Производное тромбина и фармацевтическая композиция, содержащая его

Производное тромбина и фармацевтическая композиция, содержащая его

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к производному тромбина и к фармацевтической композиции, содержащей его, в частности к антитромботическому агенту или к противовоспалительному средству.

Уровень техники

Тромбин представляет собой трипсиноподобную сериновую протеиназу, которая обладает очень высокой гомологией к трипсину и выполняет определенные функции в реакции по типу агрегации тромбоцитов, воспалительной реакции и т.п. Например, в непатентном документе 1 описывается активация тромбином рецептора тромбина, служащего в качестве субстрата, что вызывает агрегацию тромбоцитов, активацию эндотелиальных клеток сосудов и воспалительную реакцию.

Физиологические действия тромбина описываются следующим образом. В непатентном документе 2 (Japanese Journal of Thrombosis and Hemostasis, vol. 10, 1999, Nos. 2 and 3) указывается, что фрагмент I экзосайта играет важную роль в распознавании субстрата, осуществляемом в процессе свертывания крови, которое вызывается преимущественно тромбином. В непатентном документе 3 (Biochemical J. (2001) 354, 309-313) указывается, что ангидротромбин, который представляет собой инактивированный тромбин, обладающий связывающей способностью в отношении белкового субстрата тромбина (далее также называемого как «субстрат тромбина»), обладает, как и тромбин дикого типа, высокой связывающей активностью в отношении субстрата тромбина, способного связываться с экзосайтом 1. Дополнительно в непатентном документе 3 отмечается, что добавление вещества, такого как бензамидин, которое создает пространственное препятствие в активном центре, устраняет связывающую способность АГТ (AHT). В непатентном документе 4 (Voet: Biochemistry, 1^st volume, 1996, p.331-340, Tokyo Kagaku Dojin) указывается, что сериновые протеазы, такие как тромбин, содержат в активном центре серин, гистидин и аспарагиновую кислоту, и заряженные системы указанных трех аминокислот вызывают экспрессию протеазной активности; а также глицин в положении 193 (номер 193 указывает на положение аминокислоты в молекуле химотрипсиногена и соответствует глицину в положении 203 в B цепи тромбина) вовлекается в процесс преобразования комплекса Михаэлиса сериновых протеаз в тетраэдральный комплекс.

На основании указанных результатов были предприняты различные попытки ввести модификации и изменения в молекулу тромбина с целью разработки антитромботического агента и т.п. В патентном документе 1 (WO 01/03740) описывается ингибитор сериновой протеазы, содержащий вещество (далее также называемое как «вещество, ингибирующее реакцию»), которое связывается с субстратом сериновой протеазы, конкурируя с сериновой протеазой и тем самым ингибируя реакцию между сериновой протеазой и субстратом. Далее, в патентном документе 1 указывается, что ингибитор сериновой протеазы эффективно служит в качестве антитромботического средства (то есть ингибитора тромбогенеза). В патентном документе 1 также описывается в качестве конкретного примера вещества, ингибирующего реакцию, производное тромбина (например, ангидротромбин, называемый далее также как «AГT») со значительно сниженной активностью сериновой протеазы, которое получают при проведении реакции сериновой протеазы тромбина с ингибитором, таким как фенилметилсульфонилфторид (далее также называемый как «ФМСФ»), который превращает серин, имеющийся в активном сайте, в дегидроаланин (далее реакция также будет называться как ангидратация).

Соответственно в патентном документе 2 (WO 02/077031) описывается производное ангидротромбина (AHT) (далее также называемое как «M-AHT»), получаемое путем химической модификации AHT при проведении реакции карбоксильной группы AHT с имидогруппой. M-AHT обладает селективно низкой связывающей способностью с фибриногеном (далее называемым как «Fbgn»), который присутствует в крови в больших количествах и может повышать эффект по увеличению частичного активированного тромбопластинового времени (также называемого как «ЧАТВ») в сравнении с AHT и оказывает высокий антитромботический эффект.

Соответственно, были проведены исследования производных тромбина, содержащих замещения аминокислот. Приведенное ниже обсуждение данных относится к рекомбинантам, полученным путем замещения аминокислоты в активном центре путем генной рекомбинации тромбина. Например, в непатентном документе 5 (Experimental Cell Research 219, 650-656 (1995)) описывается влияние производного тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, на лейкоциты. Дополнительно, в непатентном документе 5 указывается, что у данного производного тромбина отсутствует ферментативная активность.

