Аутоактивирующийся белок устойчивости

Аутоактивирующийся белок устойчивости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует аутоактивирующийся белок устойчивости для достижения устойчивости к патогенам у растений, к применению нуклеиновой кислоты для получения трансгенного растения, а также к трансгенным растениям.

Грибы, вирусы, нематоды и бактерии, вызывающие известные заболевания растений, являются причиной большой потери урожая по всему миру, причиняют ущерб качеству продуктов урожая и делают необходимым дорогостоящее применение химических средств защиты для растений, поскольку естественные защитные средства растений, которые защищают их от большого количества потенциальных возбудителей заболеваний или могут замедлять их распространение, часто недостаточны. К таким защитным средствам относятся реакция гиперчувтвительности, которая контролирует гибель клеток тканей хозяина в очаге инфекции, усиление растительной клеточной стенки с помощью лигнификации и образования каллуса, образование фитоалексинов и продукцию СП-(связанных с патогенезом)-белков. Ключевыми молекулами для активации индуцируемых средств защиты являются гены устойчивости (резистентности) растений (R-гены). В соответствии с гипотезой "ген-на-ген" Флора (Flor), белок R-гена взаимодействует с соответствующим белком микробного гена авирулентности (Avr-ген) и таким образом происходит индуцируемая защитная реакция.

Большее число R-генов может в зависимости от структуры кодируемого ими Р-белка быть разделено на 5 классов (Martin et al., 2003). Класс 1 содержит только Pto-ген томата, который кодирует серин/треониновую киназу. Основное число R-генов растений принадлежит к суперсемейству NBS-LRR-генов, которые кодируют "нуклеотид-связывающий сайт" (NBS - nucleotide-binding site) и "лейцин-богатый повтор" (LRR - leucine rich repeat). NBS-LRR-гены, содержащие на своем N-конце структуру "биспирали" (coiled-coil) (CC), как, например, "лейциновая молния", будут принадлежать к CC-NBS-LRR-генам класса 2. R-гены CC-NBS-LRR-типа были найдены у всех покрытосеменных. К классу 3 относят R-гены TIR-NBS-LRR-типа, которые несут на N-конце последовательность, имеющую гомологию с TIR-участком ("toll-interleukin-1-receptor - toll-интерлейкин-1-рецептор") животных вместо СС-домена. TIR-NBS-LRR-гены составляют до 75% от всех R-генов у Arabidopsis thaliana, но не обнаружены у злаковых и сахарной свеклы (Tian et al., 2004).

4 класс R-генов составляют Cf-гены томатов. У CF-белков нет NBS-доменов, но они несут трансмембранный домен (ТМ) и внеклеточный лейцин-богатый повтор (LRR). К 5 классу относятся Ха21-белок риса, состоящий из внеклеточного LRR-домена, трансмембранного домена и внутриклеточного киназного домена.

Хотя R-гены слабо экспрессируются под промоторами R-генов, сильная конститутивная экспрессия R-генов 1, 2 и 3 классов приводит к активации защиты от патогенов самих растений в отсутствии соответствующих продуктов генов авирулентности и, таким образом, к аутоактивации Р-белков (Tang et al., 1999; Oldroyd and Staskawicz, 1998; Bendahmane et al., 2002).

Обычно конститутивная сверхэкспрессия R-генов в трансгенных растениях связана с нежелательными с точки зрения агрономии свойствами, такими как микронекрозы (Tang et al., 1999) или низкорослость растений (Frost et al., 2004).

Еще одной возможностью для обеспечения аутоактивации Р-белков классов 2 и 3 является мутагенез в специальных консервативных аминокислотных мотивах в полноразмерных CC-NBS-LRR или TIR-NBS-LRR белках. Мутагенез последовательности в NBS- или LRR-домене Rx-гена картофеля (Bendahmane et al., 2002) и NBS-домена LRR-гена льна (Howles et al., 2005) приводит к образованию мутантов, у которых в отсутствии соответствующих генов авирулентности после транзитной экспрессии запускается гибель клеток.

Эксперименты с делениями у Rx-гена показали, что продукты делеции, состоящие из СС-домена и частей NBS-домена, после их транзитной сверхэкспрессии также могут вызвать клеточную гибель, которая наступает быстрее, чем при применении полноразмерных R-генов. Эти продукты делеции помимо СС-домена нуждаются еще в Р-петле, киназе-2 и полноразмерной киназе-3 NBS-домена. В противном случае дальнейшее укорочение NBS-домена приведет к более медленному по сравнению с полноразмерным R-геном включению реакции гиперчувствительности (Bendahname et al., 2002).

