Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме

Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме

Реферат

Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве.

Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например карбактин, карболонг, микросорб, полифепан и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1978, с.132-133; патент РФ N 2029546, МПК⁶ А61K 9/16, опубл. 27.02.95 г.), природные материалы и их аналоги (кристаллическая микроцеллюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.

Однако энтеросорбенты не устраняют причин вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов (витаминов, гормонов) и не обеспечивают активно нормализацию микробиоценоза.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Для нормализации микробиоценоза широкое распространение получили препараты живых бактериальных клеток: бифидобактерий (межд. заявка (WO) N 85/03848), МКИ А23С 9/12, опубл. 12.09.85 г.), лактобактерий (заявка ЕПВ N 0154614, МКИ А23С 9/123, опубл. 11.09.85 г.) и колибактерий и т.д.

Недостатком этих препаратов являются довольно короткие сроки их хранения, если они находятся в жидкой форме или высокая стоимость, если они изготовлены в сухой форме, а также слабая устойчивость к инактивирующим факторам внешней среды и желудочно-кишечного тракта организма при применении.

Известен комплексный препарат, включающий пористый неорганический носитель и иммобилизованные на нем клетки микроорганизмов (заявка ФРГ №3410650, МКИ С12N 11/14, опубл. 03.10.85 г.). В качестве носителей применяют сталактитовые подложки с двойной структурой пор. Подложки имеют сквозные макропоры, которые делают возможным свободный обмен жидкости и газа из внутренней части носителя в окружающую среду. Размер макропор лежит в пределах величины клеток микроорганизмов.

Недостатком данного препарата является то, что он не предназначен для использования в качестве медицинского или ветеринарного препарата в связи с отсутствием данных о влиянии сталактитового носителя с нанесенными на нем микроорганизмами на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта организма человека или животного.

Известен комплексный фармацевтический препарат, включающий фармацевтически приемлемый носитель и иммобилизованные на нем микроорганизмы (межд. заявка (WO) №91/09608, МКИ А61K 35/74, опубл. 11.07.91 г.). Носитель не нарушает жизнеспособности микроорганизмов. В качестве микроорганизмов используют штамм L1a Streptococcus lactis. Препарат предназначен для борьбы с патогенной микрофлорой кишечника человека и животных, вызывающей диарею и другие желудочно-кишечные расстройства.

Недостатком препарата является то, что используемый в нем штамм L1a Streptococcus lactis влияет в основном на патогенную микрофлору кишечника человека и животных, т.е. проявляет антагонистические свойства, но слабо участвует в восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Кроме того, отсутствуют данные об антацидных свойствах носителя, что свидетельствует о слабой защите носителем иммобилизованных клеток Streptococcus lactis при действии внутренней среды организма с низкими значениями рН.

Известен комплексный бактериальный препарат, включающий носитель и иммобилизованные на нем микробные клетки в концентрации на 1 мм² 2,1×10³-1,0×10⁵ (патент РФ №2017486, МПК⁶ А61K 31/00, опубл. 15.08.94 г.). В качестве носителя используют активированный уголь в виде порошка с размером частиц менее 30 мкм, а в качестве микроорганизмов используют лактобактерии и кишечные палочки.

Недостатком такого препарата является то, что активированный уголь, используемый в качестве носителя, является тонкопористым сорбентом с преобладанием микропор и высокой удельной поверхностью. Вследствие этого микробные клетки расположены на поверхности частиц сорбента и недостаточно защищены при неблагоприятном воздействии окружающей среды. Активированные угли активно поглощают низкомолекулярные биологически активные вещества, витамины и газы кишечника, что ухудшает работу перистальтики. Они быстро забиваются и работают преимущественно в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Кроме того угли не обладают антацидными свойствами, что не способствует выживаемости нанесенных на них клеток при действии сред с низкими значениями рН. Препарат не предусматривает использование одновременно нескольких штаммов микроорганизмов разных видов, например смеси бифидо- и лактобактерии, что значительно снижает эффективность действия препарата особенно при восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Известен препарат-пробиотик в иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас.%: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл - 1,0-50,0; носитель-сорбент - остальное до 100%. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ, модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (патент РФ №2118535, МПК⁶ А61K 35/74, опубл. 10.09.98 г.).

