Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности brassica napus, имеющих хорошее агрономическое качество

Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности brassica napus, имеющих хорошее агрономическое качество

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способу получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности рапса Brassica napus с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 Brassica oleracea, имеющих хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью. Изобретение также относится к способу получения гибридных семян Brassica napus и их потомства, а также использования маркеров для селекции.

Линии-восстановители фертильности для размножения системы мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogu-INRA рапса (Brassica napus L.) были основой целью исследований в течение последних нескольких лет. Широкое обратное скрещивание и селекция были необходимы для улучшения их женской фертильности и получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности. Так называемые «double low-двухнулевые» разновидности - это те, которые содержат низкий уровень эруковой кислоты, а также низкий уровень глюкозинолатов в шроте после экстракции масла. Однако в размножении этих линий все еще могут встречаться трудности (перестройки интрогрессии, возможная связь с негативными особенностями) вследствие большой величины интрогрессии редьки.

Поэтому авторы изобретения поставили себе цель получить новую улучшенную двухнулевую линию-восстановитель фертильности с хорошим агрономическим качеством.

Эта цель была достигнута новым способом получения рекомбинантной двухнулевой линии-восстановителя фертильности для ЦМС Ogu-INRA рапса. Первая задача данного изобретения относится к способу получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности Brassica napus для мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, лишенный аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 из Brassica oleracea; которые имеют хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью, упомянутый способ включает в себя следующие стадии:

а) скрещивание двухнулевых линий ЦМС ярового рапса Brassica napus с вырезанной вставкой генома редьки с двухнулевой линией ярового рапса сорта Drakkar для формирования гетерозиготного растения Brassica napus с восстановленной фертильностью,

b) облучение перед мейозом гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью, полученных на стадии а), гамма-лучами,

с) перекрестное опыление цветков, полученных на стадии b), с двухнулевой яровой линией ЦМС Wesroona,

d) тестирование потомства на мощность, женскую фертильность и уровень переноса гена ЦМС,

e) селекция линий потомства.

В данном изобретении термин «линия(и)» означает растение, которое в основном гомозиготно и воспроизводится самоопылением.

Способ по п.1, в котором доза облучения на стадии b) составляет 65 Грэй в течение 6 минут.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации способа по данному изобретению двухнулевая линия ЦМС ярового Brassica napus на стадии а) является линией R211.

R211 представляет собой яровую линию-восстановитель фертильности INRA. Drakkar - это зарегистрированная яровая французская разновидность. Wesroona - это зарегистрированная яровая австралийская разновидность.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации способа по данному изобретению тестирование выполняется с комбинацией из пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418.

Другая задача данного изобретения относится к двухнулевым линиям-восстановителям фертильности Brassica napus для ЦМС Ogura, представляющим собой делецию вставки Rfo в аллели Pgi-2 редьки, рекомбинированной с геном Pgi-2 Brassica oleracea и имеющим хорошие агрономические качества, отличающееся женской фертильностыо, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации двухнулевые линии-восстановители фертильности представляют собой уникальную комбинацию пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418.

Другая задача данного изобретения относится к способу формирования гибридных растений Brassica napus и их потомства, полученных следующими стадиями:

а) получение линий-восстановителей фертильности, продуцированных по пункту 1, и скрещивание их для получения гомозигот,

b) использование упомянутой линии-восстановителя фертильности на делянке для получения гибрида как опылителя,

с) использование ЦМС стерильных растений для получения гибридов на делянке в качестве растений, продуцирующих гибридные семена и

d) сбор гибридных семян с мужских стерильных растений.

Другая задача данного изобретения относится к семенам растений Brassica, полученных способом по данному изобретению.

Еще одна задача изобретения относится к семенам Brassica napus, депонированным в NCIMB Limited (Национальные Коллекции индустриальных пищевых и морских бактерий), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK, 4 июля , 2003 под номером NCIMB41183.

Другая задача данного изобретения относится к использованию по меньшей мере четырех маркеров PGIol, PGIint, BolJon и CP418 или какой-либо их части, образующей по меньшей мере один полиморфный сайт, для характеризации рекомбинированных линий-восстановителей фертильности Brassica napus для ЦМС Ogura, имеющих делецию вставки Rfo в аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированных с геном Pgi-2 Brassica oleracea и обладающих хорошим агрономическим качеством, отличающимся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

В предпочтительном варианте реализации комбинация образована пятью маркерами PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и CP418.

В данном изобретении выражение "какая-либо часть их, образующая по меньшей мере один полиморфный сайт" означает какую-либо часть последовательности, демонстрирующую по меньшей мере отличие между последовательностью типа B.oleracea и последовательностью типа B.rapa.