Аутоактивация гена L10, одного из R-генов, принадлежащих к классу 3, может быть достигнута с помощью получения укороченного TIR-NBS-LRR-белка, состоящего из TIR-домена и 34 аминокислот смежного NBS-домена, включающего Р-петлю (Frost et al., 2004).

Хотя известно множество способов аутоактивации R-генов, до настоящего времени не было описано никаких трансгенных растений, у которых аутоактивация R-белков приводила бы к повышенной противогрибковой устойчивости без одновременного нанесения ущерба агрономическим свойствам. Попытка стабильно трансформировать два аутоактивируемых полноразмерных варианта L6-генов под контролем нативных L6-промоторов устойчивости или промоторов, индуцируемых грибами у льна, каждый раз приводила к появлению растений с нормальным ростом, восприимчивых к грибковой инфекции, либо к появлению низкорослых растений, устойчивых к грибковой инфекции (Howles et al., 2005).

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы изменить защитную функцию растения против патогенов таким образом, чтобы защитная реакция растения при атаке патогенов надежно активировалась бы без негативного влияния на агрономические свойства растения.

В соответствии с изобретением поставленная задача решается с помощью нуклеиновой кислоты, включающей ограниченный участок NBS-LRR-гена устойчивости, который простирается от 5'-конца кодирующей области NBS-LRR-гена устойчивости в направлении 5'-3' до начала NBS-домена, причем NBS-LRR-ген устойчивости не является TIR-NBS-LRR-геном устойчивости. Такая нуклеиновая кислота может быть выделена из растения или получена синтетически.

Ограниченная область NBS-LRR-гена устойчивости, начиная со старт-кодона для трансляции (ATG-кодон) и до NBS-домена, известна как базовая благодаря Р-петле (мотив киназы-1a). Для того чтобы область NBS-LRR-гена устойчивости по изобретению могла функционировать, она не должна включать Р-петлю. Также не должны присутствовать и другие отрезки NBS- и LRR-доменов NBS-LRR-гена устойчивости. Однако отдельные нуклеотиды NBS-домена, включающего нуклеотиды Р-петли, могут быть оставлены, если они не будут отрицательно влиять на проявление реакции гиперчувствительности.

Под аутоактивирующимся белком устойчивости будет пониматься такой белок, который в отсутствии соответствующего продукта гена авирулентности будет приводить к активированию защиты от патогенов у растения. В этом отношении изобретение обладает тем преимуществом, что при возникновении устойчивости против патогенов не требуется никакого взаимодействия между белком устойчивости и белком авирулентности, благодаря чему защитная реакция растения является более направленной и в конечном итоге может протекать безопаснее.

Аутоактивация может быть вызвана, например, с помощью транзитной сверхэкспрессии гена устойчивости. Сверхэкспрессия означает, что сила экспрессии нативного промотора гена устойчивости будет настолько повышена, что каскад передачи сигнала, регулируемый R-белком, будет активирован при отсутствии соответствующего микробного продукта гена авирулентности. Это приведет к активации защиты от патогенов, которая приведет в результате к частичной или полной устойчивости к болезни.

Аутоактивация белков устойчивости может быть достигнута также с помощью укорочения полноразмерных R-генов BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bv13033 и Bv12069 сахарной свеклы, а также StR3a гена картофеля в 5'-области, при котором в N-конце белка, лишенном NBS- и LRR- доменов, кодируется в конечном итоге случайный СС-домен. N-конец, лишенный NBS-домена, означает в данном контексте, что 5'-конец кодирующей области NBS-LRR-гена устойчивости распространяется настолько далеко к 3'-концу, что функциональная структура Р-петли NBS-LRR-гена устойчивости не включается в состав гена. В простых случаях Р-петля отсутствует полностью. Однако в укороченном гене устойчивости могут также присутствовать отдельные нуклеотиды Р-петли, если из-за них проявление реакции гиперчувствительности не будет замедлено. При укорочении NBS-LRR-гена устойчивости с N-конца будут также удалены последовательности киназы-2, киназы-3, GLPC и MHD, включая фланкирующие аминокислоты в соответствии с информацией банков данных "Просайт" (Prosite) (Bairoch et al., 1996) и "Пфам" (Pfam) (Sonnhammer et al., 1997), а также в соответствии с определением мотивов согласно Бендамане и др. (Bendahmane et al., 2002).

Применение укороченных R-генов 165_#176, 135_#147, 13033_#159 и Bv12069 и StR3a-#1-155 приводит, в сравнении с полноразмерными R-генами, к более быстрому запуску клеточной гибели в тканях растения. В комбинации с патоген-индуцируемым промотором это приводит к улучшенной индуцированной защите от патогенов. Это действует также для таких R-белков, которые не могут быть аутоактивированы из-за известных мутаций в MHD- или VHD-домене, проявляющихся в экспрессии гена 135_#147 BvKWS3 и 135-D480V.

