Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток

Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способу выращивания и способу переноса генов для плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, и к плюрипотентным стволовым клеткам, полученным с использованием этих способов.

Уровень техники

Для продолжения жизни организмы обладают способностью быстро замещать и репарировать потерянные или поврежденные клетки и ткань, и эта способность известна как «регенерационная способность». Примеры «регенерационной способности» у высших животных включают общеизвестные феномены заживления ран кожи и кровеносных сосудов, но известно, что даже паренхимные органы, такие как печень и почки, подвергаются клеточному росту и реконструкции ткани для быстрого восстановления гомеостаза ткани в ответ на повреждение ткани. В недавние годы отмечались попытки использования этой природной «регенерационной способности» биологических организмов для достижения излечивания или ослабления различных заболеваний и ран, и подобные новые медицинские способы стали известны как «регенеративная медицина».

Стволовые клетки играют центральную роль в практике «регенеративной медицины». «Стволовые клетки» могут быть в общем случае определены как недифференцированные клетки, способные дифференцироваться в специализированные клетки или полифункциональные клетки, а также способные самовоспроизводиться, делая возможным генерирование клеток, идентичных самим себе. Уникальные стволовые клетки обнаружены в каждом типе ткани и клеток, и, например, клетки крови, такие как эритроциты, лимфоциты и мегакариоциты, продуцируются через клетки-предшественники, произведенные из стволовых клеток, известных как «гемопоэтические стволовые клетки», тогда как клетки скелетных мышц продуцируются из стволовых клеток/клеток-предшественников, известных как «сателлитные клетки» и «миобласты». Дополнительные типы, которые были идентифицированы до сих пор, включают невральные стволовые клетки, которые обнаружены в нервной ткани, такой как головной мозг и спинной мозг, и продуцируют нейроны и глиальные клетки, эпидермальные стволовые клетки, которые продуцируют эпидермальные клетки и клетки волосяных фолликулов, овальные клетки (печеночные стволовые клетки), которые продуцируют гепатоциты и клетки желчных протоков, и сердечные стволовые клетки, которые продуцируют кардиомиоциты.

Некоторые способы лечения регенеративной медицины с использованием стволовых клеток или клеток-предшественников, полученных из таких клеток, уже были представлены, и инфузионные трансплантационные способы с использованием гемопоэтических стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников хорошо известны в лечении состояний, вызываемых отсутствием или функциональной недостаточностью клеток крови, таких как лейкоз и пластическая анемия. Однако стволовые клетки, присутствующие в паренхимных органах, таких как головной мозг, сердце или печень, являются технически трудными для получения из живых тканей и/или для культивирования in vitro, и такие стволовые клетки также обычно имеют низкий потенциал пролиферации. Стволовые клетки могут быть также извлечены из тканей трупов, но медицинское использование полученных таким образом клеток связано с этическими проблемами. Таким образом, регенеративные способы лечения невропатии, кардиопатии и т.п. будет требовать развития способов для генерирования желаемых типов клеток с использованием клеток, других, чем стволовые клетки, присутствующие в таких тканях-мишенях.

Прежде всего, способы использования «плюрипотентных стволовых клеток» могут быть упомянуты в качестве стратегий, основанных на этом подходе. “Плюрипотентные стволовые клетки” определяются как клетки, способные к продолжительной или фактически неограниченной пролиферации in vitro при сохранении их недифференцированного состояния, проявления нормального кариотипа (хромосомы) и наличия способности дифференцироваться во все типы клеток трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и эндодермы) при подходящих условиях. В настоящее время большинство известных плюрипотентных стволовых клеток являются эмбриональными стволовыми клетками (ES-клетками), выделенными из раннего эмбриона, и аналогичными эмбриональными половыми клетками (EG-клетками), выделенными из фетальных примордиальных эмбриональных клеток, где и те, и другие являются предметами данного изобретения.