В непатентном документе 6 (Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186) описываются: производное тромбина, в котором глицин в положении 203 B-цепи тромбина замещен аланином; производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином или треонином; производное тромбина, в котором гистидин активного центра замещен аспарагином; и производное тромбина, в котором аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином. В непатентном документе 6 описывается ферментативная активность указанных производных тромбина. Так, производное тромбина, в котором серин активного центра замещен треонином, производное тромбина, в котором гистидин активного центра замещен аспарагином, и производное тромбина, в котором аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином, обладает, каждое, ферментативной активностью, которая снижена от нескольких тысячных долей до нескольких десятков тысячных долей в сравнении с активностью тромбина дикого типа. Кроме того, показано, что ферментативная активность у производного тромбина, в котором глицин в положении 203 В цепи тромбина замещен аланином, и у производного тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, полностью отсутствует.

Однако производные тромбина, описанные в непатентных документах 5 и 6, все еще обладают ферментативной активностью (активностью по разложению субстрата тромбина) на уровне, который не может быть обнаружен методами тестирования, описанными в соответствующих документах, и характеризуются значительно сниженной способностью к связыванию субстрата тромбина или характеризуются высокой связывающей способностью с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах. Таким образом, трудно утверждать, что каждое из производных тромбина обладает активностью, достаточной для того, чтобы выполнять функцию антитромботического агента и/или противовоспалительного средства.

В патентном документе 3 (WO 95/13385), в непатентном документе 7 (J. Biol. Chem. Vol. 275, 39827-39830), в непатентном документе 8 (J. Biol. Chem. Vol. 279, 26387-26394) и в непатентном документе 9 (J. Biol. Chem. Vol. 277, 27581-27584) описываются производные тромбина, каждое из которых обладает ферментативной активностью (активностью по разложению субстрата тромбина) и антикоагулирующим эффектом, которые получают при замене аминокислоты. Указанные производные тромбина, каждый, обладают сохранившейся или даже повышенной связывающей способностью с тромбомодулином (далее также называемым как «ТМ») при значительно сниженной способности к разложению Fbgn, и в этой связи каждый из них представляет собой производное тромбина, которое специфически связывается с ТМ при активации белка С, проявляя таким образом антитромботический эффект.

В патентном документе 4 (WO 96/41868) описывается производное протромбина, которое содержит замещение аминокислоты в активном центре и которое предлагается использовать для нейтрализации антикоагулирующей активности С-концевого пептида гирудина, когда при введении С-концевого пептида гирудина пациенту в качестве антитромботического средства возникают проблемы, такие как кровотечение.

В патентных документах 5 и 6 отмечается, что производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином, и производное тромбина, в котором серин активного центра замещен аланином и аспарагиновая кислота активного центра замещена аспарагином, ингибирует стимуляцию рецептора тромбина тромбином в суспензии промытых тромбоцитов.

Однако каждое из указанных производных тромбина обладает сильной способностью по связыванию с Fbgn, который присутствует в крови в больших количествах. В том случае, когда указанные производные тромбина вводят в кровь, большая часть из них связывается с Fbgn. В этой связи должно быть введено большое количество производного тромбина, с тем чтобы достичь желательного ингибирующего эффекта в отношении рецептора тромбина. Таким образом, было практически невозможно использовать каждое из указанных производных тромбина в качестве агента, ингибирующего рецептор тромбина (например, антитромбоцитарного агента) в крови (см. экспериментальный пример 3, приведенный ниже).

[Патентный документ 1] WO 01/03740

[Патентный документ 2] WO 02/077031

[Патентный документ 3] WO 95/13385

[Патентный документ 4] WO 96/41868

[Патентный документ 5] WO 92/14750

[Патентный документ 6] US 5 256 766

[Непатентный документ 1] J. Biol. Chem. 261 (1986), 15928-15933)

[Непатентный документ 2] Japanese Journal of Thrombosis and Hemostasis, vol. 10, Nos. 2 and 3, (1999)

[Непатентный документ 3] Biochemical J. (2001) 354, 309-313

[Непатентный документ 4] Voet: Biochemistry, 1 том Руководства, который переведен на японский язык, 1996, p.331-340, Tokyo Kagaku Dojin

[Непатентный документ 5] Experimental Cell Research 219, 650-656 (1995)