Поскольку укороченные R-гены в состоянии вызвать клеточную гибель существенно раньше по сравнению с полноразмерными R-генами, для укороченных R-генов достаточно наличия слабой экспрессии для достижения концентрации белка, критической для защиты от патогенов, как было показано для R-гена 135_#147.

Р-петля или мотив киназы-1a совместно с мотивами киназы-2 и киназы-3 являются характерными для АТФ- или ГТФ-гидролизующих белков (Traut, 1994) и обнаружены в NBS-доменах NBS-LRR-генов. Р-петля характеризует N-концевую область NBS-домена (Bendahmane et al., 2002). Консенсусной последовательностью Р-петли для R-генов Prf, Rx, Rpm1, BvKWS3_135, BvKWS3_133 и BvKWS3_165 является (I/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V).

Неожиданно было обнаружено, что особенно хорошей активностью обладают нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, включающую мотив DAE, и в особенности нуклеиновые кислоты, кодирующие мотив последовательности AVLXDAE. Мотивы последовательности DAE и AVLXDAE представлены, например. в SEQ ID NOS: 13 и 15.

Предпочтительными последовательностями нуклеиновых кислот являются выбранные из следующей группы:

а) нуклеотидная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1, или нуклеотидная последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1, или нуклеотидная последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 1 или с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1;

б) нуклеотидная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, или нуклеотидная последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, или нуклеотидная последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 2 или с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2;

в) нуклеотидная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3, или нуклеотидная последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 3, или нуклеотидная последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 3 или с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 3;

г) нуклеотидная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 4, или нуклеотидная последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4, или нуклеотидная последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 4 или с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4;

д) нуклеотидная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 16, или нуклеотидная последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 16, или нуклеотидная последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 16 или с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 16.

Ограниченный участок NBS-LRR-гена устойчивости находится в предпочтительных нуклеотидных последовательностях, указанных ниже:

SEQ ID NO: 1 c 124 по 654

SEQ ID NO: 2 с 155 по 598

SEQ ID NO: 3 с 94 по 573

SEQ ID NO: 4 c 194 по 694

Применяемый здесь термин "гибридизировать" обозначает гибридизацию в общепринятых условиях, в таких как описанные у Сембрук и др. (Sambrook et al., 1989), предпочтительно в строгих условиях. Строгими условиями гибридизации является, например, гибридизация в 4-кратном растворе хлорида и цитрата натрия (SSC) при 65°C с последующим многократным отмыванием в 0,1-кратном SSC при 65°C в течение примерно 1 часа. Менее строгими условиями гибридизации является, например, гибридизация в 4-кратном SSC при 37°C с последующим многократным отмыванием в 0,1-кратном SSC при комнатной температуре. "Строгие условия гибридизации" могут также означать гибридизацию при 68°C в 0,25 М фосфате натрия, рН 7,2, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ этилендиаминуксусной кислоте (ЭДТА) и 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в течение 16 часов с последующим двукратным отмыванием в 2-кратном SSC и 0,2% SDS при 68°C.

Предпочтительно ген устойчивости, кодирующий аутоактивирующийся белок устойчивости, происходит из сахарной свеклы или картофеля.

Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота по изобретению кодировала аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 13 по 15. Внутри консенсусных последовательностей функциональные равнозначные аминокислоты могут быть взаимозаменяемы, например Asp вместо Glu, Leu вместо Ile, Ala или Val, Arg вместо Lys, Phe вместо Trp.

Обе консенсусные последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 13 и 14 представляют собой два функциональных блока, которые могут располагаться относительно друг друга на не очень жестко установленном расстоянии. Предпочтительно промежуток между обоими блоками представляет собой консенсусную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 15, а также консенсусную последовательность в соответствии с фиг.10.

Нуклеиновую кислоту по изобретению предпочтительно комбинировать с промотором, индуцируемым патогенами. Индуцируемый патогенами промотор активируется в ответ на инфекцию тканей хозяина возбудителем болезни, например повреждающим грибом, бактерией, вирусом или нематодами. Индуцируемый патогенами промотор более активен в растительных тканях во время проникновения в них инфекции или в успешно инфицированных тканях, чем в неинфицированных растительных тканях.

Промоторы, индуцируемые патогенами, в основном известны специалистам. Примеры промоторов, индуцируемых патогенами, включают хитиназный промотор (Samac and Shah, 1991), глюканазный промотор (Hennig et al., 1993) и prp-1 промотор (Martini et al., 1993).