Такие маркеры представлены в нижеследующих чертежах и списках последовательностей линии R2000.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации данное изобретение относится к:

- маркеру PGIol, который амплифицирован с использованием праймеров PGIol U и PGIol L

(PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3^',

PGIol L: 5TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3');

- маркеру PGIint, который амплифицирован с использованием праймеров PGIint U и PGIint L

(PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3',

PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3');

- маркеру PGIUNT, который амплифицирован с использованием праймеров PGIol U и PGIint L

(PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3',

PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3');

- маркеру BolJon, который амплифицирован с использованием праймеров BolJon U и BolJon L

(BolJon U: 5'GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3',

BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3');

- маркеру CP418, который амплифицирован с использованием праймеров SG129 U и pCP418 L

(SG129 U: cf Giancola et al., 2003. Theor Appl. Genet (in press);

pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3').

Другая задача данного изобретения относится к маркерам PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и CP418 со следующими последовательностями:

маркер PGIol R2000:

Маркер PGIUNT R2000:

Маркер PGIint R2000:

Маркер BolJon R2000:

Маркер CP418L R2000:

В прилагающихся нижеследующих чертежах использованы следующие сокращения:

Dra	Drakkar
Rel-15-1,E38,R15	R2000
Hete, Hel, R211 .Drakkar	гетерозиготный R211 *Drakkar,
Darm	Darmor
Bol	Brassica oleracea
Bra,B.rap	Brassica rapa
GCP A18-A19, Wes, Aust	Wesroona
Sam, SamlPGIolSunt5	Samourai
RRH1, ba2c	RRH1
rav, N.WR	гибрид Brassica napus*дикая редька

Фиг.1 иллюстрирует облучение гамма-лучами и продукцию F2.

Фиг.2 иллюстрирует результаты посадки семян "R211" и "R2000".

Фиг.3 иллюстрирует число семян на стручок в различных линиях.

Фиг.4 иллюстрирует локализацию праймера PGIol в сегменте последовательности PGI из базы данных. На этой фигуре:

PGIol: - праймер PGIolU (именуемый в SGAP (Society for Growing Australian Plants - Общество австралийских растений): BnPGIch 1 U);

- праймер PGIol L (именуемый в SGAP: Bn PGIch 1 L);

PGIint: - праймер PGIint U;

- праймер PGIint L (за пределами приведенной последовательности).

Фиг.5 иллюстрирует гель-электрофорез гена PGI-2 (PGIol), маркера ПЦР (полимеразная цепная реакция) и SG34, маркера ПЦР, близкого к Rfo.

Фиг.6 иллюстрирует сегмент ДНК Pgi-2, амплифицированный с помощью ПЦР с праймерами PGIol.

Фиг.7 иллюстрирует переваривание продукта ПЦР PGIol с помощью Msel. На этой фигуре:

Sam и Darm представлены полосой 75 bp (пар оснований).

Drak, R21 l.Dk и R2000 представлены полосой 70 bр (Акриламид 15%).

8 - сходно с Samourai (75 bp); смесь с Drakkar (70 bр) позволяет визуализацию двух полос.

Фиг.8 иллюстрирует электрофорез маркера PGIUNT в агарозном геле.

На этой фигуре:

полоса PGIUNT (около 980 bp) представлена в B.oleracea, B.rapa cv Asko, поддерживающей и восстанавливающей фертильность в линиях за исключением "R211".

Амплификация в редьке и Arabidopsis отсутствует.

В различных генотипах Brassica амплифицировалась только одна полоса. Размер полосы сходен, но последовательности различны.

Фиг.9 иллюстрирует гель-электрофорез маркера ПЦР PGIint.

На этой фигуре PGIint линии 7 редьки имеет около 950 bp. Это такая же полоса, как в восстановленных RRH1 и R113. Она не обнаружена в R211. Ее также нет в R2000. Однако полоса PGIint имеет сходный размер около 870 bp в различных видах рода Brassica, но последовательности отличаются.

Фиг.10 иллюстрирует электрофорез маркера ПЦР BolJon в агарозном геле.

Фиг.11 иллюстрирует электрофорез маркера CP418 в агарозном геле.

На этой фигуре полоса CP418 (около 670 bp) специфична для генома B.oleracea. Она представлена у B.ol*, B.napus (Samourai, Drakkar, Pactol и гетерозиготного R2111*Dk). Она отсутствует у рапса с восстановленной фертильностью (RRH, R113 и R211). Она присутствует у гомозиготной R2000.

Фиг.12 иллюстрирует суммарную таблицу маркеров.

Фиг.13 (13(a), 13(b)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера PGIol с Arabidopsis, редькой, B.rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.14 (14(a), 14(b), 14(c), 14(d)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера PGlint-UNT с Arabidopsis, редькой, B.rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.15 (15(a), 15(b), 15(c)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера CP418L с Arabidopsis, редькой, B. rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.16 (16 и 16bis) иллюстрирует маркеры BolJon у Arabidopsis, редьки и B.rapa. Их первичная структура сравнивается с последовательностями DB Arabidopsis (AC007190 концевой участок - AC011000 начальный участок), концевым участком EMBH959102 и начальным участком EMBH448336 B.oleracea и репрезентативной консенсусной последовательностью полос 1 и 2 маркеров SG129 в B.napus (в линиях Drakkar и Samourai соответственно).

