источников углерода содержатся в достаточном количестве моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза. Следовательно, фрукты, такие как богатый фруктозой виноград, могут быть использованы в качестве субстрата ферментации без проведения какой-либо обработки. Однако в других случаях необходима предварительная обработка, такая как нагревание и обработка ферментом для ферментации данным микроорганизмом. Например, вышеуказанный Zymomonas mobilis представляет собой микроорганизм, применяемый для ферментации текилы. В этом случае полисахариды, полученные из корневищ американской агавы, которая не является съедобным растением, преобразуют в ферментируемые моносахариды нагреванием, и далее моносахариды ферментируются микроорганизмом с получением спирта в качестве продукта ферментации. Следовательно, когда создают культуру ферментации с помощью обычного микроорганизма, полисахариды, такие как крахмал, не приемлемы в качестве субстрата ферментации. Например, описан факт, что Pantoea agglomerans не может разлагать крахмал (непатентный документ 4).

Авторы изобретения показали, что активный компонент для потенцирования иммунитета содержится в водном экстракте пшеничной муки (непатентный документ 5). Авторы изобретения также показали, что активные компоненты содержатся в пищевых зернах (пшеница, рис), водорослях (бурых водорослях, ламинарии, hijiki (brown alga) и красных водорослях) и бобах (соевых бобах и фасоли адзуки) (непатентный документ 6). Что касается биологической активности, было обнаружено, что эти объекты имеют профилактическое действие в отношении болезней человека и мышей (диабета, гиперлипидемии, атопического дерматита, рака) и могут быть эффективными в профилактике инфекций у рыб, ракообразных и цыплят (патентный документ 1, непатентный документ 1). Однако для возможности ожидания вышеуказанного эффекта действия водного экстракта пшеничной муки необходимо принимать внутрь пшеничную муку в большом количестве.

При этом Pantoea agglomerans является бактерией, которая живет симбиотически взаимодействуя с пшеницей, и, как полагают, является применимой в культивировании пшеницы, так как бактерия обеспечивает пшеницу фосфором и азотом (непатентный документ 7). Также Pantoea agglomerans откладывается не только на пшенице, но и на эпидермисе груш и яблок. В Европе было показано, что болезни гниения, вызванные грибами, могут быть предотвращены в момент оседания этой бактерии, и преимущественным было развитие использования этой бактерии в качестве экологически безвредного нетоксичного фунгицида (непатентный документ 8). Было определено, что симбиоз является «явлением, при котором чужеродные организмы живут вместе. В этом случае традиционно подразумевается сохранение поведенчески или физиологически близкого взаимодействия. Следовательно, под эту концепцию не попадает проживание только в одной и той же среде обитания. Симбиоз классифицируется и делится на различные категории в зависимости от смысла жизнедеятельности и важности симбиотического партнера, устойчивости взаимодействия и пространственного расположения симбиотического партнера. В основном, симбиоз в широком смысле делится на три типа, мутуализм, комменсализм и паразитизм на основе присутствия или отсутствия пользы/вреда симбиотического партнера» (непатентный документ 9). Известно, что Pantoea agglomerans отделена от пшеницы в каких-либо регионах и каких-либо типах (непатентный документ 5) и также отделена от фруктов (непатентные документы 10, 11). Было показано, что Pantoea agglomerans защищает растения от грибков или других бактерий за счет продукции антибиотиков (непатентные документы 12, 13) и осуществляет фиксацию фосфора и азота (непатентный документ 7). Следовательно, полагают, что Pantoea agglomerans всегда присутствует в растениях и играет роль, приносящую пользу растениям. Таким образом, характер ее жизнедеятельности определяется как «симбиоз», но не «паразитизм». Кроме того, авторы показали, что активный компонент для потенцирования иммунитета содержится в Pantoea agglomerans. Также авторы обнаружили, что низкомолекулярный липополисахарид, полученный из этой бактерии, имеет профилактическое действие в отношении заболеваний человека и мышей (диабета, гиперлипидемии, атопического дерматита, рака) и эффективен для профилактики инфекции у рыб, ракообразных и цыплят (патентный документ 3, непатентный документ 2).