Однако используемые в указанном препарате сорбенты обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.

Известен способ получения комплексного препарата бактерий- эубиотиков (патент РФ №2067114, МПК А61K 35/74, опубл. 27.09.96 г.), включающий выращивание в условиях глубинного культивирования культуры штаммов бифидобактерий и стрептококка, смешивание биомассы с защитной средой следующего состава (мас.%): сахароза 25-30; желатин 2-3; сухое молоко 3-5; глутамат натрия 0,5-1 и контактно-сорбционное обезвоживание целевого продукта, которое проводят охлажденным до минус 8-10°С сорбентом, например окисью алюминия, с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:10-12 соответственно, а досушивание осуществляют в течение 18-20 часов при температуре 0-5°С в замкнутом объеме.

Однако используемый в указанном способе сорбент обладает недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.

Известен препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизованной форме (патент РФ №2164801, МПК А61K 35/74, опубл. 10.04.01). Препарат включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток, согласно изобретению препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы): глутаминовая кислота - 15,0-68,0; глутамин - 8,0-20,0; лейцин - 10,0-50,0; аргинин - 20,0-30,0; цистеин - 50,0-80,0 при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г - 0,1-10,0; защитная среда - 0,1-10,0; носитель-сорбент - остальное - до 100%. В качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%: желатин - 8,5-11,5; аскорбиновая кислота - 0,8-1,2; хлористый натрий - 1,7-3,0; сахароза - остальное до 100%. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом. Препарат в качестве бактерий-пробиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа АВ, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1:(8-9) соответственно. В качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidum bifidum №1, или №791, или ЛВА-3, или Bifidobacterium longum 379, или Bifidobacterium adolescentis MC-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.

Однако используемые в указанном препарате сорбенты также обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков. Кроме того, наблюдается низкая колонизационная активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизованной форме (заявка на патент РФ №2006100740/15, МПК А61K 35/74, опубл. 10.07.07), включающий носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, модифицированный углеродом с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном носителе-энтеросорбенте. Клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1, в качестве которого используют 3%-ный раствор сульфата магния, при следующем соотношении компонентов препарата в лиофилизированном виде, мас.%:

клетки с питательной средой консорциума бифидо-,
или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь
с титром 108-1010 КОЕ/г	1,0-10,0
защитная среда	0,1-10,0
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
раствором соли металла	остальное до 100%

В качестве консорциума бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13 и Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1. В качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 4: 1,0: 1,0. Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.

Однако используемый химически модифицированный энтерособент СУМС-1 имеет высокую стоимость: он дороже угольных сорбентов (например, СУ ГС, СКС, ВНИИТУ-2) в четыре-пять раз. Кроме того, для обеспечения десорбции бактерий в кишечнике необходимо проводить химическую модификацию поверхности энтеросорбента СУМС-1, вследствие чего значительно усложняется технологический процесс получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной форме.

Техническим результатом заявляемого технического решения является создание более простого в изготовлении и более дешевого комплексного препарата-пробиотика в сухой иммобилизованной форме, который обеспечивал бы более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом, определяющую его клиническую эффективность и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.

Указанный технический результат достигается тем, что в комплексном препарате-пробиотике, включающем носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном энтеросорбенте, согласно изобретению клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г, а в качестве пористого энтеросорбента он содержит углеродный энтеросорбент ВНИИТУ-2, при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%:

клетки с питательной средой консорциума бифидо-,
или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь
с титром 108-1010 КОЕ/г	1,0-10,0
защитная среда	0,1-10,0
углеродный энтеросорбент ВНИИТУ-2	остальное до 100%

В качестве консорциума штаммов бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799, Bifidobacterium longum ВКПМ В-5894, в соотношении 8:2, или Bifidobacterium bifidum 791 БАГ, Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799, Bifidobacterium longum ВКПМ В-5894 в соотношении 6:3:1, или Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799, Bifidobacterium longum ВКПМ AC-1252 и/или Bifidobacterium longum ВКПМ AC-1530 в соотношении 8:1:1, или Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799, Bifidobacterium longum ВКПМ В-5894 и Bifidobacterium adolescentis ВКПМ В-2944 в соотношении 6:3:1 или Bifidobacterium bifidum ВКПМ В-5799, Bifidobacterium longum ВКПМ AC-1252 и Bifidobacterium adolescentis ВКПМ AC-1245 в соотношении 8:1:1.