С помощью индуцированной патогенами сверхэкспрессии R-гена можно предотвратить негативные последствия конститутивной экспрессии, такие как, например, низкорослость или дефицит растений.

Особенно подходящими показали себя синтетические промоторы. В данном изобретении описаны промоторы, полученные с помощью молекулярно-биологических методов, которые в таком виде не были найдены в природе. Синтетический промотор представляет собой минимальный промотор, который помимо минимального промотора содержит только один или более определенным образом подобранный цис-элемент. Эти цис-элементы представляют собой сайты связывания ДНК-связывающих белков, таких как транскрипционные факторы, и они выделены из природных промоторов, отобраны из готовых выделенных цис-элементов или получены искусственно при помощи способа случайной рекомбинации и отобраны при помощи подходящего способа. По сравнению с природным промотором синтетический промотор ввиду своего менее сложного строения активируется только с помощью небольшого количества экзогенных и эндогенных факторов, поэтому регулируется более специфически.

Минимальный промотор или "коровый" промотор представляет собой последовательность нуклеотидов, содержащую сайты связывания основных комплексов транскрипционных факторов и обеспечивающую точную инициацию транскрипции с помощью РНК-полимеразы II. Характерный мотив последовательности минимального промотора представляет собой ТАТА-бокс, инициаторный элемент (Inr), "элемент, распознающий TFBII" (BRE - ТАТА binding factor II recognition element) и "нижележащий элемент корового промотора" (DPE - downstream core promoter element). Эти элементы могут встречаться в минимальном промоторе вместе или по отдельности. В продаже имеются минимальные промоторы или мотивы их последовательности, выделенные из любого растительного или вирусного гена.

В объеме настоящего изобретения разработаны новые синтетические промоторы, которые в комбинации с известными генами устойчивости, не обязательно кодирующими аутоактивирующиеся белки устойчивости, можно применять для получения растений, устойчивых к патогенам. В данном изобретении описаны промоторы типа n×S-m×D-минимальных промоторов, n×W2-m×D-минимальных промоторов и n×Gst1-m×D-минимальных промоторов, таким образом, синтетический промотор содержит в себе одну или более чем одну следующую комбинацию цис-элементов:

а) n×S-m×D-бокс;

б) n×W2-m×D-бокс;

в) n×Gst1-m×D-бокс,

где n и m представляют собой натуральное число от 1 до 10

S-бокс (CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT), имеющий последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 6, W2-бокс (TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT), имеющий последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 7,

D-бокс (TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC),

имеющий последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 8 и Gst-бокс (TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC), имеющий последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 9, описаны Раштоном в 2002 (Rushton et al., 2002), включая функции важных ядерных последовательностей.

Промоторы различаются в зависимости от набора элементов (n×S-m×D, n×W2-m×D или n×Gst1-m×D) по их базовой активности, способности быть индуцированными патогенами, кинетике активации и силе промотора, как, например, было показано для промоторов с комбинациями цис-элементов 2×S-2×D с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 10, 2×W2-2×D с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11 и 2×Gst1-2×D с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12. Свойства синтетического промотора дают возможность модифицировать генную экспрессию путем изменения числа цис-элементов (n, m=1…10) в соответствии с конкретными требованиями. Сравнение промоторов 2×S-2×D с вариантами 2×S-4×D, 4×S-2×D и 4×S-4×D показало, что в среднем сила промотора при применении тетрамеров повышается по сравнению с промоторами, состоящими из димеров. Кроме того, способность к индуцированию патогенами возрастает от димер-димерного промотора (2×S-2×D) к тетрамер-димерному и димер-тетрамерному промоторам (4×S-2×D, 2×S-4×D) и тетрамер-тетрамерному промотору (4×S-4×D) во всех временных точках измерения. Одновременно с возрастанием силы промотора и способности к индуцированию патогенами в случае описанных примеров тетрамерсодержащих промоторов обнаруживается усиление базовой активности. Эти примеры показывают, что важные свойства промоторов регулируются количеством цис-элементов и оптимальные варианты промоторов могут быть получены и идентифицированы для соответствующих искусственных реаранжировок.

Соответствующие результаты могут быть также получены с комбинациями цис-элементов, представляющими собой производные нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 и обладающими свойствами, сравнимыми со свойствами комбинаций цис-элементов SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.