В таком случае авторы прониклись идеей создания способа получения экстракта ферментированного растения, с использованием Pantoea agglomerans в качестве способа получения безопасного и недорогого иммуностимулятора. То есть авторы изобретения сфокусировались на (1) недорогом культивировании Pantoea agglomerans, используя среду, содержащую основные белковые компоненты, включенные в раствор для культивирования, полученный из растений, так же как и компонент, ферментирующий растение, и (2) получении материалов обогащенных Pantoea agglomerans, содержащимся в растении или продукте ферментации, таким образом, получая лекарственные препараты, препараты для животных, квазилекарства, косметику, функциональные продукты питания, продукты питания, кормовые продукты и моющие средства для млекопитающих, включая людей (особенно домашних животных, домашних питомцев и т.п.), птиц (особенно выращиваемых цыплят, домашних птиц и т.п.), амфибий, рептилий, рыб (особенно выращиваемых рыб, домашних рыбок и т.п.) и беспозвоночных. Однако это не означает, что микроорганизм, живущий в симбиотическом взаимодействии с растением, может напрямую использовать растительные компоненты, например материал из съедобного растения в качестве субстрата для ферментации. Например, пшеничная мука является сложным органическим веществом, состоящим из крахмала и ему подобных веществ, присутствующих в зернах пшеницы, но выделенная Pantoea agglomerans, которая является симбиотическим микроорганизмом внешней оболочки пшеницы, не имеет с ней прямого контакта. Таким образом, с помощью симбиотического взаимодействия пшеницы и микроорганизма нельзя показать, может ли Pantoea agglomerans ферментировать пшеницу и быть культивируемым с использованием пшеницы или нет. Действительно, неизвестны и совсем не опубликованы данные о способности Pantoea agglomerans ассимилировать пшеничную муку. Напротив, на основании общеизвестных фактов было описано, что Pantoea agglomerans не может использовать пшеничный крахмал в качестве субстрата для ферментации.

Глюциды, содержащиеся в растениях, часто сохраняются в виде крахмала, и это примечательно для съедобных растений, в частности пищевых зерен. Обычно микроорганизмы не имеют функции, в которой крахмал ассимилируется в высокой степени. В связи с этим стало известно, что часть факультативных грамотрицательных бактерий может ферментировать крахмал. Например, известно, что Erwinia способна ассимилировать крахмал. Однако в этой ферментации, когда ферментируется крахмал, подразумевается использование амилазной активности микроорганизма путем добавления микроорганизма, культивированного в большом количестве, в другую оптимальную среду, и никогда не предполагалось, что культура сама по себе создается с использованием крахмала и в связи с этим осуществляется ферментация. В традиционной технологии данная технология соответствует объективной ферментации только для эффективного использования амилазной активности микроорганизма и не планируется выращивать микроорганизм с использованием крахмала в качестве субстрата. При этом в примерах настоящего изобретения описывается, что ферментируемый продукт производится в дополнение к выращиванию микроорганизма, используя крахмал в качестве единственного источника углерода, и настоящее изобретение значительно отличается от традиционной технологии тем, что в настоящем примере имеет место не только ферментация, но также ферментация и культивирование.

С другой стороны, если определенный микроорганизм сохраняет свою функцию разложения крахмала, это напрямую не означает, что микроорганизм может расти, используя в качестве субстрата крахмал. По окончании культивирования, в случае достижения также роста микроба, количество добавляемого микроорганизма крайне мало. В этом случае, даже если микроорганизм имеет слабо выраженную амилазную активность, эта активность слишком слаба для достаточного разложения субстрата и рост микроорганизма не достигается. Действительно, было установлено, что многие микроорганизмы не могут расти, используя крахмал в качестве единственного источника углерода.

Однако если ферментация и культивирование могут быть осуществлены с использованием Pantoea agglomerans в среде, содержащей пшеничную муку в качестве основного компонента для образования экстракта ферментированного растения (здесь и далее экстракт ферментированного растения, получаемый ферментацией и культивированием Pantoea agglomerans в среде, содержащей пшеничную муку в качестве основного компонента, соответствует экстракту ферментированной пшеницы), содержащего в большом количестве недорогой иммуностимулятор, то в качестве конкретных примеров должны быть обеспечены лекарственные препараты, препараты для животных, квазилекарства, косметика, продукты питания, функциональные продукты питания, кормовые продукты и моющие средства, которые не загрязняют окружающую среду, безопасны и эффективны для профилактики инфекции у людей и в области животноводства и водных культур. Настоящее изобретение было выполнено за счет использования факта открытия того, что Pantoea agglomerans рос с использованием пшеничной муки в качестве субстрата в представленном выше контексте и за счет интенсивного проведения многих экспериментов.