Начиная с 836-й bp, последовательности ACG7190 - AC11000 и GCPATpBOJ не проявляют близкой гомологии с последовательностями Brassica.

Последовательности редьки и B.rapa (GCPconsen RsRf BOJ и BR) все еще близко гомологичны таковым B.napus с 858-й bp до 900-й bp и 981-й bp соответственно.

Кроме того, в редьке обнаружена только частичная гомология с последовательностью Brassica.

У вида B.rapa cv Asko остаток последовательности BolJon может быть после делеции 78 bp снова сравнен по структуре с таковыми B.oleracea и B.rapa в B.napus, начиная с 1057 bp до праймера BolJon L.

Фиг.17 (17 и 17bis) иллюстрируют локализацию праймеров Pgi-2 в последовательности th MJB21.12 Arabidopsis.

Фиг.18 иллюстрирует локализацию праймеров BolJon в гене mipsAtl62850 и перекрывающиеся участки клонов th AC007190 и AC011000 Arabidopsis. Представлено сравнение его первичной структуры с продуктом ПЦР BolJon в Arabidopsis (740 bp). Следует понимать, однако, что примеры приводятся как способ иллюстрации задачи изобретения, но никоим образом не образуют ограничений изобретения.

Пример I: Способ получения двухнулевой линии-восстановителя фертильности Brassica napus с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки, рекомбинированный с геном Pgi-2 Brassica oleracea, имеющих хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

Материалы и методы:

Генотипы: линию «R211» с вырезанной вставкой редьки скрещивали с яровым низкоглюкозинолятным (GLS) рапсом «Drakkar» для получения потомства Fl ('R211*Dk'). Яровая низкоглюкозинолятная ЦМС линия «Wesroona» (австралийского происхождения) использовалась для последующих скрещиваний. В качестве контроля в молекулярном анализе использовались: озимая линия с восстановленной фертильностью, происходящая от линии «Samourai» и несущая полную («RRHl») или неполную («R113») интрогрессию, а также европейская линия 7 редьки, азиатская редька с восстановленной фертильностью D81, гибрид Brassica napus*дикая редька, Brassica oleracea и B.rapa cv Asko, Arabidopsis thaliana.

Гамма-облучение: цветущие растения целиком были обработаны гамма-лучами от источника ⁶⁰Cо на контролируемой делянке. Сублетальная доза в 65 Грэй давалась перед мейозами.

Скрещивания и получение [поколения] F2: облученные растения переносили в защищенную от насекомых оранжерею после удаления цветочных почек, размер которых превышает 2 мм. Облученное потомство Fl использовали для опыления линии ЦМС «Wesroona» вручную. Восстановленным растениям F1 позволяли дать урожай семей растений F2, который собирали индивидуально и тщательно высевали на полевые испытания параллельно с необлученным контролем (Фиг.1).

Фенотипическая селекция: при полевых испытаниях оценивали три визуальных критерия (по шкале от 1 до 5) в течение 2 лет на 1200 растениях потомства F2 плюс 44 контрольных (82 330 оцененных растений):

1 - вегетационная мощность,

2 - нормальность соотношения фертильных/стерильных растений в расщеплении F2 и

3 - женская фертильность (развитие стручка и высев семян).

Последующие самоопыленные поколения избранных семей получали как на делянке, так и в оранжерее и продуцировали гомозиготные линии (F4) для дальнейшего анализа. Изозимный анализ выполняли, как описано в Delourme R. and Eber F. 1992. Theor Appl Genet 85: 222-228, развитие маркера (Fourmann M et al. 2002. Theor Appl Genet 105:1196-1206.): ПЦР-продукты оценены по секвенированию. Проверка первичной структуры выполнена с использованием программы Blast NCBI (Национальный Центр Биотехнологической информации США) и Uk Crop Net Brassica DB, а также программного обеспечения Multialin INRA Toulouse.

Способ:

Была выбрана одна низкоглюкозинолятная яровая гомозиготная линия с восстановленной фертильностью «R211», для которой уже показаны делеции в интрогрессии (Delourme R. and Eber F. 1992. Tlieor Appl Genet 85: 222-228. Delourme R et al. 1998. Theor Appl Genet 97: 129-134. Delourme R. et al. 1999.10 Int. Rapeseed Congress, Canberra.). Несколько молекулярных маркеров утрачены на обеих сторонах Rfo, такие как spATCHIA (Fourmann M et al. 2002. Theor Appl. Genet 105:1196-1206), spSG91 (Giancola S et al. 2003. Theor Appl Genet (in press)). "R211" утратила изозимную экспрессию аллели Pgi-2 гена редьки, но также и одну из аллелей Pgi-2 генома B.oleracea (1,2). Далее, гомозиготная "R211" демонстрирует сцепленные негативные черты, такие как низкая вегетационная мощность и очень малое количество семян. Было предположено, что эти растения утратили хромосомный сегмент рапса. Соотношение фертильности в поколении F2, полученном из этого материала, ниже ожидаемого (64% вместо 75%). Была начата программа, в которой попытались добиться рекомбинации между Rfo, несущим интрогрессию из этой вырезанной линии, и гомологичной хромосомой из двухнулевой линии B.napus.

