Способ оценки риска развития и предрасположенности к развитию патологии, ассоциированной с присутствием аутоантител против epcr

Способ оценки риска развития и предрасположенности к развитию патологии, ассоциированной с присутствием аутоантител против epcr

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения высоких уровней аутоантител против эндотелиального рецептора белка С/активированного белка С (ЕРCR) в образце путем его детекции и количественной оценки in vitro.

Предшествующий уровень техники

Аутоиммунные заболевания

Аутоиммунные заболевания характеризуются иммунными реакциями, в результате которых иногда индуцируются иммунные реакции против тканей хозяина и продуцируются аномальные антитела, атакующие ткани хозяина (аутоантитела). В большинстве случаев аутоиммунные заболевания включают такие нарушения, как антифосфолипидный синдром (APLS), ревматоидный артрит, системная красная волчанка, аутоиммунный васкулит и т.п.

APLS характеризуется сосудистым (венозным, артериальным или микроваскулярным) тромбозом и осложнениями беременности (внутриутробной смертью плода, преждевременными родами или многократными самопроизвольными выкидышами), ассоциированными с присутствием антифосфолипидных антител. Эти антитела являются гетерогенными и распознают различные комбинации фосфолипидов, фосфолипид-связывающих белков, либо те и другие. Наиболее часто детектируемые подгруппы антител против фосфолипидов включают так называемые волчаночные антикоагулянты (антитела с антикоагулирующими свойствами от больных красной волчанкой) (АСL), антитела против кардиолипина и антитела против гликопротеина I β2. В настоящее время исследуются другие антитела против фосфолипидов, которые не включены в классические лабораторные критерии. Такие антитела направлены против фосфолипидов, отличных от кардиолипина, таких как фосфатидилэтаноламин, или против фосфолипид-связывающих белков, таких как аннексин V и белок S. Однако о механизмах, связанных с присутствием антифосфолипидных антител, вызывающих васкулярный тромбоз и выкидыш, известно очень немного.

Сосудистые заболевания

Сосудистые заболевания подразделяются на три главных типа, в зависимости от вида поражаемых сосудов (артериальных, венозных или капиллярных сосудов микроциркуляции). В случае артериальных сосудистых заболеваний пристеночный склероз приводит к снижению потока крови через просвет сосуда, а следовательно, и к постоянному снижению кровоснабжения участков, орошаемых поврежденным кровеносным сосудом. Такое атеросклеротическое поражение сосудов может приводить к серьезным осложнениям и к развитию тромбоза внутри артерии, что, в целом, приводит к ее окклюзии, а значит, и к прекращению кровоснабжения. В этом случае возникает инфаркт тканей. Наиболее характерными примерами такого поражения является инфаркт миокарда, возникающий в результате тромбоза коронарной артерии, или инсульт, если пораженным сосудом является артерия головного мозга. В случае венозного сосудистого заболевания тромбоз приводит к нарушению возврата кровотока в сердце. Если фрагмент тромба отделяется от стенок вен, пораженных тромбозом, то этот тромб будет перемещаться в кровотоке до тех пор, пока он не попадет в легочный венозный круг кровообращения, что приведет к острой легочной недостаточности (ситуация, известная как легочная эмболия). Заболевания, связанные с нарушением капиллярного кровообращения, являются вторичными заболеваниями, возникающими вследствие воспаления и/или тромбоза сосудов капиллярного кровообращения в различных органах и проявляющимися недостаточностью органов, в которых нарушено капиллярное кровообращение. Сосудистые заболевания являются главной причиной высокой заболеваемости и смертности в Западных странах. В частности, по данным Национального института статистических исследований (Instituto Nacional de Estadistica) (INE)(Испанский Национальный институт статистики) за 2000 год сердечно-сосудистые заболевания являются главной причиной смертности в Испании (которая составляет приблизительно 35,0% от всех случаев смертности). Среди наиболее часто встречающихся сердечно-сосудистых заболеваний первое место по смертности занимают сосудистые или тромботические артериальные заболевания сердца (главным образом, острый инфаркт миокарда). В настоящее время было установлено, что у некоторых пациентов причиной развития тромбоза являются различные молекулярные факторы риска. Одним из таких факторов риска является присутствие так называемых антифосфолипидных антител. Сначала считалось, что эти аутоантитела направлены против анионных фосфолипидов, однако позднее было обнаружено, что многие из этих аутоантител направлены против комплексов, образованных белками, такими как гликопротеин I β2 или протромбин, и фосфолипидами. Совсем недавно было установлено, что таким антикоагулирующим действием обладают и другие белки, такие как белок С (PC), белок S, тромбомодулин или аннексин V, и этот факт может служить объяснением, почему присутствие этих аутоантител провоцирует развитие тромбоза.