Термин экстракт ферментированного растения, вводимый настоящим изобретением, является дженериковым, который включает сам культуральный раствор, полученный осуществлением ферментации и культивирования, жидкий компонент, полученный разделением твердого вещества/жидкости этого культурального раствора, и жидкий компонент, полученный воздействием процесса экстракции на твердый компонент, полученный разделением твердого вещества/жидкости, и так далее. Таким образом, экстракт ферментированного растения включает сам культуральный раствор, полученный способом ферментации и культивирования в соответствии с настоящим изобретением, и все экстракты, которые могут быть получены с использованием всего или части культурального раствора. Хотя, конечно, само собой разумеется, что данный экстракт ферментированного растения может быть обработан высушиванием, как в случае порошка экстракта ферментированного растения, или растворением экстракта ферментированного растения с получением оптимальной концентрации в подходящем растворе, например растворе фосфатного буфера, включая нормальный солевой раствор.

[патентный документ 1] японская нерассмотренная патентная заявка № Н3-218466

[патентный документ 2] японская нерассмотренная патентная заявка № Н8-198902

[патентный документ 3] WO 00/57719

[патентный документ 4] японская нерассмотренная патентная заявка № Н6-78756

[патентный документ 5] японская нерассмотренная патентная заявка № Н4-187640

[патентный документ 6] японская нерассмотренная патентная заявка № Н4-49240

[патентный документ 7] японская нерассмотренная патентная заявка № Н4-99481

[патентный документ 8] японская нерассмотренная патентная заявка № Н5-155778

[непатентный документ 1] Inagawa, H. et al., Biotherapy 5(4), p617-621, 1991

[непатентный документ 2] Soma, G. et al., «Tumor necrosis Factor: Molecular and Cellular Biology and Clinical Relevance» p203-220, 1993

[непатентный документ 3] Yamada, T. et al., «Seibutsugaku Jiten» 3^rd ed., p1021, 1983

[непатентный документ 4] Gavini, F. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 39), p337-345, 1989

[непатентный документ 5] Nishizawa, T. et al., Chem. Pharm. Bull., 40(2), p479-483, 1992

[непатентный документ 6] Inagawa, H. et al., Chem. Pharm. Bull., 40(4), p994-997, 1992

[непатентный документ 7] Neilson A. H., J. Appl. Bacteriol., 46(3), p483-491, 1979

[непатентный документ 8] Nunes, C. et al., Int. J. Food Microbiol., 70(1-2), p53-61, 2001

[непатентный документ 9] Yamada, T. et al., «Seibutsugaku Jiten» 3^rd ed., p287-288, 1983

[непатентный документ 10] Nunes, C. et al., J. Appl. Microbiol., 92(2), p247-255, 2002

[непатентный документ 11] Asis C. A. Jr. et al., Lett. Appl. Microbiol., 38(1), p19-23, 2004

[непатентный документ 12] Vanneste J. L. et al., J. Bacteriol., 174(9), p2785-2796, 1992

[непатентный документ 13] Kearnes L. P. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64(5), p1837-1844, 1998

Описание изобретения

Проблема, решаемая данным изобретением

Как уже было описано, иммуностимуляторы часто содержатся в самих растениях и часто являются компонентами или продуктами микроорганизмов, которые живут в симбиотическом взаимодействии с растениями. Следовательно, для получения иммуностимулятора из натурального продукта, безопасного при приеме, следует экстрагировать данный компонент непосредственно из съедобных растений (например, limulus-положительный гликолипид, патентный документ 1) или эффективно культивировать микроорганизм, который живет в симбиотическом взаимодействии со съедобным растением, для получения его компонента или продукта (например, низкомолекулярные липополисахариды. Патентный документ 2). Однако содержание иммуностимулятора в съедобном растении крайне мало, очень большое количество пищи должно быть усвоено для того, чтобы можно было ожидать иммуностимулирующий эффект при потреблении пищи, и, в основном, не легко сохранить потребленное количество иммуностимулятора в соответствующем виде. Таким образом, не следует ожидать его воздействия. Более того, экстракция иммуностимулятора из растения и использование его в качестве пищи или лекарства связано с большими затратами и имеет невысокую практическую значимость.