[Непатентный документ 6] Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186

[Непатентный документ 7] J. Biol. Chem. Vol. 275, 39827-39830

[Непатентный документ 8] J. Biol. Chem. Vol. 279, 26387-26394

[Непатентный документ 9] J. Biol. Chem. Vol. 277, 27581-27584

Описание изобретения

Производные тромбина, такие как AHT и M-AHT, получаемые с помощью химических процедур, оказывают антитромботические эффекты или противовоспалительное действие, однако у них все еще сохраняется активность сериновой протеазы, которая варьируется в зависимости от химических процедур. Для превращения AHT требуется множество стадий, включающих щелочную обработку, процедуру восстановления и т.п., что сказывается на снижении выхода, который составляет от 50 до 60%. Остающаяся в AHT и M-AHT на следовом уровне ферментативная активность (активность по разложению субстрата тромбина) в ряде случаев снижает антикоагулирующую активность AHT и M-AHT. В частности, это с большей вероятностью имеет место в случае AHT.

Таким образом, нет оснований констатировать, что производное тромбина, содержащее замещение аминокислот в активном центре тромбина, обладает активностью, достаточной для того, чтобы выполнять функцию антитромботического агента или противовоспалительного средства. Причиной этого может быть тот факт, что каждое из указанных производных тромбина обладает выраженной активностью по разложению тромбинового субстрата в случае его использования в качестве антитромботического агента или противовоспалительного средства, или обладает значительно сниженной способностью к связыванию с субстратом тромбина в связи со структурными изменениями, преимущественно в экзосайте I, вызванными замещениями аминокислот.

Например, в непатентном документе 6 (Biochimica et Biophyscia Acta 1451 (1999) 173-186) сообщается, что производное тромбина, в котором глицин в положении 203 В цепи тромбина замещен аланином, полностью теряет активность по разложению субстрата тромбина. Однако указанное производное тромбина все еще обладает существенной активностью по разложению субстрата тромбина в случае его использования в качестве антитромботического агента или противовоспалительного средства. Кроме того, замещение глицина в положении 203, гистидина активного центра и аспарагиновой кислоты в цепи В тромбина, как описано в непатентном документе 6, снижает активность по разложению субстрата тромбина до более низкого уровня, но некоторое сочетание замещений вызывает структурные изменения в экзосайте I, которые ведут к нарушению способности к связыванию с субстратом тромбина.

По данным медицинской статистики, в настоящее время выявлены три основных причины смерти в Японии, которые включают: на первом месте - рак (30%), на втором месте - заболевания сердечно-сосудистой системы (15%) и на третьем месте - нарушения мозгового кровообращения (13%), что в целом составляет 60 процентов от всех летальных исходов. Большая часть заболеваний сердца представляет собой заболевания коронарных сосудов, такие как сердечный инфаркт и грудная жаба. В настоящее время ангиопатии сердца и мозга в целом составляют почти половину в процентах от числа смертных случаев, вызванных раком. Однако процент ангиопатий будет в будущем возрастать, и в этой связи разработка эффективного терапевтического средства приобретает выраженное социальное звучание. Кроме того, церебральный инфаркт, если он даже не приводит к смертельному исходу, характеризуется частыми побочными эффектами, что сопряжено с социальными проблемами, такими как серьезные траты на уход за больными и оплату медицинских услуг.

Тромбоз, включающий инфаркт миокарда, грудную жабу, церебральный инфаркт и аналогичные заболевания, возникает в результате действия множества факторов. Как показано на Фиг.48, по имеющимся сообщениям, при истинном инфаркте сердца отмечается белый тромб, впоследствии смешанный тромб в центральной части кровотока и красный тромб в нижней части кровотока.

Большая часть сосудистых заболеваний мозга или сердца представляет собой тромбоз. Основные причины тромбоза включают нарушенный кровоток, аномалии в коагулирующем компоненте и аномалии в эндотелии сосудов, но фактически все они в сочетании вызывают и индуцируют тромбоз. Коагулаза тромбина - один из компонентов, которые вовлекаются в работу всех причин такого рода и играют центральную роль в тромбогенезе. Тромбин продуцирует агрегаты фибрина на конечной стадии каскадного процесса свертывания крови, и в то же время тромбин ускоряет каскадную реакцию свертывания крови под действием активирующих факторов XI, V и VIII. Кроме того, тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов и активацию эндотелиальных клеток через PAR1, который является рецептором на тромбоцитах и сосудистом эндотелии. Сообщается, что активация эндотелиальных клеток ускоряет коагуляцию сосудистой стенки, и происходит тромбогенез в связи с протеканием цепи отрицательных реакций. В патологической анатомии истинного артериального тромбоза в большинстве наблюдаются белый, смешанный и красный тромбы, при этом показано, что ингибирование процесса свертывания крови и тромбоцитов, в сочетании, является важным фактором в антитромботическом лечении. Тем не менее, все существующие антитромботические агенты подразделяются на антикоагулянты или антитромбоцитарные агенты, и лечение проводят с использованием соответствующих лекарственных средств.