В качестве консорциума штаммов лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий: Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-4108, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5002; Lactobacillus casei ВКПМ В-5724, Lactobacillus casei ВКПМ В-3960 в соотношении 1:1:1:1:4:4.

Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.

Концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь приготовлен на питательной среде, содержащей обезжиренное молоко, нормализованное по сухому обезжиренному молочному остатку СОМО 13,5-15,0% с добавлением глюкозы и натрия лимоннокислого при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Глюкоза	1,5-2,5
Натрий лимоннокислый	0,15-0,25
Обезжиренное молоко, нормализованное
по сухому обезжиренному молочному остатку
СОМО 13,5-15%	остальное

В обезжиренной молочной среде искусственно увеличивают в 1,3-1,5 раза концентрацию белков и лактозы внесением сухого молока так, чтобы сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) достигал 13,5-15,0%. Чем выше содержание СОМО, тем выше содержание казеина, который образует буферную систему, связывая большое количество кислых метаболитов в казеинаты. Тем самым удается сдерживать нарастание кислотности среды при росте биомассы. Чем выше содержание лактозы, тем выше ростовые свойства среды - увеличение содержания лактозы на 25-30% повышает титр бифидо- и/или лактобактерий. Для предотвращения коагуляции казеина в молочную основу вводят раствор натрия лимоннокислого, который обладает сильными стабилизирующими и буферными свойствами. Кроме того, для повышения ростовых свойств молочной питательной среды вводят глюкозу в качестве дополнительного источника энергии, который способствует значительному увеличению содержания бифидо- и лактобактерий с 10⁹ до 10¹⁰ КОЕ/мл.

В результате удается существенно увеличить титр в процессе получения биомассы концентрата консорциума бифидо- и лактобактерий и сохранить их титр в процессе лиофильной сушки готовой формы препарата в иммобилизованной форме.

Препарат с содержанием микробной биомассы менее 0,1 мас.% имеет низкий биотитр с преобладанием прочно связанных с сорбентом клеток, т.е. действует преимущественно как энтеросорбент. Количество микробных клеток, вводимых в препарат, не превышает 15 мас.%, вследствие чего вся биомасса бактерий препарата находится в защищенном состоянии. При этом углеродный энтеросорбент ВНИИТУ- 2 в препарате сохраняет основные свои свойства, обеспечивающие связывание и выведение из кишечника токсинов, продуктов незавершенного метаболизма и патогенных микроорганизмов.

Штамм бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5799. Штамм Bifidobacterium longum ДВА-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5894. Штамм Bifidobacterium adolescentis ГО-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В-2944. Штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ депонирован в коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор» №В-686. Штамм Bifidobacterium longum Я-3 депонирован в ВНИИгенетика в ВКПМ под №АС-1252. Штамм Bifidobacterium longum 17X депонирован в ВНИИгенетика в ВКПМ под №АС-1530. Штамм Bifidobacterium adolescentis ГО-4А депонирован в ВНИИгенетика в ВКПМ под № АС-1245.

Штаммы лактобактерий депонированы: Lactobacillus acidophilus 57S депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863; Lactobacillus acidophilus К-1-С депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 4108; Lactobacillus plantarum П-75 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962; Lactobacillus plantarum 337D депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5002; Lactobacillus casei C-1 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3960; Lactobacillus casei Сб депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В-5724.

Введение в препарат сухой микробной биомассы с биотитром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г обеспечивает ему оптимальную биологическую активность. Если исходная микробная биомасса имеет титр меньше 10⁸ КОЕ/г, то препарат обладает недостаточной биологической активностью и при введении в желудочно-кишечный тракт проявляет слабый лечебно-профилактический эффект. Титр сухой микробной биомассы более 10¹⁰ КОЕ/мл значительно увеличивает стоимость препарата без значительного увеличения лечебно-профилактического эффекта.