ES-клетки могут быть выделены в виде популяции недифференцированных стволовых клеток перенесением внутренней клеточной массы эмбриона стадии бластоцисты в культуру in vitro и повторением процесса отделения и пассирования этой клеточной массы. Клетки имеют подходящую плотность клеток на клетках-фидерах, полученных из первичных культивируемых мышиных эмбриональных фибробластов (далее называемых MEF-клетками), полученных из мышиной фетальной ткани, или мышиных стромальных клеток, таких как клетки STO, и повторяемое пассирование с частой заменой культуральной среды может привести к установлению клеточной линии, сохраняющей свойство недифференцированных стволовых клеток. Другим признаком ES-клеток является присутствие фермента теломеразы, который проявляет активность поддержания длины хромосомной теломеры, и этот фермент придает ES-клеткам способность фактически неограниченного клеточного деления in vitro.

Линии ES-клеток, полученные таким образом, являются «плюрипотентными», так как они могут повторяемо выращиваться и пассироваться почти неограниченно при поддержании нормального кариотипа, и они способны дифференцироваться в многообразные различные типы клеток. Например, при трансплантации ES-клеток в тело животного подкожно, интраабдоминально или интратестикулярно они образуют опухоли, называемые «тератомами», но эти опухоли содержат смесь различных клеток и тканей, в том числе нейроны, остеоциты, хондроциты, кишечные клетки, мышечные клетки и т.п. В мышах, внутриматочная трансплантация в псевдобеременную мышь агрегатного эмбриона, генерированного инфузионным трансплантатом ES-клеток в эмбрион стадии бластоцисты или агрегацией (группированием) с эмбрионом стадии восьми клеток, приводит к генерированию «химерной мыши», которая является отпрыском, обладающим дифференцированными клетками, происходящими из этих ES-клеток, во всем теле или в частях его органов и тканей. Этот способ часто используют в качестве основного способа для генерирования “мышей с нокаутом”, в которых определенные гены являются искусственно разрушенными или модифицированными.

Хорошо известно также, что ES-клетки также индуцируются к дифференцировке в различные типы клеток культивированием in vitro. Хотя конкретный способ различается в зависимости от типа клетки, обычно используют способ индукции дифференцировки посредством образования “эмбриоидного тела” (далее называемого “EB”), которое является клеточной массой в эмбрион-подобном состоянии, образуемой агрегацией ES-клеток культивированием в суспензионной культуре. Такой способ может продуцировать клетки, имеющие характеристики эндодермы, эктодермы и мезодермы фетальной стадии, а также дифференцированные клетки, такие как клетки крови, сосудистые эндотелиальные клетки, хондроциты, клетки скелетных мышц, клетки гладких мышц, кардиомиоциты, глиальные клетки, нейроны, эпителиальные клетки, меланоциты, кератиноциты, адипоциты и т.п. Дифференцированные клетки, получаемые культивированием in vitro таким способом, имеют по существу такие же структурные и функциональные признаки, что и клетки, присутствующие в органах и тканях, и эксперименты с трансплантатами с использованием экспериментальных животных продемонстрировали, что происходящие из ES-клеток клетки прикрепляются к органам и тканям и нормально функционируют.

В отношении обзоров свойств ES-клеток и способов их культивирования и их способностей к дифференцировке in vivo и in vitro, авторы ссылаются на следующую литературу: Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) (Непатентный документ 1); Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002) (Непатентный документ 2).

EG-клетки могут быть получены стимуляцией фетальных половых клеток, известных как примордиальные половые клетки, на клетках-фидерах, таких как клетки MEF или клетки STO, таким же образом, что и ES-клетки, с использованием фактора ингибирования лейкемии (далее называемого LIF) и основного фактора роста фибробластов (далее называемого bFGF/FGF-2), или химических агентов, таких как форсколин (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Koshimizu et al., Development 122: 1235, 1996). Было подтверждено, что EG-клетки имеют свойства, очень близкие к свойствам ES-клеток и обладают плюрипотентностью (Thomson & Odorico, Trends Biotechnol. 18:53, 2000). Таким образом, во всем этом описании термин «ES-клетки» может включать и «EG-клетки».