Ввиду указанных выше обстоятельств желательно разработать антитромботический агент, который мог бы использоваться в качестве антитромботического агента и в качестве противовоспалительного средства, который бы эффективно ингибировал (i) активацию и ускорение свертывания, (ii) агрегацию и адгезию тромбоцитов и (iii) способность активировать эндотелиальные клетки сосудов.

Авторы настоящего изобретения выявили следующие факты.

Так, авторы показали, что производные тромбина, которые включают замещение одного или нескольких видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина и которые обладают активностью по разложению субстрата тромбина, сниженной до такого уровня, при котором субстрат тромбина уже по существу не разлагается, и в которых замещения аминокислот активного центра не нарушают структур экзосайта I и экзосайта II, характерных для незамещенного тромбина, могут оказывать антитромботический эффект, преимущественно включающий эффект по увеличению ЧАТВ, аналогичный таковому у AHT; указанный эффект по увеличению ЧАТВ несомненно приводит к увеличению ЧАТВ, при этом на него не оказывает воздействие инкубация в связи с наличием остаточной активности тромбина (см. Экспериментальный пример 21). Далее, авторы обнаружили, что производные тромбина, обладающие связывающей способностью, более специфичной к субстрату тромбина, которая играет важную роль в тромбогенезе, могут с большей определенностью оказывать антитромботический эффект или противовоспалительный эффект, равный или превышающий таковой у AHT.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность к связыванию с Fbgn, имеющимся в крови в больших количествах, может быть относительно снижена в сравнении со связывающейся способностью с рецептором тромбина или фактором свертывания крови 8 (далее называемым как «FVIII») за счет замещений аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, что приводит к достижению хорошего антитромботического эффекта даже в малой дозировке. Дополнительно, было обнаружено, что замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, приводят к получению производных тромбина, обладающих различными аспектами данных эффектов, таких как производные тромбина, которые оказывают повышенный эффект по увеличению ЧАТВ, но обладают низким антитромбоцитарным эффектом, и производные тромбина, которые имеют высокий эффект по увеличению ЧАТВ и высокий антитромбоцитарный эффект (только PAR1-ингибирующий эффект).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что замещения некоторых дополнительных аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, не нарушают антитромботический эффект, осуществляемый производным тромбина по настоящему изобретению, и специфически снижают связывающую способность тромбинового производного в отношении ТМ. В случае введения в живой организм производных тромбина согласно настоящему изобретению, в которых замещены аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, указанные производные тромбина не ингибируют активацию белка С на ТМ, вызванную тромбином. Иными словами, производные тромбина по настоящему изобретению, в которых имеются замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, не ингибируют антитромботическую активность, присущую тромбину.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в том случае, когда карбоксильная группа в производных тромбина согласно настоящему изобретению модифицирована по методу, описанному в патентном документе 2 (WO 02/077031), то достигается не только увеличение ЧАТВ, но и антитромбоцитарный эффект, в особенности активация PAR1, и эффект по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином, может быть нарушен или может подвергаться контролируемому воздействию, в зависимости от типа аминокислотного замещения. Для достижения специфичности могут быть получены производные тромбина, обладающие контролируемым балансом лекарственной эффективности, такие как: производные тромбина, обладающие чрезвычайно высоким эффектом по увеличению ЧАТВ и высоким антитромбоцитарным эффектом; или производные тромбина, обладающие умеренным уровнем эффекта по увеличению ЧАТВ и мощным антитромбоцитарным эффектом. Таким образом, модификация карбоксильных групп в производных тромбина согласно настоящему изобретению может обеспечивать создание производных тромбина, оказывающих антикоагуляционный эффект на кровь и антитромбоцитарный эффект, так что они могут найти применение при разных видах тромбоза.

Указанные результаты авторов и составили суть настоящего изобретения.

Соответственно, ниже описывается настоящее изобретение.

(1) Производное тромбина, включающее А цепь и В цепь, где В цепь имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько видов аминокислот активного центра, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина, замещены и где:

1) производное тромбина разлагает субстрат тромбина в доле 10% или менее при взаимодействии с субстратом тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, и

2) производное тромбина сохраняет структуру экзосайта I.