Известно, что ионизирующая радиация индуцирует хромосомные перестройки в результате двухнитевых разрывов и последующих аберрантных соединений концов. Облучение гамма-лучами использовалось на гетерозиготных растениях F1, полученных от линии "R211", для индуцирования разрывов хромосом непосредственно перед мейозом, с целью добиться рекомбинации вырезанной интрогрессии редьки в геноме рапса.

Результаты:

Очень малое количество семей из 1200 тестированных семей F2 имели лучшие оценки по трем критериям.

Только одна, «R2000», оказалась способной продуцировать нормальное соотношение фертильных растений у самоопыленного потомства со стабильным восстановлением хороших агрономических характеристик, таких как хорошая женская фертильность при нормальном числе семян по сравнению с линией «R211» (Фиг.2 и 3). Эта семья была получена в результате 6-минутной обработки облучением при дозе 65 Грэй в час.

Анализ глюкозинолятов подтвердил их низкое содержание.

На Фиг.2 (растения «R211» и «R2000») R2000 демонстрирует нормальное цветение с нормальной внешней архитектурой.

На Фиг.3 (число семян на стручок) мы видим:

- показатели лучших семей F4 «R2000» при самоопылении и при тестовых скрещиваниях;

- показатели ЦМС-линии "Pactol" рапса и контрольных "R211".

Пример II: селекция маркеров в гене Pgi-2

Изозимный анализ PGI: потомство от «R2000» экспрессирует аллель Pgi-2 рапса из генома B.oleracea, исходно утраченного в «R211».

Были определены три ПЦР-маркера для того, чтобы охарактеризовать семейство R2000 по сравнению с известными восстановителями фертильности рапса RRH1 и R113.

1) Маркер PGIol получен из последовательностей BrassicaDB, специфичных для генома Brassica. Амплификация отсутствует как в редьке, так и в Arabidopsis th., но присутствует в Brassica в виде одной полосы 248 bp.

2) Маркер PGIint амплифицировал более длинную часть гена Pgi-2, позволяя четкое различение между различными испытанными видами Brassica, Raphanus и Arabidopsis. Виды B.rapa и B.oleracea различались не по размеру полосы в агарозном геле, а по последовательности их полосы PGINT.

3) Маркер PGIUnt представляет собой комбинацию праймеров PGI ol U и PGI int L. Этот маркер обладал специфичностью маркера PGIol, но амплифицировал более длинный участок, чем маркер PGIint.

II.1 Маркер PGIol

С праймерами PGIol родительская линия «R211» демонстрирует отсутствие амплификации, тогда как в протестированных озимых линиях присутствует полоса 248 bp. Ее последовательность ДНК гомологична последовательности PGI-2 из Crop Net UK DB для вида Brassica и последовательности из предыдущей работы авторов (наименованной последовательностями SGAP) (Локализация праймеров SGPGI chou, Фиг.4).

Это ортолог клона MJB21-12 на хромосоме V (34543 bp) у Arabidopsis (NCBI DB).

PGIol плюс SG34 для проведения теста на гомозиготность:

комбинированное использование двух наборов праймеров в смешанной ПЦР: PGIol, маркирующего ген Pgi-2, отсутствующего в гомозиготном растении с восстановленной фертильностью, и SG34 (из S. Giancola et al., Giancola S et al. 2003. Theor Appl. Genet. (in press)) - маркера, очень близкого к гену Rfo, было направлено на различение гомозиготных и гетерозиготных растений среди фертильных растений в расщеплении потомства F2, полученного из "R211". Вместо использования SG34 возможно использование какого-либо другого маркера, близкого к гену Rfo или входящего в его состав.

Только одно семейство "R2000" продемонстрировало отсутствие различий между гомозиготным и гетерозиготным потомством:

ген Pgi-2 присутствует в гомозиготе "R2000" при том, что он отсутствует в родительской гомозиготной R211.

На Фиг.5 (маркеры ПЦР PGIol и SG34):

гомозиготное семейство "R2000" восстанавливает полосу PGIol.