После того как Thomson et al. впервые установили ES-клетки из примата (макака резуса) в 1995 году, концепция регенеративной медицины с использованием плюрипотентных стволовых клеток начала приближаться к области реалий (Патент США № 5843780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995). Позднее эти исследователи использовали сходные способы для успешного выделения и установления линий ES-клеток из ранних эмбрионов человека (Science 282: 114, 1998). Позднее исследовательские группы в Австралии и Сингапуре представили сходные сообщения (Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; Международная публикация патента № WO00/27995), и в настоящее время были зарегистрированы 20 различных линий ES-клеток человека в Национальных институтах здравоохранения США (NIH) (http://stemcells.nih.gov/registry/index). Gearhart et al. также удалось создать линию EG-клеток человека из примордиальных половых клеток человека (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; Патент США № 6090622).

При использовании этих плюрипотентных стволовых клеток для получения материалов для исследований или продуктов регенеративной медицины важно, чтобы используемые способы пассирования поддерживали недифференцированное состояние и высокую эффективность (потенциал) пролиферации этих клеток. Клетки MEF или подобные клетки (такие как клетки STO) используют обычно в качестве клеток-фидеров (питающих клеток) для ES/EG-клеток для поддержания недифференцированного состояния и высокой эффективности пролиферации этих клеток. Важным является также добавление фетальной телячьей сыворотки (далее называемой здесь FBS) к культуральной среде и решающим является выбор FBS-продукта, который пригоден для культивирования ES/EG-клеток, обычно с добавлением FBS в количестве приблизительно 10-20%. LIF был также идентифицирован как фактор, который поддерживает недифференцированное состояние ES/EG-клеток, полученных из мышиного эмбриона (Smith & Hooper, Dev. Biol. 121:1, 1987; Smith et al., Nature 336:688, 1988; Rathjen et al., Genes Dev. 4:2308, 1990), и добавление LIF к культуре может более эффективно поддерживать недифференцированное состояние (см. следующую литературу: Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) (Непатентный документ 1) и Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002) (Непатентный документ 2)).

Однако способы культивирования, используемые для этих классических ES/EG-клеток, являются непригодными, когда ES- (или EG-) клетки используются для регенеративной медицины или для других практических целей. Одной из причин этого является то, что ES-клетки человека являются нечувствительными к LIF и отсутствие клеток-фидеров вызывает смерть этих клеток или потерю недифференцированного состояния и дифференциацию в различные типы клеток (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Использование клеток-фидеров само по себе является другой проблемой, так как они как системы сокультивирования увеличивают издержки производства и малопригодны для крупномасштабного культивирования, в то время как отделение и очистка ES-клеток от клеток-фидеров является необходимой, когда фактически должны использоваться эти ES-клетки. В будущем, при применении ES-клеток человека и других плюрипотентных стволовых клеток в качестве источников клеток для регенеративной медицины и, в частности, для клеточной трансплантационной терапии, применение продуктов клеток, полученных из животных (не человека), таких как клетки MEF, и FBS будут нежелательными вследствие рисков, включающих потенциальную инфекцию этих ES-клеток вирусами других животных и загрязнение антигенными молекулами, которые могут узнаваться в качестве гетероантигенов (Martin et al., Nature Med. 11:228, 2005).

Таким образом, для усовершенствования способов культивирования ES/EG-клеток и их модификации для того, чтобы они были пригодными для будущего применения, должны быть предприняты активные действия для развития заменителей FBS (Международная публикация патента № WO98/30679) и для использования в качестве клеток-фидеров клеток человека вместо клеток MEF (Richards et al., Nature Biotech. 20:933, 2002; Cheng et al., Stem Cells 21:131, 2003; Hovatta et al., Human Reprod. 18:1404, 2003; Amit et al., Biol. Reprod. 68:2150, 2003). Другой заманчивой перспективой является развитие способов культивирования без использования питающих клеток (фидеров). Carpenter et al. сообщили, что посев ES-клеток в покрытой Матригелем или Ламинином культуральной чашке и добавление кондиционированной клетками MEF среды к культуральной среде делают возможным пролонгированное культивирование ES-клеток человека, которые сохраняют их недифференцированное состояние и плюрипотентность (Xu et al., Nature Biotech. 19:971, 2001 (Непатентный документ 3); Международная публикация патента № WO01/51616 (Патентный документ 1)). Той же самой группе удалось также создать более эффективную систему культивирования ES-клеток разработкой бессывороточной среды, содержащей добавленный bFGF/FGF-2 или фактор стволовых клеток (далее называемый здесь SCF) (Международная публикация патента № WO03/020920 (Патентный документ 2)). Система культивирования ES-клеток с использованием той же самой бессывороточной среды, не требующая питающих клеток (фидеров), сообщалась также израильской исследовательской группой (Amit et al., Biol. Reprod. 70:837, 2004 (Непатентный документ 4)). Недавно также сообщалось о способе поддержания недифференцированного состояния ES-клеток человека добавлением bFGF/FGF-2 и антагониста костного морфогенетического белка Noggin (Xu et al., Nature Methods 2:185, 2005). Отдельно было показано, что простое добавление ингибитора гликогенсинтазы-киназы (GSK)-3 к культуральной среде может эффективно поддерживать недифференцированное состояние ES-клеток мыши и человека без добавления факторов роста или подобных им и без использования клеток-фидеров (Sato et al., Nature Med. 10:55, 2004 (Непатентый документ 5)).