(2) Производное тромбина, включающее А цепь и В цепь, где В цепь имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько видов аминокислот активного центра, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина, замещены, где

1) производное тромбина разлагает субстрат тромбина в доле 10% или менее при взаимодействии с субстратом тромбина в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), содержащем 0,1 M NaCl, при температуре 37°С в течение 3 ч, и

2) производное тромбина сохраняет способность к связыванию с С-концевым пептидом гирудина, иммобилизованным в геле.

(3) Производное тромбина согласно пункту (2), которое также сохраняет способность к связыванию с гепарином.

(4) Производное тромбина согласно пункту (1) или (2), где указанный субстрат тромбина представляет собой фактор свертывания крови 13.

(5) Производное тромбина согласно пункту (1) или (2), где указанный субстрат тромбина представляет собой фибриноген.

(6) Производные тромбина согласно любому из пунктов (1)-(5), где указанные замещения аминокислот активного центра представляют собой замещения двух или более видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина в положении 205, глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в цепи В тромбина.

(7) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(6), где указанные замещения аминокислот активного центра включают замещение серина в положении 205.

(8) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(7), где указанное замещение аминокислот активного центра включает замещение серина в положении 205 и гистидина в положении 43.

(9) Производное тромбина согласно пункту (8), где гистидин в положении 43 замещен аланином или серином.

(10) Производное тромбина согласно любому из пунктов (6)-(9), где серин в положении 205 замещен аланином, треонином или глицином.

(11) Производное тромбина согласно любому из пунктов (6)-(9), где серин в положении 205 замещен аланином.

(12) Производное тромбина согласно пункту (8), где серин в положении 205 и гистидин в положении 43 замещены аланином.

(13) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(12), где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 на 10% или более превосходит соответствующую способность у ангидротромбина.

(14) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(12), где его способность связываться с фактором свертывания крови 8 составляет 80% или более относительно соответствующей способности у ангидротромбина.

(15) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(14), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у ангидротромбина.

(16) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(14), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,2 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у ангидротромбина.

(17) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(12), где значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,1 раза или более превышает данный показатель у ангидротромбина.

(18) Производное тромбина по любому из пунктов (1)-(12), где его связывающая способность с фибриногеном снижена на 10% или более и значение частичного активированного тромбопластинового времени увеличено в 1,1 раза или более за счет аминокислотных замещений среди аминокислот активного центра.

(19) Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой замещены серин в положении 205 и один или несколько видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глицина в положении 203, аспарагиновой кислоты в положении 99 и гистидина в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина.

(20) Производное тромбина, включающее цепь А и цепь В, где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой замещены серин в положении 205 и гистидин в положении 43 в аминокислотной последовательности В цепи тромбина.

(21) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(20), где цепь В имеет аминокислотную последовательность, в которой также замещены аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра.

(22) Производное тромбина согласно пункту (21), где аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты фрагмента экзосайта I тромбина.

(23) Производное тромбина согласно пункту (22), где аминокислоты фрагмента экзосайта I тромбина представляют собой основные аминокислоты.

(24) Производное тромбина согласно пункту (22), где аминокислоты во фрагменте экзосайта I тромбина представляют собой одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глютамина в положении 24, лизина в положении 65 и лизина в положении 77 в цепи В тромбина.

(25) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с фибриногеном (Fa) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(26) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/FA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с фибриногеном (FA) у производного тромбина, в 1,5 раза или более превышает VIIIa/Fa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и способностью связываться с фибриногеном (Fa) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(27) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где указанное производное тромбина обладает:

- любым эффектом, выбранным из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином; и обладает

- сниженной связывающей способностью с тромбомодулином, в сравнении с соответствующей способностью у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(28) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где указанное производное тромбина обладает:

- любым эффектом, выбранным из группы, состоящей из эффекта по увеличению ЧАТВ, эффекта по ингибированию активации рецептора тромбина и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином; и обладает

- связывающей способностью с тромбомодулином, сниженной на 10% или более, в сравнении с соответствующей способностью у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(29) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА), у производного тромбина, в 1,1 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) у производного тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(30) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(24), где VIIIA/TMA, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIA) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМА) у производного тромбина, в 1,5 раза или более превышает VIIIa/TMa, соотношение между связывающей способностью с фактором свертывания крови 8 (VIIIa) и связывающей способностью с тромбомодулином (ТМа) у производного тромбина, до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(31) Производное тромбина согласно пункту (21), где указанные аминокислоты, за исключением аминокислот активного центра, представляют собой аминокислоты фрагмента экзосайта II тромбина, и его антитромботическая способность сохраняется, тогда как способность связываться с гепарином снижена.