Последовательность ДНК полосы подтверждает гомологию с известными последовательностями Pgi-2 в Arabidopsis и Brassica. Контрольные генотипы (Drakkar, Pactol, и Samourai, Darmor) имеют такой же паттерн на геле. Последовательность этой общей полосы позволяет подтвердить высокую степень их гомологии, поскольку они практически сходны, за исключением замены одного основания.

У гомозиготного семейство «R2000» восстанавливается полоса PGIol типа Brassica oleracea. Это отличает ее от известного восстановителя фертильности группы Samourai.

Эта амплифицированная часть Pgi-2 очень консервативна, и трудно обнаружить какие-либо отличия между различными генотипами. Более длинная часть гена Pgi-2 была исследована.

II.2 Маркеры PGIUNT и PGIint

Паттерн электрофореза продуктов ПЦР:

маркер PGIUNT: второй обратный праймер PGIint L был сконструирован по большей части последовательности Pgi-2, чтобы амплифицировать и консервативные, и вариабельные участки гена.

При использовании праймера PGIol U амплифицируется полоса 980 bp только в геноме Brassica.

В «R211» не наблюдается каких-либо полос, а в гомозиготной «R2000» наблюдается полоса PGIUNT, как и в родительской линии Drakkar.

На Фиг.8 (маркер PGIUNT):

маркер PGIint амплифицировал сегмент PGIUNT. Верхний праймер PGIint позволяет амплификацию у всех тестируемых видов, что дает возможность провести ясное различие между Arabidopsis, редькой и Brassica. B.rapa и B.oleracea не различались по величине полосы в агарозном геле, но различались по своим последовательностям PGIint. Все протестированные генотипы с восстановленной фертильностью, за исключением линии «R211», демонстрируют полосу европейской редьки и одну полосу Brassica, гомологичную таковой B.rapa.

Гомозиготная «R2000» не демонстрирует полосу PGIint редьки, как в вырезанной родительской линии «R211», но демонстрирует полосу Brassica, гомологичную таковой B.oleracea.

Электрофорез маркера PGIint представлен на Фиг.9.

Анализ последовательности:

сравнение последовательностей PGI из баз данных.

Известен сегмент PGI величиной около 490 bp.

Последовательности сегмента величиной около 490 bp из различных генотипов (B.oleracea, B.rapa, B.napus) были изучены в лаборатории авторов, и некоторые последовательности переданы в Brassica Crop Net DB: EMAF 25875 до 25788 (M.Fouramnn) (4). Эти последовательности очень консервативны.

Сравнение последовательностей PGI B.rapa и B.oleracea (Фиг.13 и 14):

сравнение между последовательностями PGI мы получили из протестированных генотипов видов B.oleracea и B.rapa, оно показало, что эти последовательности различаются заменами 21 основания. Эти замены позволили различить последовательности PGIint из каждого из других протестированных генотипов рапса, гомологичных либо B.rapa cv Asko (RRH1 и R113) или B.oleracea (Drakkar, R211*DK, но также R2000).

Пример III: отбор маркера в области, близкой к Rfo

Окружающие ген Rfo во вставке редьки маркеры определены, чтобы облегчить клонирование гена (Desloires S. et al. 2003. EMBO reports 4, 6:588-594). Один из них, маркер ПЦР SGI 29, располагается очень близко к Rfo (Giancola S. et al. 2003. Theor Appl. Genet. (in press)): он коамплифицировал различающиеся полосы геномов B.oleracea и B.rapa у B.napus, однако полосу редьки очень трудно разглядеть на агарозном геле.

Мишенью последовательности SG129 был ортолог клона (AC011000, в локусе F16P17) у Arabidopsis thaliana. Этот клон перекрывается с соседним примыкающим (контиг) клоном Arabidopsis (AC07190).

В базе данных Brassica Crop Net DB авторы обнаружили один клон B.oleracea (EMBH448336, 764 bp), близкий по первичной структуре к начальному участку A011000, а второй клон B.oleracea (EMBH53971), который на карте генома Arabidopsis удален на приблизительно 300 bp, близкий к концевому участку AC07190.

Мы сконструировали новый ПЦР-маркер BolJon, занимающий место между двумя клонами B.oleracea. Мы удостоверились в том, что этот маркер позволяет амплифицировать специфические полосы ПЦР в различных генотипах, сравниваемых в данной заявке.

На Фиг.16 (гель-электрофорез ПЦР-продуктов BolJon):

- У Arabidopsis амплифицировалась полоса BolJon 815 bp, гомологичная перекрывающемуся сегменту примыкающих участков.

- В диплоидных видах Brassiceae маркер BolJon демонстрирует различающиеся полосы: одна - 950 bp у B.oleracea и одна - 870 bp у B.rapa. Это показывает, что два клона B.oleracea (EMBH53971 и EMBH448336) представляют собой непрерывность в геноме Brassica, как это имеет место в ортологической последовательности у Arabidopsis.

- У B.napus эти две полосы коамплифицируются в поддерживающих линиях Samourai или Drakkar.