Таким образом, хотя предлагаются новые способы для культивирования плюрипотентных стволовых клеток без применения клеток-фидеров, фактическое осуществление и промышленное применение таких клеток потребует еще большей эффективности выращивания и способов культивирования плюрипотентных стволовых клеток.

Одним хорошо известным фактором, который поддерживает недифференцированное состояние мышиных ES/EG-клеток и увеличивает их эффективность пролиферации, является вышеуказанный LIF, и, хотя LIF-родственное семейство IL-6 подпадает под эту категорию (Yoshida et al., Mech. Dev. 45:163, 1994; Koshimizu et al., Development 122:1235, 1996), очень мало других примеров сообщалось в литературе. Недавно, сообщалось о бессыворточной среде, содержащей добавленные bFGF/FGF-2 или SCF для значительного усиления эффективности пролиферации ES-клеток человека (Международная публикация патента № WO03/020920 (Патентный документ 2)).

Вследствие активной, т.е. пролиферирующей природы ES-клеток в сравнении с другими типами клеток, мало попыток предпринималось для действительного исследования их эффективности пролиферации; однако, нужды регенеративной медицины потребуют увеличенной пролиферации таких клеток.

Одной из проблем, встречающейся в настоящее время в культивировании плюрипотентных стволовых клеток, является то, что эти клетки обычно образуют тесные колонии, и, следовательно, с ними трудно манипулировать для пассирования и т.п. Недифференцированные ES/EG-клетки обычно обнаруживаются в состоянии, в котором эти клетки прочно скреплены друг с другом, образуя колонии, т.е. клеточные массы с неразличимыми границами между клетками. Для обеспечения ES/EG-клеток для пассирования или экспериментов по индуцированию дифференцировки необходимо, следовательно, диспергирование этих колоний в течение, по возможности, кратчайшего периода времени обработкой растворами протеазы, такой как трипсин или т.п. Однако после выполнения этого диспергирование колоний ES/EG-клеток на индивидуальные клетки требует обработки относительно высокой концентрацией протеаз и/или интенсивного механического перемешивания, и такие процедуры существенно уменьшают жизнеспособность и способность к адгезии этих ES/EG-клеток.

Кроме того, поскольку ES/EG-клетки подвергаются спонтанной дифференцировке во время непрерывного культивирования в кластерном состоянии, они должны быть диспергированы в отдельные клетки во время пассирования, и пассирование должно выполняться до того, как колонии вырастут до чрезмерного размера. Например, мышиные ES-клетки обычно требуют проведения каждого пассирования в течение 2-3 дней, и если пассирование не проводят подходящим способом, клетки, которые отклонились от их недифференцированного состояния, могут появляться в виде кластера, что делает эти клетки непригодными для использования. Это не может быть преодолено просто добавлением достаточного количества фактора, который поддерживает недифференцированное состояние ES/EG-клеток, такого как вышеупомянутый LIF или ингибиторы GSK-3, и индуцируется избыточный рост колоний и клеток с дифференцированным фенотипом. Таким образом, ожидается, что способ выращивания ES/EG-клеток без образования колоний, т.е. с индивидуальными диспергированными клетками, должен быть крайне полезным для обеспечения ES/EG-клеток для промышленного применения. Однако таких попыток или успехов до настоящего времени не было.