(32) Производное тромбина согласно пункту (31), где указанные аминокислоты во фрагменте экзосайта II тромбина представляют собой один или несколько видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина в положении 98, аргинина в положении 245, лизина в положении 248 и лизина в положении 252 в цепи В тромбина.

(33) Производное тромбина согласно пункту (31) или (32), где гепарин-связывающая способность у производного тромбина составляет 90% или менее в сравнении с соответствующей способностью у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(34) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(33), где усилены один или несколько видов антитромботических эффектов, выбранных из группы, состоящей из эффекта по увеличению частичного активированного тромбопластинового времени, эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной модифицированным тромбином, и эффекта по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

(35) Производное тромбина согласно любому из пунктов (21)-(33), где указанное значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,1 раза или более превышает данный показатель у ангидротромбина.

(36) Производное тромбина согласно пункту (31) или (32), где указанное значение частичного активированного тромбопластинового времени у производного тромбина в 1,5 раза или более превышает данный показатель у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра, и его связывающая способностью с тромбомодулином снижена до 50% или менее в сравнении с соответствующей способностью у тромбина до замещения аминокислот, за исключением аминокислот активного центра.

(37) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(36), указанная аминокислотная последовательность В цепи тромбина представляет собой аминокислотную последовательность В цепи человеческого тромбина дикого типа.

(38) Производное тромбина согласно пункту (37), где указанная аминокислотная последовательность В цепи человеческого тромбина дикого типа представляет собой аминокислотную последовательность от положения 50 до положения 308 в SEQ ID No: 2.

(39) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(38), где его карбоксильная группа модифицирована.

(40) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована сложным эфиром аминокислоты.

(41) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем.

(42) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована полиэтиленгликолем, содержащим аминогруппу.

(43) Производное тромбина согласно пункту (41) или (42), где указанный полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1000 или менее.

(44) Производное тромбина согласно пункту (39), где указанная карбоксильная группа модифицирована карбодиимидом.

(45) Производное тромбина согласно пункту (39), где по меньшей мере 3 карбоксильных группы на молекулу модифицированы.

(46) Производное тромбина согласно пункту (39), где 25 или менее карбоксильных групп на молекулу модифицированы.

(47) Производное тромбина согласно пункту (39), где модифицирована по меньшей мере карбоксильная группа глютаминовой кислоты в положении 25 в цепи В.

(48) Производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(47), обладающее эффектом по ингибированию активации PAR1 и/или эффектом по ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированной ристоцетином.

(49) ДНК, кодирующая производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(38).

(50) Фармацевтическая композиция, включающая производное тромбина согласно любому из пунктов (1)-(48).

(51) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой антитромботический агент.

(52) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой противовоспалительное средство.

(53) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой средство, оказывающее ингибирование агрегации тромбоцитов.

(54) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий адгезию тромбоцитов.

(55) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий эндогенное свертывание крови.

(56) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), которая представляет собой агент, ингибирующий активацию рецептора тромбина.

(57) Фармацевтическая композиция согласно пункту (50), обладающая свертывающим эффектом на кровь и антитромбоцитарным эффектом.

Краткое описание рисунков

Фиг.1. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (37 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «009» и «010» обозначают контроль и 203A205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно. Вертикальная ось обозначает пропускание (%), а горизонтальная ось обозначает время (мин): то же справедливо для Фиг.2-12, 15, 21 и 22, и 25-35.

Фиг.2. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 203A205G тромбина с модифицированной карбоксильной группой (37 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют 1 мкг/мл М-тромбина (то есть тромбином с модифицированной карбоксильной группой). Точки «002» и «001» обозначают контроль и 203A205G тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.3. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «079» и «080» обозначают контроль и 205A43А тромбин соответственно.

Фиг.4. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «083» и «084» обозначают контроль и 205A43А тромбин соответственно.

Фиг.5. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «056» и «055» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.6. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина с модифицированной карбоксильной группой (15 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «042» и «041» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.7. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (7,5 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 5 мг/мл ристоцетина. Точки «058» и «057» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.8. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (30 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добавлением 1 мкг/мл М-тромбина. Точки «064» и «063» обозначают контроль и 205A43А тромбин с модифицированной карбоксильной группой соответственно.

Фиг.9. График, демонстрирующий антитромбоцитарный эффект 205A43А тромбина (15 мкг/мл) на тромбоцитемию, где агрегацию тромбоцитов индуцируют добав