Основу жидкой бактериальной суспензии для сушки составляют клетки-эубиотики в молочной питательной среде с повышенным титром клеток (10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл) - жидкий концентрат бифидобактерий. Молочная питательная среда с клетками-эубиотиками содержит повышенное количество белка (не менее 13% СОМ - сухого остатка молока). Это позволяет увеличить антибиотические свойства бактерий- пробиотиков в препарате. Кроме того, повышенное количество белка увеличивает антацидные свойства препарата.

Высокая концентрация клеток в жидкой бактериальной суспензии позволяет их использовать в препарате в сухом виде в концентрации 1,0-15,0% с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл.

Носитель-сорбент представляет собой механически прочные частицы порошка, или гранулы, или таблетки, выполненные из нового углеродного энтеросорбента - ВНИИТУ-2, разработанный в Конструкторско-Технологическом Институте Технического Углерода Сибирского Отделения РАН (г.Омск). Отличительными особенностями сорбента являются: преимущественное содержание мезопор (до 80%) на поверхности сорбента при величине удельной поверхности 300-400 м²/г позволяет извлекать до 95% веществ со средней молекулярной массой - 500-5000 Да, высокая химическая чистота (содержание углерода не менее 99,5%, минеральных примесей - не более 0,15%), высокая прочность гранул, которые имеют округлую форму с гладким рельефом поверхности, а также практически полное отсутствие «углеродной пыли» на поверхности и в порах.

Хорошая гидродинамика процесса сорбционной очистки, ВНИИТУ-2 применяется:

- для детоксикации больных с заболеваниями, сопровождающимися накоплением токсических веществ в организме;

- при остром отравлении барбитуратами, фосфороорганическими соединениями, лекарственными препаратами, пищевыми продуктами, солями тяжелых металлов;

- при заболеваниях печени и почек: закупорки желчных протоков, печеночной коме, циррозах, вирусном гепатите и т.д.;

- при эндотоксикозах: перитоните, панкреатите, сепсисе, раневой инфекции, ожоговой интоксикации после действия радиационного воздействия, опухолевом росте, атеросклерозе и т.д.;

- при аутоиммунных и психоневрологических заболеваниях: аллергии, бронхиальной астме, псориазе, красной волчанке, артритах, алкогольной интоксикации, наркомании, рассеянном склерозе.

Препарат отличают высокая химическая чистота; шлифованная поверхность гранул и однородный состав; полная инертность и нерастворимость в контакте с биологическими жидкостями; отсутствие запаха и вкуса; высокая степень извлечения токсических веществ средней и высокой молекулярной массы и полнота выведения из организма; простота применения, не требующая предварительной подготовки энтеросорбента.

Мезо- и макропористая структура носителя-сорбента, ячейки которого заполнены микробными клетками, также способствует защите этих иммобилизованных клеток от инактивирующих факторов внешней среды. Причем микробные клетки, находящиеся в порах, и клетки, находящиеся близко к внешней поверхности носителя-сорбента, отличаются по своим десорбционным способностям, и такая неоднородность свойств клеток, обеспечивает пролонгированное действие препарата и способствует колонизации не только верхних, но и нижних отделов кишечника. Пористый носитель, являясь энтеросорбентом, снимает эффекты местного (а через него и общего) токсикоза, что способствует выживаемости бактерий препарата и микрофлоры кишечника, а также снижает нагрузку на органы детоксикации человека или животного.

Кроме того, при использовании в препарате в качестве микробных клеток консорциума бифидобактерий, или консорциума лактобактерий, или смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий обеспечивается не только вытеснение из желудочно-кишечного тракта патогенных микроорганизмов (за счет антагонистических свойств указанных бактерий), но и восстановление сильно сокращенной микрофлоры кишечника при дисбактериозе и других заболеваниях.

Используемый консорциум штаммов бифидобактерий усиливает как клиническую эффективность готовых форм биопрепаратов, так и технологические преимущества при наработке биомассы бифидобактерий:

- расширяется спектр антагонистической активности консорциума по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

- усиливается ферментативная и синтетическая активность бактерий за счет эффекта синергизма, что позволяет активнее колонизировать слизистые кишечника;

- возрастает стимулирующее воздействие различных штаммов бифидобактерий на иммунокомпетентные клетки желудочно-кишечного тракта и иммунную систему человека в целом;

- значительно повышается выживаемость бактерий консорциума в условиях желудочно-кишечного тракта;

- возрастает скорость накопления биомассы в условиях технологического процесса за счет взаимовыгодного усиления ферментативной активности и повышения эффективности использования питательных сред.