Авторы данного изобретения предварительно высевали клетки F9, линию клеток эмбриональной карциномы, которая, как известно, нормально пролиферирует посредством образования колоний, на культуральную чашку, покрытую Е-кадгерином (Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002 (Непатентный документ 6)), и обнаружили, что это предотвращает образование колоний клеток (International Symposium on Biomaterials and Drug Delivery Systems, 2002.04.14-16, Taipei, Taiwan; 1^st Meeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine, 2002.4.18-19, Kyoto, Japan). Конкретно, клетки F9 проявляли морфологию диспергированных клеток на культуральной чашке, имеющей Е-кадгерин (эпителиальный кадгерин, интегральный мембранный белок), который является известной молекулой адгезии для клеток F9, иммобилизованный на необработанной полистироловой культуральной чашке (далее называемой здесь «Е-cad-чашкой».

Клетки F9 проявляют фенотип, несколько сходный с ES-клетками, экспрессируя щелочную фосфатазу (далее называемую здесь ALP) или SSEA-1 и Oct-3/4, которые известны в качестве специфических маркеров ES/EG-клеток (Lehtonen et al., Int. J. Dev. Biol. 33:105, 1989, Alonso et al., Int. J. Dev. Biol. 35:389, 1991). Однако клетки F9 не требуют клеток-фидеров или LIF для поддержания недифференцированного состояния этих клеток и, следовательно, являются отличающимися по механизму поддержания их недифференцированного состояния. Кроме того, в то время как ES-клетки имеют триплобластный (тройной) потенциал дифференцировки во все три зародышевых листка, дифференцировка клеток F9 ограничивается эндодермальными клетками, и они не способны образовывать химеры. Другими словами, хотя клетки F9 используют в качестве модельной системы ES/EG-клеток в некоторых экспериментах, они отличаются от ES/EG-клеток во многих аспектах, в том числе по способу культивирования и условиям культивирования.

Таким образом, невозможно предсказать, на основе научных данных, может ли вышеупомянутая Е-cad-чашка использоваться в способах культивирования ES-клеток, которые не требуют клеток-фидеров, могут ли ES-клетки, культивируемые такими способами, пассироваться при сохранении их недифференцированного состояния и плюрипотентности и может ли быть увеличена эффективность пролиферации этих ES-клеток. Действительно, эффективность пролиферации клеток F9, культивируемых на Е-cad-чашке, является приблизительно эквивалентной эффективности пролиферации клеток F9, культивируемых на чашке для культивирования обычных клеток, и не получены данные, которые предполагали бы, что посредством этого может быть увеличена эффективность пролиферации ES-клеток.

Известно, что Е-кадгерин экспрессируется недифференцированными мышиными ES-клетками, и также хорошо известно, что межклеточная адгезия заметно ингибируется ES-клетками, которые лишены экспрессии гена Е-кадгерина вследствие модификации гена (Larue et al., Development 122:3185, 1996). Однако еще не предпринимались попытки использования Е-кадгерина в качестве субстрата адгезии в способе культивирования ES/EG-клеток.

Кроме эффективных способов культивирования, описанных выше, при предполагаемом использовании плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, в качестве лабораторного материала или для производства продуктов регенеративной медицины, необходима также разработка способов эффективного введения выбранных экзогенных генов в эти клетки и их экспрессии. В частности, одной стратегией для применения ES-клеток в регенеративной медицине для лечения различных заболеваний является модификация свойств этих клеток, таких как эффективность пролиферации и дифференцировки или чувствительность к лекарственным средствам, и это может быть удовлетворительно реализовано введением и экспрессией подходящих экзогенных генов в этих клетках. Для мышиных ES-клеток общеизвестно, что гены могут быть искусственно модифицированы с получением трансгенных мышей или мышей с нокаутом, для чего особенно полезными являются эффективные способы переноса гена.