- В линии 7 редьки амплифицировалась одна полоса BolJon длиной около 630 bp. Полоса у редьки с восстановленной фертильностью cmsRd81 была немного меньше. У всех линий с восстановленной фертильностью одна из полос BolJon была такой же величины, как у линии 7 редьки. BolJon - это маркер интрогрессии редьки.

- Гомозиготные линии рапса с восстановленной фертильностью «RRH1», «R113», а также «R211» демонстрируют только полосу B.rapa и полосу редьки 630 bp, что предполагает, что ортолог B.oleracea гена-мишени отсутствует или он был модифицирован, когда сегмент хромосомы редьки был вставлен в исходный геном рапса B.oleracea.

Гомозиготные растения «R2000» демонстрируют присутствие маркера ПЦР редьки BolJon плюс две полосы BolJon Brassica, которые снова восстанавливают полосу B.oleracea, утраченную у «R211» и в других линиях-восстановителях фертильности.

Мы сконструировали праймер pCP418L, специфический для генома B.oleracea у тестируемых видов. С праймером SG129U он амплифицирует только одну полосу ПЦР (670 bp) у вида B.oleracea species (Фиг.17).

Амплификации ни у B.rapa, ни у редьки, ни у Arabidopsis не было, но присутствовала ясная полоса CP418 у поддерживающих линий B.napus. Ее последовательность строго гомологична последовательности EMBH448336. Этот маркер представляет собой очень консервативную последовательность ДНК, не допускающую полиморфизма между генотипами, за исключением присутствия или отсутствия.

У RRH1, R113 и у R211 отсутствовала полоса CP418, что показывает, как в предыдущем случае, что ортолог гена-мишени B.oleracea отсутствует или был модифицирован вследствие вставки сегмента генома редьки.

Гомозиготные растения «R2000» демонстрируют полосу CP418, восстанавливающую таковую, специфичную для B.oleracea.

В данном изобретении новая рекомбинантная низкоглюкозинолятная линия-восстановитель фертильности селекционирована с хорошей женской фертильностью. Низкое качество линии «R211» позволяет селекцию в поле редких рекомбинантных событий и характеризации семьи «R2000».

Гомозиготная линия «R2000» представляет собой уникальную комбинацию маркеров PGIol, PGIUNT, PGIint и BolJon по сравнению с до сих пор анализированными восстановителями фертильности рапса:

маркер PGIinT демонстрирует, что у гомозиготных линий рапса с восстановленной фертильностью RRH1 и R113 присутствует полоса европейской редьки плюс одна полоса Brassica, гомологичная геному B.rapa. «R2000» демонстрирует отсутствие полосы редьки, утраченной, как и в родительской вырезанной линии R211, но демонстрирует одну полосу Brassica, гомологичную B.oleracea. Ортологическая последовательность PGIint в собственном геноме B.rapa не амплифицируется с этим маркером в генетическом окружении линий R211 и Drakkar.

Последовательности маркера PGIol и маркера PGIUNT в линиях с восстановленной фертильностью RRH1 и R113 были гомологичны таковой B.rapa cv Asko. У «R2000» последовательность PGIUNT гомологична B.oleracea. Ортологическая последовательность в ее геноме B.rapa не амплифицируется с этим маркером в генетическом окружении линий R211 и Drakkar.

Маркер BolJon показал, что гомозиготные линии рапса с восстановленной фертильностью, включая "R211", демонстрируют присутствие полосы европейской редьки плюс только полосу B.rapa. 'R2000' демонстрирует две полосы «R211» плюс восстановленную полосу BolJon B.oleracea.

Маркер CP418 показал, что у «R2000» восстановился консервативный сегмент B.oleracea.

Гипотеза авторов состоит в том, что событие рекомбинации имело место в опыленной материнской клетке, которая дала растения «R2000». Вырезанная интрогрессия редьки затем интегрировалась в нормальный гомологичный сегмент хромосомы, несущий ген Pgi-2 типа B.oleracea, а последовательность - мишень BolJon, охарактеризованная этими маркерами, вероятно, происходит из двухнулевого генома Drakkar «00», присутствующего в облученном гетерозиготном гибриде «R211*DK».

Паттерн, наблюдавшийся для BolJon, предполагает, что событие рекомбинации привело в результате к формированию в семействе «R2000» особого сдвоенного участка, одна часть которого происходит от редьки, а другая - от B.oleracea.

1. Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности Brassica napus для мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogura, представляющий собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 из Brassica oleracea, характеризующейся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью, где упомянутый способ включает следующие стадии: a) скрещивание двухнулевых ЦМС-линий ярового Brassica napus, содержащих вырезанную вставку генома редьки, с двухнулевой линией яровой Drakkar для формирования гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью Brassica napus, b) облучение перед мейозом гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью, полученных на стадии а), гамма-лучами, c) перекрестное опыление пыльцой из цветков, полученных на стадии b), с двухнулевой яровой ЦМС-линией Wesroona, d) тестирование потомства на мощность, женскую фертильность и уровень переноса гена ЦМС, e) селекция линий потомства.