Использование нескольких штаммов лактобактерий в составе консорциума усиливает эффект благоприятного их воздействия на организм человека, что обусловливается следующими его свойствами:

- высокой антагонистической активностью по отношению к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- выраженным воздействием на ферментативную и синтетическую активность бактерий нормальной кишечной микрофлоры;

- стимуляцией иммунной системы человека;

- способностью к выживанию и развитию в условиях микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Ниже приведены примеры составов предлагаемого комплексного препарата бактерий-эубиотиков в иммобилизованной и лиофилизированной форме.

Пример 1. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):

клетки с питательной средой консорциума лактобактерий
с титром 1010 КОЕ/г	1,0
защитная среда, в том числе:
Желатин	0,085
Аскорбиновая кислота	0,008
Хлористый натрий	0,017
Сахароза	0,89
энтеросорбент ВНИИТУ-2	остальное до 100%

Пример 2. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):

клетки с питательной средой консорциума бифидобактерий
с титром 109 КОЕ/г	7,0
защитная среда, в том числе:
Желатин	0,85
Аскорбиновая кислота	0,08
Хлористый натрий	0,17
Сахароза	8,9
энтеросорбент ВНИИТУ-2	остальное до 100%

Пример 3. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):

клетки с питательной средой и титром 108 КОЕ/г смеси
консорциумов бифидо- и лактобактерий в
соотношении 1:1	10,0
защитная среда, в том числе:
Желатин	0,575
Аскорбиновая кислота	0,06
Хлористый натрий	0,15
Сахароза	4,215
Энтеросорбент ВНИИТУ-2	остальное до 100%

Пример 4. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):

клетки с питательной средой и титром 109 КОЕ/г
смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий
в соотношении 3:1	5,0
защитная среда, в том числе:
Желатин	0,85
Аскорбиновая кислота	0,08
Хлористый натрий	0,17
Сахароза	8,9
Энтеросорбент ВНИИТУ-2	остальное до 100%

Пример 5. Технология получения готовых форм препарата "Экофлор"

По специальной технологии готовят исходные сорбенты типа ВНИИТУ-2 (патент РФ №2211727, МПК B01J 20/20, С01В 31/08, опубл. 10.09.2003 г.). Способ обработки гранул углеродного пористого материала для энтеросорбции включает промывание слоя материала водой и контактирование его с газообразным окислителем путем его обработки воздушно-водяной смесью в фонтанирующем слое, который создают путем подачи воздушно-водяной струи снизу вверх под слой материала со скоростью 50-150 м/с. Обработку ведут в течение 1-36 ч до достижения величины рН 6,0-7,0 и полного обеспыливания материала. Под воздействием струи воздушно-водяной смеси происходит образование фонтанирующего слоя, обеспечивающее интенсивное перемешивание гранул в воде, при котором разрушаются слабые, обеспыливаются и шлифуются прочные гранулы. При этом подача смеси воздуха с водой под нижний фильтрующий элемент предотвращает забивание фильтрующего элемента частицами обрабатываемого материала. Верхний фильтрующий элемент препятствует уносу материала из реактора, но не препятствует удалению из реактора пыли и частиц менее 0,5 мм. Интенсивность механического воздействия на гранулы материала растет по высоте слоя сверху вниз и зависит от скорости подачи воздушно-водяной смеси. В процессе обработки гранул углеродного сорбента отделившаяся пыль, адсорбируя воздух, приобретает плавучесть и восходящим потоком воды и воздуха выносится из рабочей зоны реактора в его верхнюю часть и через сливной патрубок удаляется из реактора. Кроме того, воздух является окислителем, воздействие которого на сорбент осуществляется в фонтанирующем слое до достижения рН продукта 6,0-7,0. Этим достигается хорошая инертность сорбента к процессам, протекающим в желудочно-кишечном тракте человека и животных.