Промоторы 2×S-2×D-минимальный промотор и 2×W2-2×D-минимальный промотор являются, например, комбинированными соответственно с четырьмя полноразмерными R-генами BvKWS3_133, BvKWS3_123, BvKWS3_135 и BvKWS3_165, и ими может быть трансформирована сахарная свекла. Испытание на устойчивость к грибам трансгенных растений с участием важнейшего гриба-паразита сахарной свеклы Cercospora beticola, возбудителя пятнистости листьев, в случае каждой из конструкций приводило к улучшению устойчивости к грибам, и при этом трансгенные растения не отличались от нетрансгенных растений по росту или другим агрономическим свойствам. Этот результат показывает, что при применении промотора, способного индуцироваться патогенами, в целом можно достичь сверхэкспрессии R-генов, запускающих клеточную гибель, и, следовательно, улучшенной устойчивости к болезням без негативного влияния на успешное развитие растения. При применении оптимальных промоторов в результате выбора наиболее подходящего количества повторов цис-элементов устойчивость к болезням дополнительно улучшается.

Настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям, трансформированным новыми конструкциями нуклеиновых кислот, в особенности к растениям сахарной свеклы, частям, таким как семена или посевной материал этих растений, а также применению новых конструкций нуклеиновых кислот для получения трансгенных растений.

Изобретение далее будет пояснено со ссылкой на чертежи и примеры.

Изобретение, описанное в качестве примера с сахарной свеклой, также может без проблем быть применено и к другим пищевым растениям, у которых выделены гены устойчивости.

Графические материалы

На Фиг.1 показана карта бинарного вектора pER-35Sluci, применяемого для опосредованной Agrobacterium tumefaciens транзитной экспрессии R-генов в листьях сахарной свеклы. Вектор несет один ген люциферазы с одним интроном Photinus pyralis, который не может экспрессироваться в A. tumefaciens.

На Фиг.2 показан запуск клеточной гибели в листьях сахарной свеклы после транзитной экспрессии R-гена BvKWS3_133 с помощью Agrobacterium tumefaciens. В то время как транзитная экспрессия конструкций pER-35Sluci приводит к усиленной активности генов-репортеров в листьях свеклы, экспрессия конструкций pER133-35Sluci приводит к клеточной гибели таким образом, что невозможно выявить какую-либо активность генов-репортеров.

На Фиг.3 показан вектор pCaMV-2, который применялся для транзитной биолистической трансформации листьев сахарной свеклы. Полноразмерные и укороченные R-гены доставляли под контролем двойного 35S промотора, как было описано выше.

На Фиг.4 показан запуск клеточной гибели в листьях сахарной свеклы после транзитной экспрессии R-генов BvKWS3_123, BvKWS3_133 и BvKWS3_165 посредством биолистической трансформации. Проводили совместную трансформацию генами BvKWS3_123, BvKWS3_133 и BvKWS3_165, находящимися под контролем двойного 35S-промотора (d35S), и конструкцией гена-репортера p70S-luc. Активность гена-репортера измеряли через 20 ч после трансформации. Как видно по запуску реакции гиперчувствительности, активность гена-репортера уменьшена по сравнению с контролем (пустой вектор pCaMV-2 и p70S-luc). Представлено среднее значение 3-х независимых повторяющихся параллелей по меньшей мере с 9 единичными экспериментами на конструкцию. Погрешность обозначена стандартной ошибкой.

На Фиг.5 показано усиление запуска клеточной гибели в результате экспрессии 5'-концевых областей R-гена BvKWS3_165 по сравнению с экспрессией полноразмерного R-гена BvKWS3_165. Проводили биолистическую трансформацию листьев сахарной свеклы N-концевой областью и полноразмерным R-геном под контролем d35S промотора (p70S-165_#175 и p70S-BvKWS3_165) с конструкцией p70S-luc. Представлено среднее значение 3-х независимых повторяющихся параллелей по меньшей мере с 9-12 единичными экспериментами на конструкцию.

На Фиг.6 показано усиление запуска клеточной гибели в результате экспрессии полноразмерного R-гена BvKWS3_135 по сравнению с усилением запуска клеточной гибели с помощью 5'-концевой области 135_#147 R-гена BvKWS3_135. Проводили биолистическую трансформацию листьев сахарной свеклы полноразмерным R-геном и n-концевой областью 135_#147 под контролем d35S промотора (p70S-BvKWS3_135 и p70S-135_#147) с конструкцией p70S-luc. Представлено среднее значение 2-х независимых повторяющихся параллелей по меньшей мере с 9-12 единичными экспериментами на конструкцию.

На Фиг.7 показано усиление запуска клеточной гибели в результате экспрессии 5'-концевых областей 13033_#159 R-гена Bv13033 по сравнению с экспрессией полноразмерного R-гена Bvl3033. Проводили биолистическую трансформацию листьев сахарной свеклы полноразмерным R-геном и N-концевой областью 13033_#159 под контролем d35S промотора (p70S-13033 и p70S-13033_#159) с конструкцией p70S-luc. Представлено среднее значение 2-х независимых повторяющихся параллелей по меньшей мере с 9-12 экспериментами на конструкцию.