Обычный перенос экзогенных генов в клетки часто выполняют с использованием таких агентов, как фосфат кальция, DEAE-декстран и препараты катионных липидов. Однако известно, что приложение таких способов к ES-клеткам приводит к более низкой эффективности, чем эффективность в случае других типов клеток (Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004 (Непатентный документ 8)). Сообщалось также о способах с использованием различных вирусных векторов для переноса экзогенных генов. Например, общеизвестными являются ретровирусные векторы (Cherry et al., Mol. Cell Biol., 20:7419, 2000), аденовирусные векторы (Smith-Arica et al., Cloning Stem Cells 5:51, 2003), лентивирусные векторы (Amaguchi et al., J. Virol. 74:10778, 2000; Asano et al., Mol. Ther. 6:162, 2002; Международная публикация патента № WO02/101057) и векторы вируса Сендай (Sasaki et al., Gene Ther. 12:203, 2005; Japanese Unexamined Patent Publication No. 2004-344001). Тем не менее, конструирование и получение вирусных векторов являются относительно сложными и требуют затрат времени, в то время как биологическая безопасность также является проблемой, в зависимости от вируса, и, следовательно, такие способы не являются удобными или универсально применимыми.

Таким образом, перенос экзогенного гена в ES-клетки наиболее часто осуществляли способом, известным как электропорация. Этот способ включает применение электрического импульса к клеткам для временного открывания пор в клеточных мембранах для введения экзогенного гена в клетки, и этот способ является чрезвычайно гибким способом. Недавно был создан усовершенствованный способ, названный нуклеофекцией, посредством которого экзогенный ген переносят непосредственно в клеточное ядро для достижения значимо более высокой эффективности экспрессии (Lorenz et al., Biotech. Lett. 26:1589, 2004; Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004 (Непатентный документ 8)). Однако этот способ требует специального генерирующего импульсы устройства, и получение оптимальных условий не является легким. Кроме того, необходимо сначала обработать эти клетки протеазой, такой как трипсин, для диспергирования индивидуальных клеток, и, следовательно, токсичность клеток является относительно высокой.

Таким образом, наиболее применимыми способами переноса гена для плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, могли бы быть способы использования агентов переноса гена, которые являются недорогими и удобными для получения и могли бы сделать возможным эффективный перенос экзогенных генов в клетки, культивируемые в термостате.

Непатентный документ 1: Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994).

Непатентный документ 2: Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002).

Непатентный документ 3: Xu et al., Nature Biotech. 19:971, 2001.

Непатентный документ 4: Amit et al., Biol. Reprod. 70:837, 2004.

Непатентный документ 5: Sato et al., Nature Med. 10:55, 2004.

Непатентный документ 6: Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002.

Непатентный документ 7: Nagaoka et al., Protein Eng. 16:243, 2003.

Непатентный документ 8: Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004.

Патентный документ 1: Международная публикация патента № WO01/51616.

Патентный документ 2: Международная публикация патента № WO03/020920.

Описание изобретения

В свете этих обстоятельств, задачей данного изобретения является обеспечение способа культивирования плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, без применения клеток-фидеров, при котором увеличивается эффективность пролиферации и увеличивается эффективность переноса гена.

Для решения описанных выше проблем авторы данного изобретения исследовали возможности увеличения эффективности пролиферации и увеличения эффективности переноса гена для ES-клеток культивированием клеток в состоянии без образования колоний или, другими словами, в диспергированном состоянии.

Как упоминалось выше, авторам данного изобретения удалось культивировать клетки F9, линию клеток эмбриональной карциномы, без образования колоний, т.е. в диспергированном состоянии. При приготовлении чашки для культивирования клеток, которая имела Е-кадгерин, иммобилизованный или нанесенный в виде покрытия на твердофазной поверхности, (Е-cad-чашки), и посеве клеток F9 на этой Е-cad-чашке, клетки F9 проявляли морфологию диспергированных клеток без образования колоний. Эффективность пролиферации была по существу одинаковой для клеток F9, культивированных на Е-cad-чашке, и клеток F9, культивированных на обычной чашке.

При попытке посева ES-клеток на Е-cad-чашке фактически все клетки прикреплялись к этой чашке, и они проявляли морфологию диспергированных клеток без образования клеток, сходную с морфологией клеток F9. Наиболее примечательно, что эффективность пролиферации ES-клеток, посеянных на Е-cad-чашке, при этих условиях культивирования была значимо более высокой, чем эффективность пролиферации ES-клеток, культивируемых на обычной чашке. Эффективность переноса экзогенных генов и уровень экспрессии также были значимо более высокими.