При этом при фокусировании на микроорганизмах, которые живут в симбиотическом взаимодействии с растением, Pantoea agglomerans, который является симбиотической бактерией пшеницы, содержит в качестве компонента низкомолекулярный липополисахарид, эффективный для иммуностимуляции. Однако до настоящего времени для экстракции низкомолекулярного липополисахарида было необходимо культивировать Pantoea agglomerans, используя дорогую среду, в которой основной белок, содержащийся в среде, имеет животное происхождение, например NZ амин, триптон или казамино кислоты. Следовательно, было затруднительно недорого обеспечить высокодоступный иммуностимулятор. Одновременно, не может быть отклонена вероятность неизвестных вредных веществ, например, тех, что содержатся в животных, зараженных губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота (BSE).

В свете вышеуказанных проблем целью настоящего изобретения является обеспечение способа ферментации и культивирования, в котором иммуностимулятор может быть получен недорого и эффективно, используя безопасные материалы, экстракт ферментированного растения, полученного данным способом, порошок экстракта ферментированного растения, полученный из экстракта ферментированного растения, и композиция экстракта ферментированного растения, содержащая порошок экстракта ферментированного растения.

Средства решения данной проблемы

Способ ферментации и культивирования настоящего изобретения, включающий в себя ферментацию материала, полученного из съедобного растения и содержащего глюциды, основным компонентом которых является полисахарид, с факультативной анаэробной грамотрицательной бактерией, которая живет в симбиотическом взаимодействии именно с растением, и одновременное культивирование факультативной анаэробной грамотрицательной бактерии.

Ферментация и культивирование могут быть осуществлены простым способом ферментации крахмала как источника углерода с факультативной анаэробной грамотрицательной бактерией.

Желательно, чтобы факультативная анаэробная грамотрицательная бактерия представляла собой факультативную анаэробную бациллу.

Желательно, чтобы факультативная анаэробная бацилла принадлежала семейству Enterobacteraceae.

Желательно, чтобы факультативная анаэробная бацилла принадлежала роду Pantoea, Serratia или Enterobacter.

Используя факультативную анаэробную бациллу Pantoea agglomerans, возможно сделать крахмал источником углерода.

Также желательно, чтобы съедобное растение было выбрано из хлебных зерен, морских водорослей, бобов и их смеси.

Также желательно, чтобы съедобное растение представляло собой пищевое зерно и материал из пищевого зерна, выбранный из пшеничной муки, рисового порошка, порошка пшеничных отрубей, рисовых отрубей и осадка от саке. В частности, так как пшеничная мука содержит глютен в качестве источника белков, существует возможность ферментировать и культивировать даже без использования материала животного происхождения.

Желательно, чтобы съедобным растением была морская водоросль и материал, получаемый из морской водоросли, выбранный из порошка бурой водоросли, порошка «mekabu» (спорофилл Undaria pinnatifida) и порошка ламинарии.

Когда съедобным растением являются бобы и материалом, получаемым из бобов, являются отходы брожения бобов, данный материал содержит большое количество белка. Таким образом, существует возможность эффективно ферментировать и культивировать даже без использования материала животного происхождения.

Экстракт ферментированного растения данного изобретения получают способом ферментации и культивирования.

Порошок экстракта ферментированного растения данного изобретения получают из экстракта ферментированного растения.

Композиция экстракта ферментированного растения данного изобретения содержит экстракт ферментированного растения или порошок экстракта ферментированного растения.

Композиции экстракта ферментированного растения могут быть выбраны из лекарственных препаратов, препаратов для животных, квазилекарств, косметики, продуктов питания, функциональных продуктов питания, кормовых продуктов и моющих средств.

Желательно, чтобы экстракт ферментированного растения имел следующие физико-химические свойства.

Экстракт ферментированного растения проявляет способность к активации макрофагов даже в присутствии полимиксина В. Экстракт ферментированного растения имеет иммуностимулирующий эффект.