На Фиг.8 показано усиление запуска клеточной гибели в результате экспрессии R-гена Bv12069.

На Фиг.9 показана аутоактивация белков BvKWS3_135 в результате укорочения 5'-области клона кДНК 135_#147 по сравнению с мутацией VHD мотива NBS-домена.

На Фиг.10 а)-в) показано сравнение аминокислотных последовательностей укороченных аутоактивных белков Bv12069, Bv13033_#159, BvKWS135_#147, BvKWS3_165_#175 и StR3a-#l-155 между собой со сравнительными последовательностями не обладающих аутоактивностью укороченных белков устойчивости картофеля (RX-160) и StR1(355-540), а также с полноразмерными R-белками NBS-LRR-типа Arabidopsis thaliana (AtAB028617), фасоли (Р.vulgarisJ71), риса (O.sativaАР003073), сои (G.maxKR4) томатов (Tomato-I2). Консенсусные последовательности подчеркнуты.

На Фиг.11 показано, что делеция аминокислот 147-175 достоверно снижает способность белков к аутоактивации.

На Фиг.12 показана активация синтетических промоторов 2×S-2×D в трансгенной сахарной свекле после атаки Cercospora beticola.

На Фиг.13 показана активация синтетических промоторов 2×W2-2×D в трансгенной сахарной свекле после атаки Cercospora beticola.

На Фиг.14 показано сравнение активностей промоторов генов-репортеров 2×S-2×D, 4×S-2×D, 2×S-4×D и 4×S-4×D в трансгенной сахарной свекле после атаки Cercospora beticola.

На Фиг.15 и 16 показаны комбинации полноразмерных R-генов 123, 133, 135, 165 с синтетическим промотором 2×S-2×D.

На Фиг.17 и 18 показаны комбинации полноразмерных R-генов 123, 133, 135, 165 с синтетическим промотором 2×W2-2×D.

На Фиг.19 показано повышение устойчивости трансгенной сахарной свеклы линии PR68-6 против гриба-паразита Cercospora beticola по сравнению с нетрансгенным контролем 3DC4156.

На Фиг.20 показано повышение устойчивости трансгенной сахарной свеклы линии PR70-32 против гриба-паразита Cercospora beticola по сравнению с нетрансгенным контролем 3DC4156.

На Фиг.21 и 22 показана комбинация N-концевых областей R-генов 165_#176 и 12069 с синтетическими промоторами 2×S-2×D и 2×W2-2×D.

Примеры

Доказательство проявления быстрой реакции устойчивости в листьях сахарной свеклы в результате сверхэкспрессии гена BvKWS3_133

Транзитная сверхэкспрессия полноразмерного клона кДНК гена BvKWS3_133 в листьях сахарной свеклы с помощью Agrobacterium tumefaciens вызывает быструю клеточную гибель без видимого формирования некроза. кДНК-клон BvKWS3_133 комбинировали с d35S-промотором и встраивали в бинарный вектор pER-35Sluci (Фиг.1). Векторами pER-35Sluci и pER133-35Sluci трансформировали штамм С58С1 Agrobacterium (An, 1987). Положительные агробактерии помещали для транзитной экспрессии в 50 мл LB-среды с 100 мг/мл стрептомицина и 20 мкМ ацетосирингона на 4-5 ч. После этого бактерии центрифугировали, осадок помещали в раствор 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MES, 100 мкМ ацетосириногена и определяли плотность бактерий при OD₆₀₀=0,1. Бактериальную суспензию оставляли на 2-3 часа и затем с помощью 2,5 мл шприца инъецировали через нижнюю сторону листа 10-недельных растений сахарной свеклы внутрь листа. После инкубации при 25°C в культуральном шкафу измеряли активность гена-репортера люциферазы Photinus pyralis в трансформированных листьях через 1, 2 и 3 дня после прививки. Для этого определили активность люциферазы с помощью системы для люциферазного анализа Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Deutschland) в люминометре Sirius (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Deutschland) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения ферментативного экстракта, подходящего для измерения, для каждого измерения вырезали из листьев по меньшей мере 2 круглых фрагмента. На каждую конструкцию проводили по 8 измерений в течение дня. Образцы листьев гомогенизировали в ступке с добавлением морского песка в 10 кратном объеме (об./мас.) пассивного литического буфера (ПЛБ). Жидкий супернатант переносили в 1,5 мл пробирки типа "Эппендорф" и центрифугировали в течение 5 мин при 4°C и 20000 g. Прозрачный супернатант отбирали и для измерения активности люциферазы Photinus использовали по 10 мкл центрифугированного экстракта. Листья сахарной свеклы, которые трансформировали контрольной конструкцией pER-35Sluci, в первый день показали слабую активность люциферазы, а на 2 и 3 день активность люциферазы составляла 124000 или 116000 относительных световых единиц (ОСЕ)/мг ткани листа. Листья свеклы, трансформированные конструкцией pER133-35Sluci, на всех 3-х временных точках измерения не продемонстрировали активности, которая была бы выше, чем в листьях, привитых MgCl₂ (Фиг.2). При этом транзитная экспрессия клона кДНК BvKWS3_133 проявилась в очень быстрой клеточной гибели в привитых листьях свеклы.