2. Способ по п.1, где доза облучения на стадии b) составляет 65 Гр в течение 6 мин.

3. Способ по п.1, где двухнулевой ЦМС-линией ярового Brassica napus на стадии а) является R211.

4. Способ по п.1, где тестирование на стадии d) выполнялось с комбинацией пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418, где указанные маркеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

маркер PGIol:
TCATTTGA	GTTGCGC	TCGCCTTG	GTGTTAT	GAATGAA	CAGTCAT	60
TT	CTG	TT	GAT	CAG	TTA	120
ACATGTG	AACTTAA	GGCTCCG	GTTGCAA	ACATGGT	TGTCAGC	180
GTT	CAG	GCT	AAC	TGC	ACT	240
AATCTTG	TATGAAT	TGATTAA	TGTTTGTT	TGACTCTT	TTCATTGT	248
CGG	TTG	ATT	TG	TC	TC
GTTTTCGT	AATAAAC	ATGTATA	TTTTTACA	CTGAATTT	TACCGGG
AC	CGA	АТС	AA	TC	TCT
GATGTAC
A
маркер РGIUNT:
TCATTTGA	GTTGCGC	TCGCCTTG	GTGTTAT	GAATGAA	CAGTCAT	60
TT	CTG	TT	GAT	CAG	TTA	120
ACATGTG	AACTTAA	GGCTCCG	GTTGCAA	ACATGGT	TGTCAGC	180
GTT	CAG	GCT	AAC	TGC	ACT	240
AATCTTG	TATGAAT	TGATTAA	TGTTTGTT	TGACTCTT	TTCATTGT	300
CGG	TTG	ATT	TG	TC	TC	360
GTTTTCGT	AATAAAC	ATGTATA	TTTTACAA	TGAATTTT	ACCGGGT	420
AC	CGA	АТС	AC	CT	CTG	480
ATGTACA	CTAGTCTC	TGTTCTTG	GATCATG	TATTTTCT	ATGTATTC	540
ATG	CA	GG	ATT	AC	AG	600
ACAGTAC	AGAAAGT	CAAAACT	GATGTTTT	TTTACAGT	GTGGAGA
AGA	GTT	CTG	AA	ТА	AGT
TCGGCAT	TCCGAAC	GCATTTG	TTTGGGA	GGTTGGT	AGGTACA
TGA	AAT	CAT	CTG	GGA	GTG
GTAAGTG	GTTTATTT	TTGTATA	TTCTCGTC	TTTCCGCT	CTTAGTGT
CTT	GG	AAT	CA	TG	AT
AACTGAA	CTTTTGCA	TTGCAGT	GTTGGAG	TACCATT	TCTACAG
ATT	GT	GCT	TCT	GTC	TAT
GGCTTCTC	TGGTTGA	GTACGGT	TTCTACTT	TCAGCCA	CATAAAA
TG	GAA	ACC	ТА	TCT	TGT
CTTAGGC	TTCTTTCT	TTTATTTC	TCTTAATG	TTCTTCTT	TTTTATTG	660
ATA	AT	CC	AT	TT	CA	720
TTCCCGTT	ATTTTCAA	GTTGTTAC	TCTCTAA	AAGAAGA	CTTCTTAG	780
TT	AA	TG	АТС	AAC	ТА	840