Желательно, чтобы факультативная анаэробная грамотрицательная бактерия представляла собой бациллу, принадлежащую роду Pantoea, и съедобное растение было выбрано из хлебных зерен, морских водорослей, бобов и их смеси.

Желательно, чтобы факультативная анаэробная грамотрицательная бактерия представляла собой Pantoea agglomerans, и съедобное растение было выбрано из хлебных зерен, морских водорослей, бобов и их смеси.

Желательно, чтобы материал, полученный из хлебного зерна, выбирали из пшеничной муки, рисового порошка, порошка пшеничных отрубей, рисовых отрубей и осадка от саке.

Желательно, чтобы материал, полученный из морской водоросли, выбирали из порошка бурой водоросли, порошка mekabu и порошка ламинарии.

Эффект изобретения

В соответствии с настоящим изобретением ввиду того, что культивирование осуществляют в среде, не содержащей компонентов животного происхождения, не существует загрязнения примесями животного происхождения. Следовательно, не существует возможности загрязнения неизвестными вредными веществами, например, полученными из BSE-носителей, и существует возможность создания в высшей степени безопасного и недорогого способа получения экстракта ферментированного растения, способного удовлетворить потребности различных назначений и безопасно и недорого обеспечить экстракт ферментированного растения или порошок экстракта ферментированного растения, содержащий иммуностимулятор. Более того, возможно обеспечить культуральный раствор, иммуностимулятор, экстракт и порошок экстракта и дополнительные лекарственные препараты, препараты для животных, квазилекарства, косметику, продукты питания, функциональные продукты питания, кормовые продукты и моющие средства, содержащие экстракт или порошок экстракта.

Никогда не предполагалось и отсутствуют факты исследований традиционной технологии ферментации, касающиеся того, что ферментация и культивирование могут быть осуществлены простым способом, так что именно материал, полученный из съедобного растения, ферментируется факультативной анаэробной грамотрицательной бактерией, которая живет в симбиотическом взаимодействии с растением и одновременно культивируется факультативная анаэробная грамотрицательная бактерия.

Это может быть использовано, если TNF продуцируется макрофагами или нет (индукционная активность TNF) в качестве индикатора того, что конкретное вещество проявляет иммуностимулирующий эффект. Более того, иммуностимулирующий эффект может быть количественно оценен с помощью измерения количества производимого TNF. Таким образом, продукция TNF макрофагами была оценена с использованием limulus-положительного растительного гликолипида, полученного из Pantoea agglomerans. Продукция TNF макрофагами была остановлена обработкой полимиксином В и в случае limulus-положительного растительного гликолипида, полученного из пшеничной муки, и в случае низкомолекулярного липополисахарида, полученного из Pantoea agglomerans. Однако во многих примерах было показано, что даже когда экстракт ферментированного растения обрабатывали полимиксином В, TNF продуцировался макрофагами. Это показывает, что экстракт ферментированного растения, полученный ферментацией и культивированием, имеет иммуностимулирующий эффект, качественно отличный от иммуностимулирующих эффектов компонентов самого растения, которое являлось материалом, и самого микроорганизма, использованного для ферментации.

Краткое описание чертежа

Чертеж - рисунок, демонстрирующий ингибирующий эффект на присутствие koi герпеса за счет кормового продукта, содержащего экстракт ферментированной пшеницы.

Наилучший режим применения изобретения

Соответствующие воплощения настоящего изобретения будут описаны в деталях ниже.

I. Существенным признаком получения экстракта ферментированного растения является использование Pantoea agglomerans.

В настоящем изобретении авторами было обнаружено впервые, что Pantoea agglomerans может расти, непосредственно используя в качестве источника углерода крахмал, и, используя Pantoea agglomerans, был создан способ для недорогого получения экстракта ферментированной пшеницы, обильно содержащего в качестве продукта ферментации и продукта культивирования иммуностимулятор. Этот способ может обеспечить экологически безвредные и безопасные квазилекарства, косметику, продукты питания, функциональные продукты питания и кормовые продукты, эффективные для профилактики инфекций у людей, и в животноводстве, и в водной культуре.