Дополнительно было подтверждено, что ES-клетки, пассированные много раз на Е-cad-чашке, являются все еще недифференцированными и сохраняют их плюрипотентность при добавлении к этой жидкой среде фактора, который поддерживает недифференцированное состояние. Кроме того, было продемонстрировано, что ES-клетки, полученные с использованием вышеописанного способа, могут быть индуцированы к дифференцировке в функциональные дифференцированные клетки, такие как нейроны и кардиомиоциты, с использованием известных способов и что могут быть генерированы химерные мыши трансплантацией этих клеток в ранние мышиные эмбрионы, на чем данное изобретение было завершено.

Таким образом, в соответствии с первым вариантом осуществления данного изобретения обеспечен новый способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, который не требует клеток-фидеров. Способ согласно изобретению характеризуется тем, что используемый для культивирования сосуд имеет молекулу, прикрепляющую плюрипотентную стволовую клетку, иммобилизованную или нанесенную на субстратную твердофазную поверхность при заданной заранее плотности, посредством чего эти клетки могут культивироваться в диспергированном состоянии для увеличения способности пролиферации. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные таким образом, сохраняют недифференцированное состояние и плюрипотентность.

В соответствии со вторым вариантом осуществления способ согласно изобретению характеризуется тем, что используемый для культивирования сосуд имеет молекулу, прикрепляющую плюрипотентную стволовую клетку, иммобилизованную или нанесенную на субстратную твердофазную поверхность при заданной заранее плотности, посредством чего культивирование этих клеток в диспергированном состоянии может увеличивать эффективность переноса гена в эти клетки.

В качестве другого варианта осуществления данное изобретение обеспечивает плюрипотентные стволовые клетки, имеющие недифференцированное состояние и плюрипотентность, которые получены способом, описанным в данном изобретении. Для целей данного описания, “недифференцированное” состояние плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждено экспрессией по меньшей мере одного маркера отсутствия дифференцировки.

В соответствии с другим вариантом осуществления данное изобретение обеспечивает дифференцированные клетки, полученные посредством подходящей обработки, индуцирующей дифференцировку, из плюрипотентных стволовых клеток, полученных способом, описанным в данном изобретении. Дифференцированные клетки особо не ограничиваются, пока они являются типом клеток, дифференцировка которых может быть обычно индуцирована из плюрипотентных стволовых клеток. Конкретно, могут быть упомянуты эктодермальные клетки или произведенные из эктодермы клетки, мезодермальные клетки или произведенные из мезодермы клетки, эндодермальные клетки или произведенные из эндодермы клетки, и т.п.

Согласно другому варианту осуществления данное изобретение относится к способу генерирования химерного эмбриона или химерного животного с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных способом, описанным в данном изобретении, и к генерированному химерному эмбриону или химерному животному.

Прежде всего данное изобретение относится к следующим аспектам.

(1) Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся выращиванием плюрипотентных стволовых клеток в диспергированном состоянии при сохранении их недифференцированного состояния и плюрипотентности, с использованием жидкой среды и сосуда для культивирования, имеющего иммобилизованную или нанесенную на твердофазную поверхность субстрата молекулу, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, без использования клеток-фидеров.

(2) Способ переноса гена для плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся эффективным переносом гена в плюрипотентные стволовые клетки и экспрессии его, с использованием жидкой среды и сосуда для культивирования, имеющего иммобилизованную или нанесенную на твердофазную поверхность субстрата молекулу, которая является адгезивной в отношении плюрипотентных стволовых клеток.

(3) Способ по (1) или (2) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, является либо молекулой, которая экспрессируется этими плюрипотентными стволовыми клетками, либо молекулой, которая является структурно гомологичной с этой молекулой и имеет гомофильную связывающую способность с плюрипотентными стволовыми клетками.

(4) Способ по (3) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, является молекулой, принадлежащей к семейству кадгеринов.