Стерилизацию сорбента перед применением ведут сухим жаром в сушильном шкафу россыпью слоем не более 1,5-2,0 см при температуре (160±2)°С в течение 2 часов. Контроль стерильности ВНИИТУ-2 определяют микробиологически.

Получение консорциума бактерий-эубиотиков. Для получения консорциума штаммов бифидо- и/или лактобактерий производят механическое смешивание лабораторных заквасок в указанных соотношениях.

Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе консорциума ассоциации составляет lg 10 в 1 мл. Приготовление биомассы консорциума ведется термостатным способом в стеклянных стерильных бутылях вместимостью 15 л. Вначале приготавливают в асептических условиях молочную питательную среду на основе обрата молока, нормализованного по сухому остатку СОМО до 13,5-15,0%. В указанную молочную среду дополнительно вводят глюкозу и натрий лимоннокислый в следующем количественном соотношении (мас.%):

Глюкоза	1,5-2,5
Натрий лимоннокислый	0,15-0,25
Обрат молока, нормализованный
по сухому остатку 13,5-15%	остальное до 100%

В асептических условиях в стеклянную бутыль, содержащую 9,5 л нормализованной молочной питательной среды, вносят готовую производственную закваску консорциума бифидо- и/или лактобактерий в количестве 0,5 л. Микробную смесь осторожно перемешивают круговым вращением бутыли в течение (1-2) минут. Помещают в термостат типа ТС-80М на (4-5) часов при температуре (39-40)°С. Заквашенную смесь оставляют без перемешивания до образования сгустка и достижения кислотности не менее 90°Т. После образования сгустка бутыли с продуктом захолаживают до температуры (4±2)°С в холодильниках. Для стабилизации и упрочения сгустка захолаживание продукта производят в течение (8-10) ч для последующей иммобилизации на энтеросорбент.

Процесс иммобилизации ВНИИТУ-2 проводят в асептических условиях. Для иммобилизации берут равные по объему (1:1) количества энтеросорбента ВНИИТУ-2 и биомассу концентрата консорциумов микроорганизмов. Для иммобилизации используют консорциум бифидобактерий (с титром не менее 10¹⁰ КОЕ/мл), или консорциум лактобактерий (с титром не менее 10⁸ КОЕ/мл), или их смесь в объемном соотношении от 1:1 до 3:1 соответственно в соответствии с примерами 1-3.

Смесь энтеросорбента ВНИИТУ-2 с клетками бактерий-эубиотиков тщательно перемешивают в течение 5 мин и помещают на шейкер на 1 час при интенсивности 100 колебаний в минуту при температуре 6±2°С. Процесс иммобилизации возможно вести в стеклянной посуде на роллерной установке. Для определения качества иммобилизации из исходного титра бифидобактерий и лактобактерий в концентрате бифидо- и лактобактерий вычитают полученный результат биотитрования. Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.

Далее продукт однократно промывают в изотоническом растворе NaCl. Мутный раствор стерильно сливают, отбирают пробы и проводят контроль полноты процесса иммобилизации по МУК 4.2.577-96 (Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов, п.7.1 и п.7.10). Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.

Отмытый продукт замораживают в низкотемпературном холодильнике типа "Кельвинатор" при температуре минус (40-45)°С в течение (24-48) часов. Кассеты с предварительно замороженным препаратом перегружают в сушильную камеру при достижении температуры плит минус (20-30)°С и камеру вакуумируют. Готовый препарат "Экофлор" в сухой иммобилизованной форме фасуют во флаконы и герметично закрывают пробками. Массовая доля влаги составляет не более 3,0 мас.%.

Таблица 1
Данные по адсорбционной емкости энтеросорбентов
№ п/п	Наименование энтеросорбента	Адсорбционная емкость	рН сорбента
1	СУМС-1 (прототип)	0,017±0.002 г	6,1
2	ЕНИИТУ-2	0,027±0.002 г	7,1

В таблице 1 приведены адсорбционные емкости СУМС-1 (прототип) и ВНИИТУ 2 на основе измерения адсорбции метиленового синего согласно ФС 42-3283-96.