Конститутивная экспрессия R-генов BvKWS3_123, BvKWS3_133 и BvKWS3_165 вызывает клеточную гибель в листьях сахарной свеклы

R-ген BvKWS3_133, также как R-ген BvKWS3_165 с нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 5 и R-ген BvKWS3_123 комбинировали с двойным 35S промотором вектора pCaMV-2 (Фиг.3). Созданные векторы несли метки p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 и p70S-BvKWS3_123. Чтобы проверить функциональность R-генов в листьях сахарной свеклы, осуществили транзитную биолистическую трансформацию по Шмидту и др. (Schmidt et al., 2004), в результате чего осуществили экспрессию конструкции p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 и p70S-BvKWS3_123 с вектором гена-репортера p70S-luc. В качестве положительного контроля использовали пустой вектор pCaMV-2 в комбинации с вектором гена-репортера p70S-luc. От использования нормализированного вектора отказались, в отличие от Шмидта и др. (Schmidt et al., 2004). Люциферазную активность определяли через 20 ч после трансформации с помощью системы для люциферазного анализа Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Deutschland). Эксперименты по трансформации повторяли в 3-х параллелях, и каждый эксперимент включал 9 повторных испытаний на конструкцию. Получив среднее значение для 3-х экспериментов, выяснили, что по сравнению с практически 100% активностью положительного контроля люциферазы (пустого вектора), активность гена-репортера составляет при p70S-BvKWS3_133 только 37,7%, при p70S-BvKWS3_165 только 66% и при p70S-BvKWS3_123 только 68,7% (Фиг.4). Сильная экспрессия R-генов BvKWS3_133, BvKWS3_165 и BvKWS3_123, опосредованная d35S промотором, приводит либо к клеточной гибели, либо к реакции гиперчувствительности в части трансформированных клеток, которой препятствует коэкспрессия векторов генов-репортеров, которые совместно были внесены в клетки. При этом показано, что сильная экспрессия трех R-генов приводит к клеточной гибели или реакции гиперчувствительности в отсутствии соответствующих продуктов гена авирулентности.

5'-Область гена BvKWS3_165 вызывает более быструю клеточную гибель по сравнению с полноразмерным клоном кДНК BvKWS3_165

5'-Область полноразмерного кДНК клона BvKWS3_165 с последовательностью нуклеотидов в соответствии с SEQ ID NO: 5 амплифицировали в конструкции p70S-BvKWS3_165 с помощью Pfu-полимеразы (Stratagene) и использованием праймеров S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) и S318 (CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTACC) и одновременно ввели стоп-кодон в кодируемую область. Амплифицированная область соответствовала последовательности нуклеотидов в соответствии с SEQ ID NO: 1 и кодировала аминокислотную последовательность 1-174 BvKWS3_165 (Фиг.10). Аминокислотная последовательность содержала только N-концевую область BvKWS3_165 и не включала в себя никаких NBS- и LRR-доменов (Фиг.10). Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР-продукт) резали с помощью ферментов рестрикции SacII и BamHI и клонировали в вектор pCaMV-2. Получившийся вектор содержал метку p70S-165_#175. Способность конструкций p70S-BvKWS3_165 и p70S-165_#175 вызывать клеточную гибель в листьях сахарной свеклы количественно тестировали с помощью транзитной биолистической трансформации. Для этого осуществляли котрансформацию каждым из векторов совместно с вектором гена-репортера p70S-luc. В качестве положительного контроля использовали пустой вектор pCaMV-2 в комбинации с вектором гена-репортера p70S-luc. По сравнению с трансформацией пустым вектором (pCaMV-2) трансформация p70S-BvKWS3_165 дает активность, составляющую 65% активности гена-репортера, а трансформация p70S-165_#175 к активности, составляющей только 38% активности гена-репортера (Фиг.5). Этот результат показывает, что экспрессия только N-конца 165_#175 размером 175 аминокислот приводит к более интенсивному запуску клеточной гибели в трансформированных листьях сахарной свеклы, чем использование полноразмерного белка BvKWS3_165, состоящего из 1066 аминокислот. При экспрессии 165_#175 погибают больше клеток трансформированных листьев, чем в случае экспрессии BvKWS3_165. Причиной этого различия является новая, более интенсивная форма аутоактивирования R-белков, полученная в результате укорочения N-конца.