1. Выделение Pantoea agglomerans

Когда пшеничную муку суспендируют в воде и супернатант наносят на L-бульонную агаровую среду и культивируют, появляются колонии микроорганизмов. В этих колониях микроорганизмы идентифицируются стандартными методами. Например, те, что имеют свойства, одинаковые со стандартной Pantoea agglomerans, выбирают отбором колоний, которые окрашиваются как грамотрицательные, положительны в реакции анаэробного метаболизма глюкозы и отрицательны в отношении оксидазной активности и при использовании ID-теста (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd). Стандартная Pantoea agglomerans доступна из Института физических и химических исследований, Биоресурсного центра (непатентный документ 4). В следующем описании процентное соотношение является значением по массе, если не определено иначе.

2. Оценка иммуностимулирующей активности

В настоящих воплощениях в качества индикатора иммуностимулирующего эффекта, который проявляет экстракт ферментированной пшеницы, оценивалась способность активации макрофагов путем оценки продукции макрофагами TNF.

3. Низкомолекулярный липополисахарид, полученный из Pantoea agglomerans

Что касается одного из активных компонентов, иммуностимулируемых ферментацией и культивированием с использованием Pantoea agglomerans, ожидалось, что он содержит низкомолекулярный липополисахарид, полученный из Pantoea agglomerans. Низкомолекулярные липополисахариды имеют особо выраженную безопасность и исключительную биологическую активность по сравнению с обычно используемыми высокомолекулярными липополисахаридами (обычными липополисахаридами). Таким образом, измерялось содержание низкомолекулярного липополисахарида. Низкомолекулярные липополисахариды подробно описаны в патентном документе 2. Настоящие примеры касаются экстракта ферментированной пшеницы, но настоящее изобретение не подразумевает, что используемое растение ограничено пшеницей и что используемый иммуностимулятор ограничен низкомолекулярными липополисахаридами.

Pantoea agglomerans может быть культивирована и с использованием общеизвестного способа (патентный документ 2, непатентный документ 8), но основные компоненты белков, содержащихся в культуральной среде, имеют животное происхождение, и стоимость среды высока. Более того, когда животному дают функциональные продукты питания и функциональные кормовые продукты или вводят подкожно, заражение примесями животного происхождения, именно имеющими отношение к BSE, является проблемой безопасности продуктов питания, и дополнительно, производство становится дорогим и способ не имеет практической значимости. Таким образом, в качестве результата расширенного исследования для получения безвредного и недорогого натурального продукта, имеющего иммуностимулирующее действие, авторы настоящего изобретения создали способ ферментации и культивирования с использованием Pantoea agglomerans для получения экстракта ферментированной пшеницы, как это показано в примерах. Основным компонентом белка, содержащегося в культуральной среде, обычно был белок животного происхождения, а в настоящем изобретении - белок растительного происхождения. Обычно продукт, полученный разложением белка, такого как казеин, полученный из коровьего молока с помощью расщепляющего фермента, добавляли в культуральный раствор. В этом случае себестоимость литра среды составляла 250 йен, а при использовании пшеничной муки себестоимость составляет, примерно, 16 йен. Никогда не осуществлялась ферментация с целью значительного концентрирования и синергистического слияния иммуностимулирующей активности растения и микроорганизма в их симбиотическом взаимодействии.

Содержание данного изобретения будет описано ниже в виде примеров, но настоящее изобретение не ограничено применением Pantoea agglomerans, в качестве микроорганизма, пшеницы, в качестве съедобного растения, или муки, в качестве материала, описанных в настоящих примерах. Настоящее изобретение может быть также применено к материалу, полученному обычным способом из других съедобных растений, обильно содержащих иммуностимулятор, например бурых водорослей, хлебных зерен (материалом, полученным из хлебных зерен, является пшеничная мука, рисовый порошок, порошок пшеничных отрубей, рисовые отруби или осадок от саке), морских водорослей (материалом, полученным из морских водорослей, является порошок морских водорослей, порошок mekabu или порошок ламинарии) и бобов (материалом, полученным из бобов, являются отходы брожения бобов). Хорошо известно, что в этих растениях содержатся белки и сахара. Эти растения могут быть использованы для ферментации и культивирования с применением Pantoea agglomerans. Общеизвестно то, что природные бактерии, например, бактерии, относящиеся к роду Serratia или Enterobacter, живут в симбиотическом взаимодействии с этими растениями (непатентный документ 4). Само собой разумеется, что микроорганизмы, используемые для данной ферментации, включают факультативные анаэробные грамотрицательные бактерии, которые живут в симбиотическом взаимодействии с этими растениями.