GATCCAG	ATATTCA	TTTTTTAA	TGGACTG	GTTTTTAA	GGGAGCT	900
CTG	GCC	AT	CAG	AG	TCA	960
AGCATTG	AGCATTT	GTCCACA	TTTGAGA	ATATACC	GAGTTGC	979
ATA	CCA	CCG	AGA	CGT	ATT
AGTTGTG	TTATACA	TTCTTGTC	TTTGCTAT	CCATCAA	TAGAGAT
TGA	GTT	TT	GT	CAC	TCG
TGAAGTT	AGTGTAG	ACGCATA	AGAGGTG	GGTGACT	GGACGAT
ATT	TCA	GGG	ATT	TTT	TTC
AGGTGCT	GGGTTAT
TTA	TG
маркер PGIint:
CAGCACT	CTTGCGG	GAATTTG	TTAAATTT	TTGTTTGT	СТСТТГСТ	60
AAT	TAT	TGA	GT	GA	TC	120
ATTGTTCG	TTCGTAC	AAACCGA	TATAATCT	TACAAAC	ATTTTCTA	180
TT	AAT	ATG	TT	TGA	CC	240
GGGTCTG	TACAATG	GTCTCCAT	TCTTGGG	CATGATTT	TTTCTACA	300
ATG	СТА	GT	GAT	AT	TG	360
TATTCAG	GTACAGA	AAGTGTT	AACTCTG	GTTTTAAT	ACAGTTA	420
АСА	AGA	CAA	GAT	TT	GTG	480
GAGAAGT	GCATTGA	GAACAAT	TTTGCATT	GGGACTG	TGGTGGA	540
TCG	TCC	GCA	TT	GGT	AGG	600
TACAGTG	AGTGCTT	TATTTGGT	TATAAAT	TCGTCCAT	CCGCTTG	660
GTA	GTT	TG	TTC	TT	CTT	720
AGTGTAT	TGAAATT	TTGCAGTT	CAGTGCT	GGAGTCT	CATTGTCT	780
AAC	CTT	TG	GTT	TAC	CT	840
ACAGTAT	TTCTCTGT	TTGAGAA	CGGTACC	TACTTTAT	GCCATCT	866
GGC	GG	GTA	TTC	CA	CATAAGA
AAAATGT	AGGCATA	TTTCTATT	ATTTCCCT	TAATGAT	AACCTT
CTT	TTC	TT	CT	TTC	TTTAAAG
TATTGCAT	CCGTTTTA	TTCAAAA	GTTACTGT	CTAAATC	GGG
TC	TT	GTT	CT	AAG	TACCCGT
CTTAGTA	CCAGCTG	TTCAGCCT	TTTAAATT	ACTGCAG	GAG
GAT	ATA	TT	GG	GTT	TCAACAC
AGCTTCA	ATTGATA	ATTTCCA	CACACCG	GAGAAGA	TAG
AGC	AGC	GTC	TTT	ATA	GACTTTTG
TTGCATTA	TGTGTGA	TACAGTTT	TTGTCTTT	GCTATGT	GA
GT	TTA	TC	TT	CCA
AGATTCG	AGTTATT	GTAGTCA	CATAGGG	GGTGATT
TGA	AGT	ACG	AGA	GGT
CGATTTC	TGCTTTAG	TTATTG
AGG	GG

маркер BolJon:
GATCCGA	TTCTCCTG	GAGATCA	CCAAACA	AACAACT	ACACAAA	60
TTC	TT	GCT	TCA	TGT	TAT	120
CTTTACTT	TAAATGG	ATGACAA	ATAGAAA	TTGCTCAT	TATTGTAC	180
GC	AAC	GAG	АТС	AG	AA	240
GGGATAA	TGTAGAA	AAACCGT	TAAGATT	TCCCTGAT	TCTCACTT	300
CAG	AAC	CTG	TTC	CC	AA	360
CCAGTAG	TTTTTCAC	TGAAGCG	ATCTACTT	GTATTCA	AATAAAA	420
GCG	AT	CAT	TG	CTG	AAA	480
GAAAGCT	AACATGT	GGATATA	GCATTGA	ACCAAGT	CACAAAC	540
GGT	GAA	CAA	TAC	AGT	TAC	600
ATTATAA	TCAGACC	GTTCACA	TGGCCTC	GACCACC	TCTAGCA	660
AGG	TTT	TTC	CAG	GCT	AAG	720
TTAAGCG	CATGGTC	ACGTATA	ATGAAAA	TTCTATCA	ATCCTAT	780
TAA	TGC	CAA	TGT	AA	AAA	840
ATAGAGC	ATAACAT	CGATACA	TTTCACTA	TCTGCAA	CTAAACA	900
TCT	TGT	TAG	AC	GTA	CAT	957
ATACAAA	AACTATG	ACAGATC	ACTACTA	AACACAG	TATGACA
CAA	CGA	AAA	CAG	TTC	CTG
TCGATAG	CATCCTCT	AAGTACC	GAGATAG	ATGAAAC	GTAAACA
TAA	GC	AAA	CAA	TAT	AAT
CAAAATT	AATTTCTC	TCACAAG	CTACAGA	GAGTTAT	AACATTTT
СТА	CA	GAC	ATA	CAT	CT
GTAAATA	CCATCAA	GACTAGA	CAGAGTT	ATAACAT	CTGTAAA
TTT	AAT	GAA	CTT	TAT	TGT
TCCAACA	CCACTAC	GCAGAGT	TATAACA	TCTGTAA	TCCAATC
AAA	ATA	TCT	TTG	ATG	AAA
ACCACTA	AACAAAG	CTATAAC	GTTTATAC	AGTTTCA	AATCTAC
CAG	CTC	ATT	AA	СТА	AAA
CTTTCCCC	AAATGAG	AATATCA	AAAGATG	CAATCAG	AAGAGTA
GT	CTT	CCC	TTT	ATA	CGA
CATCGTTT	AGATTAG	AAACTGA	TTACGTA	TGATTTG	AGTAGGC
TG	AAC	AAC	GAG	AGG
маркер СР418:
AATTTCTC	TCACAAG	CTACAGA	GAGTTAT	AACATTTT	GTAAATA	60
CA	GAC