(5) Способ по (4) выше, где молекулой, принадлежащей к семейству кадгеринов, является Е-кадгерин или молекула, которая имеет структурную гомологию с этой молекулой, которая содержит домен ЕС1 и один или несколько доменов из домена ЕС2, домена ЕС3, домена ЕС4 и домена ЕС5 Е-кадгерина и которая имеет гомофильную связывающую способность с плюрипотентными стволовыми клетками.

(6) Способ по (5) выше, где Е-кадгерин получен из млекопитающего.

(7) Способ по (6) выше, где Е-кадгерин получен из человека или мыши.

(8) Способ по любому из (1)-(7) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении плюрипотентных стволовых клеток, слита с Fc-районом иммуноглобулина и иммобилизована на твердофазной поверхности субстрата посредством этого Fc-района.

(9) Способ по любому из (1)-(8) выше, где эти плюрипотентные стволовые клетки являются эмбриональными стволовыми клетками (ES-клетками) или эмбриональными половыми клетками (EG-клетками) млекопитающего.

(10) Плюрипотентные стволовые клетки, полученные способом по любому из (1)-(9) выше.

Краткое описание графического материала

Фиг.1 является парой диаграмм, показывающих адгезию ES-клеток (линий клеток R1 и ЕВ3) c E-сad-Fc, нанесенным на полистироловую чашку. Степень адгезии представляет относительную величину, в которой за 100% принято количество ES-клеток, прилипших к чашке, покрытой желатином (0,1%). БСА: группа с ES-клетками, прилипшими к чашке, покрытой 0,1% бычьим сывороточным альбумином. *: относительно группы с желатином,

р<0,01.

Фиг.2 является рядом фотографий, показывающих морфологию ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. Эти изображения клеток получали спустя два дня после посева ES-клеток на чашку, покрытую желатином, коллагеном типа I, фибронектином или E-cad-Fc.

Фиг.3А является диаграммой, показывающей эффективность пролиферации ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и количества клеток сравнивали на третий день. *: относительно группы Контроль, р<0,01.

Фиг.3В является диаграммой, показывающей поглощение BrdU ES-клетками, посеянными на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и метили BrdU. BrdU, проникший в эти клетки, детектировали спустя три дня окрашиванием при помощи антитела с использованием флуоресцентного красителя. *: относительно группы Контроль, р<0,01.

Фиг.4А является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркера для недифференцированного состояния ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и активность ALP детектировали на 14-ый день культивирования. На этой фигуре, LIF(+) и (-), соответственно, указывают добавление/отсутствие добавления LIF к культуральной среде.

Фиг.4В является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркеров для недифференцированных ES-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и белок Oct-3/4 детектировали на 14-ый день культивирования. DAPI: ядерное окрашивание с использованием DAPI. Наложенные: Наложение DAPI и красителя антитела Oct-3/4.

Фиг.5 является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркеров для недифференцированных ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и экспрессии гена Oct-3/4 и гена Rex-1 исследовали при помощи ОТ-ПЦР на 14-ый день. Символы + и - на этой фигуре, соответственно, представляют добавление и отсутствие добавления LIF к культуральной среде.

Фиг.6 является диаграммой, показывающей LIF-реактивность ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию R1) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и культивировали при различных концентрациях LIF для образования колоний и активность ALP детектировали для измерения доли «недифференцированных» колоний. *: относительно Cont/LIF 1000 Е/мл, р<0,05.

Фиг.7 является рядом фотографий, показывающих плюрипотентность ЕS-клеток, пассированных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию R1), посеянные и пассированные на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc, регенерировались и ЕВ образовывался в бессывороточной среде для индукции дифференцировки. Пробы, извлеченные в день 16 после образования ЕВ («ЕВ» на этой фигуре), использовали для исследования экспрессии генов различных маркеров дифференцировки при помощи ОТ-ПЦР. В качестве контрольных групп использовали ES-клетки перед вышеупомянутым пассированием и 16-дневные ЕВ, образованные с использованием этих клеток (1-ая и 2-ая слева на этой фигуре, соответственно). T/Bra: T/Brachyury, βH1: гемоглобин, AFP: α-фетопротеин, TTR: транстиретин, GDPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Фиг.8 является парой фотографий, показывающих плюрипотентность ES-клеток, пассированных на E-cad-Fc-чашке. ES-к