Таблица 2
Данные биологического тестирования энтеросорбента ВНИИТУ 2
Тип энтеросорбента	Эффективность десорбции LgT4/LgT3	Эффективность сорбции LgT1/LgT3	Исходный титр Т1 (КОЕ/мл)	Сорбция T3=(T1-Т2)	Десорбция Т4
T3	T2
Иммобилизация консорциума бифидобактерий
ВНИИТУ-2	1,0000	1,015	1·1010	3·109	7·109	7-109
Иммобилизация смеси консорциумом бифидо- и лактобактерий
ВНИИТУ-2	0,9068	1,007	1·1010	1,6·109	8,4·109	1-109
Иммобилизация консорциума лактобактерий
ВНИИТУ-2	0,7839	1,005	6·108	6·107	5,4·108	7-106
Примечание:
Т1 (КОЕ/мл) -исходный титр биомассы бактерий;
Т2 (КОЕ/мл) - титр биомассы бактерий, оставшейся после иммобилизации на энтеросорбент;
Т3=Т1-Т2 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток, иммобилизованных на сорбенте;
Т4 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток после десорбции, определяющий клинический эффект от действия препарата.

Кроме того, энтеросорбенты ВНИИТУ 2 оценивались в биологических тестах по:

1) эффективности биосорбции (отношение количества сорбированных клеток к общему количеству бактерий в исходной суспензии),

2) эффекивности биодесорбции (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности ВНИИТУ-2, к количеству сорбированных бактерий). Эффективность биодесорбции является важным показателем, во многом определяющим клиническую эффективность энтеросорбента. Результаты биологических тестов приведены в таблице 2.

Таким образом, по результатам исследований энтеросорбентов ВНИИТУ-2 (таблица 1), адсорбционная емкость которых превышает СУМС-1. Эффективность биодесорбции (таблица 2), определяющая клинический эффект от действия комплексного препарата (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности ВНИИТУ-2 к количеству сорбированных на нем бактерий), равна 1, что показывает, что практически все бактерии могут десорбироваться в желудочно-кишечном тракте.

Результаты доклинических исследований

Проведенные исследования подтвердили, что комплексный препарат «Экофлор» нетоксичен для лабораторных животных, восстанавливает нормобиоценоз кишечника, элиминирует условно-патогенную и патогенную микрофлору, не вызывает побочных и непредвиденных нежелательных реакций, стимулирует процессы адаптации организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Основные результаты исследования:

1) морфометрические показатели животных в экспериментальных группах нарастали в соответствии с популяционным стандартом;

2) лабораторные анализы крови оставались в пределах физиологической нормы;

3) гистологические исследования органов показали отсутствие токсического воздействия;

4) подтверждено отсутствие повреждающего действия на структуру кишечного эпителия со стороны препарата;

5) патолого-анатомическое вскрытие подтвердило состояние органов в норме. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комплексный препарат «Экофлор» успешно прошел доклинические испытания.

Результаты клинических исследований препарата "Экофлор"

Все пациенты (45 человек - экспериментальная группа и 25 человек - группа сравнения) имели хроническую патологию: атопический дерматит - в 44,4% случаев; острый аллергоз - в 11,1% случаев; вторичный хронический пиелонефрит - в 22,2% случаев; сахарный диабет - в 11,1% случаев; бронхиальная астма - в 11,1% случаев.

После проведенного экспериментального курса лечения комплексным препаратом «Экофлор» были получены следующие результаты:

1) препарат «Экофлор» способствует уменьшению абдоминального болевого синдрома, проявлений диспепсического синдрома, нормализации моторной функции кишечника, регрессу кожных высыпаний;

2) применение «Экофлора» способствует уменьшению субъективных клинических (недомогание, слабость нарушение аппетита) и объективных лабораторных критериев (нормализация лейкоцитарного индекса интоксикации и гематологического показателя интоксикации, купирование синдрома цитолиза и нормализация общего белка сыворотки крови, а также уменьшение выраженности мочевого синдрома), отражающих синдром эндогенной интоксикации;

3) при использовании препарата «Экофлор» в 62,2% наблюдается полное восстановление функций переваривания и всасывания в кишечнике, у остальных больных - тенденция к нормализации показ