5'-Область гена BvKWS3_135 вызывает более быструю клеточную гибель по сравнению с полноразмерным клоном кДНК BvKWS3_135

5'-Область полноразмерного кДНК клона BvKWS3_135 в конструкции p70S-BvKWS3_135 амплифицировали с помощью Pfu-полимеразы (Stratagene) с использованием праймеров S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) и S330 (CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC) и одновременно ввели стоп-кодон в кодируемую область. Амплифицированная область соответствовала последовательности нуклеотидов в соответствии с SEQ ID NO: 2 и кодировала аминокислотную последовательность 1-174 BvKWS3_135 (Фиг.10). Аминокислотная последовательность содержала только N-концевую область BvKWS3_135 и не включала в себя никаких NBS- и LRR-доменов или мотивов этих доменов. Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР-продукт) разрезали с помощью ферментов рестрикции SacII и BamHI и клонировали в векторе pCaMV-2. Получившийся вектор содержал метку p70S-135_#147. Способность конструкций p70S-BvKWS3_135 и p70S-135_#147 вызывать клеточную гибель в листьях сахарной свеклы количественно тестировали с помощью транзитной биолистической трансформации. Для этого проводили совместную трансформацию каждым вектором с вектором гена репортера p70S-luc. В качестве положительного контроля использовали пустой вектор pCaMV-2 в комбинации с вектором гена-репортера p70S-luc. По сравнению с трансформацией пустым вектором (pCaMV-2) трансформация p70S-BvKWS3_135 приводит к активности, составляющей 74,5% активности гена-репортера, а трансформация p70S-135_#147 - к активности, составляющей только 58,5% активности гена-репортера (Фиг.6). Результаты показывают, что экспрессия полноразмерного клона BvKWS3_135 вызывает запуск клеточной гибели в трансформированных тканях. Однако экспрессия только N-конца 135_#147 размером 147 аминокислот приводит к более интенсивному запуску клеточной гибели в трансформированных листьях сахарной свеклы по сравнению с использованием полноразмерного белка BvKWS3_135, состоящего из 844 аминокислот. При экспрессии 135_#147 погибают больше клеток трансформированных листьев, чем в случае экспрессии BvKWS3_135. Причиной этого различия является новая более интенсивная форма аутоактивации R-белков, полученная в результате укорочения N-конца.

5'-Область гена Bv13033 вызывает более быструю клеточную гибель по сравнению с полноразмерным клоном кДНК Bv13033

5'-Область полноразмерного кДНК клона BvKWS3_135 в конструкции p70S-BvKWS3_135 амплифицировали с помощью Pfu-полимеразы (Stratagene) с использованием праймеров S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) и S333 (CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT) и одновременно ввели стоп-кодон в кодируемую область. Амплифицированная область соответствовала последовательности нуклеотидов в соответствии с SEQ ID NO: 3 и кодировала аминокислотную последовательность 1-159 Bv13033 (Фиг.10). Аминокислотная последовательность содержала только N-концевую область Bv13033 и не включала в себя никаких NBS- и LRR-доменов или мотивов этих доменов. Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР-продукт) разрезали с помощью ферментов рестрикции SacII и BamHI и клонировали в векторе pCaMV-2. Получившийся вектор содержал метку p70S-13033_#159. Способность конструкций p70S-13033 и p70S-13033_#159 вызывать клеточную гибель в листьях сахарной свеклы количественно тестировали с помощью транзитной биолистической трансформации. Для этого проводили совместную трансформацию каждым из векторов с вектором гена репортера p70S-luc. В качестве положительного контроля использовали пустой вектор pCaMV-2. По сравнению с трансформацией пустым вектором (pCaMV-2) трансформация p70S-13033 приводит к активности, составляющей 95% активности гена-репортера, а трансформация p70S-165_#175 - к активности, составляющей только 68% активности гена-репортера (Фиг.7). Эти результаты показывают, что экспрессия полноразмерного клона Bvl3033 приводит только к слабому запуску клеточной гибели в трансформированных тканях. Экспрессия только N-конца 13033_#159 размером 159 аминокислот приводит, напротив, к более интенсивном