II. Краткое изложение основных моментов настоящего изобретения

(1) Экстракт ферментированной пшеницы, сам по себе, как субстанция, имеющая иммуностимулирующее действие, создается путем соединения пшеницы, Pantoea agglomerans, которая является симбиотической бактерией, и продуктов ферментации, их комбинирование является новым, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

(2) Новым является получение экстракта ферментированного растения с применением Pantoea agglomerans, которая является грамотрицательной бактерией, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

III. Конкретный способ получения экстракта ферментированной пшеницы

(1) Pantoea agglomerans выделяют из пшеничной муки стандартным способом (непатентный документ 1). Будучи однажды выделенной и идентифицированной, эта бактерия может храниться в 50% глицерине.

(2) Готовят 0,05-5% раствор соли, 0,005-1 молярный фосфатный буфер, или смешанный солевой раствор (0,5-10% раствор фосфата натрия, 0,05-5% раствор дигидрофосфата калия, 0,05-5% раствор хлорида натрия, 0,05-5% раствор хлорида аммония).

(3) Пшеничную муку суспендируют в воде в концентрации 0,05-10%.

(4) Готовят 0,2-3 молярный раствор хлорида магния.

(5) Готовят 0,2-3 молярный раствор хлорида кальция.

(6) Растворы с (2) по (5), в некоторых случаях, стерилизуют автоклавированием и т.п.

(7) Растворы со (2) по (5) смешивают в соответствующих количествах и добавляют воду для создания суспензии, содержащей 0,1-5% пшеничной муки. В некоторых случаях pH нейтрализуют добавлением раствора щелочи или кислоты.

(8) В некоторых случаях пшеничный крахмал может быть частично расщеплен добавлением от 10 до 50000 единиц амилазы на литр среды в (7) и инкубированием при температуре от 10 до 80°С в течение от 1 до 24 часов.

(9) Pantoea agglomerans, выделенную в (1), добавляют в (7) или (8).

(10) (9) ферментируют при температуре от 1 до 40°С. В некоторых случаях ферментационная емкость может просто стоять или быть встряхиваемой. Альтернативно, перемешивание может быть осуществлено каждые несколько часов.

(11) (10) ферментируется в течение от 6 часов до одной недели. По мере прохождения ферментации раствор пшеничной муки приобретает желтый цвет.

(12) Необязательно может быть добавлен раствор щелочи для нейтрализации pH во время ферментации (11) или могут быть добавлены суспензия пшеничной муки или неорганические соли.

(13) Ферментация заканчивается, и твердый компонент собирают в виде осадка центрифугированием (1000-5000 об/мин, 10-60 минут). Осадок может быть непосредственно использован в качестве продукта ферментации пшеничной муки для кормовых продуктов или в качестве сырья для смешивания с кормовым материалом.

(14) В случае получения экстракта ферментированной пшеницы (13) суспендируют в воде или солевом буфере, который затем нагревают при температуре от 80 до 140°С в течение от 10 минут до 6 часов. Твердый компонент может быть удален центрифугированием или фильтрованием. Вода или буфер могут быть добавлены снова к удаленному осадку для повторной экстракции с нагреванием в течение нескольких раз.

(15) Экстракт ферментированной пшеницы, полученный в (14), может быть далее просто очищен, в зависимости от предполагаемых нужд. Таким образом, осадок образуется, когда соль, такую как хлорид натрия, в конечной концентрации 0,05-1 моль/л добавляют к экстракту (14), и далее добавляют растворитель, такой как этанол, от одного до трехкратного количества по отношению к количеству экстракта. Осадок может быть собран центрифугированием. Осадок может быть далее промыт растворителем, таким как этанол. При высушивании осадка может быть получен порошок.

А. ПРИМЕРЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К СПОСОБУ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ ПШЕНИЦЫ

Пример 1

Исследование роста Pantoea agglomerans в среде, содержащей пшеничную муку

Для того чтобы подтвердить, является ли Pantoea agglomerans природной симбиотической бактерией для пшеницы, способной расти, используя пшеничную муку в качестве источника углерода, оценивался рост Pantoea agglomerans в среде, содержащей пше