Осложнения беременности

Осложнения беременности, главным образом, включают внутриутробную смерть плода на десятой неделе беременности, преждевременные роды, самопроизвольный выкидыш в период беременности до 10 недель, замедленное внутриутробное развитие, эклампсию и преэклапсию.

EPCR

Активированный белок С (АРС) является одним из главных регуляторных белков каскада реакций свертывания крови. PC, то есть зимоген АРС, активируется тромбином, связанным с тромбомодулином на поверхности эндотелиальных клеток. АРС в комбинации с белком S (его не-ферментным кофактором) осуществляет свою антикоагулирующую функцию посредством протеолиза активированных факторов V и VIII. Генетические и приобретенные дефекты в тромбомодулине, PC и в белке S были детектированы у пациентов с венозным и/или артериальным тромбозом. Рецептор эндотелиальноного PC/активированного PC (EPCR) представляет собой гликопротеин, экспрессируемый на мембране эндотелиальных клеток, которые специфически и с высокой аффинностью связываются с PC и АРС. Для функционирования EPCR он должен быть связан с фосфолипидной молекулой, которая стабилизирует его трехмерную структуру. Связывание PC с EPCR приводит к заметному усилению его активации под действием комплекса “тромбин-тромбомодулин” на поверхности эндотелиальных клеток. Функция EPCR заключается в концентрировании PC на поверхности эндотелиальных клеток и его презентации комплексу “тромбин-тромбомодулин”, что благоприятствует эффективной активации PC. EPCR индуцирует примерно 9-кратное увеличение индекса активации PC на поверхности эндотелиальных клеток in vivo, поэтому он ответственен за присутствие 90% от всех уровней АРС в кровотоке. Кроме того, АРС может активировать активированный протеазой рецептор-1, но только, если он связан с EPCR, в результате чего будет генерироваться “цитопротективный” клеточный сигнал и блокироваться апоптоз.

EPCR экспрессируется, главным образом, в эндотелии вен и артерий, в частности в толстом или среднем слое эндотелия. Кроме того, он интенсивно экспрессируется синцитиотрофобластами. Присутствующий в этих участках EPCR предупреждает развитие тромбоза и стимулирует желательные функции как эндотелиальных клеток, так и синцитиотрофобластов. Эти все возрастающие убедительные данные позволяют предположить, что EPCR играет определенную роль в сохранении беременности, поскольку у мышей, дефицитных по гену EPCR, такая делеция гена приводит к тромбозу плаценты и к ранней гибели эмбриона.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу определения аутоантител против EPCR (IgG, IgА и IgМ) в образце, взятом у индивидуума. С другой стороны, было продемонстрировано, что эти аутоантитела присутствуют у пациентов с диагностированными аутоиммунными заболеваниями (APLS и диссеминированной красной волчанкой); у пациентов с сосудистыми заболеваниями (венозным и артериальным тромбозом); и у женщин с осложнениями беременности. Примеры, которые представлены в настоящем описании, иллюстрируют, среди прочих, тот факт, что уровень анти-EPCR аутоантител в сыворотке или в плазме увеличивается у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (диагностированными у пациентов с APLS или с диссеминированной красной волчанкой), у пациентов с сосудистыми заболеваниями, такими как артериальный тромбоз, например инфаркт миокарда (диагностированный у пациентов с APLS или у пациентов, не страдающих APLS), ишемический инсульт (диагностированный у пациентов с APLS) или венозный тромбоз (диагностированный у пациентов с APLS), а также у пациенток с осложнениями беременности, такими как смерть плода (диагностированная у женщин с APLS или у женщин, не страдающих APLS) или многократные выкидыши (зарегистрированные у пациенток с APLS).

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что присутствие анти-EPCR аутоантител в сыворотке или в плазме пациентов с аутоиммунными заболеваниями и/или у пациентов с сосудистыми заболеваниями, и/или у пациенток с осложнениями беременности увеличено по сравнению с уровнем этих аутоантител в образцах, взятых у здоровых индивидуумов, не страдающих такими заболеваниями. Эти данные позволяют использовать указанные анти-EPCR аутоантитела в качестве маркера для in vitro оценки риска и восприимчивости индивидуума к развитию заболевания, ассоциированного с присутствием высоких уровней аутоантител против EPCR, такого как аутоиммунное заболевание, сосудистое заболевание или осложнения беременности.

Были проведены исследования на присутствие анти-EPCR аутоантител у пациентов с APLS и их связь со смертью плода. Была также проведена оценка влияния этих аутоантител на генерирование АРС на поверхности эндотелиальных клеток. Затем были проведены исследования на взаимосвязь присутствия анти-EPCR аутоантител со смертью плода в парных исследованиях, проводимых методом “случай - контроль” (т.е. путем парного сравнения каждого испытуемого с контролем). Полученные результаты подтверждают существующее мнение, что анти-EPCR аутоантитела являются фактором риска внутриутробной смерти плода. Предупреждение активации PC клеток, экспрессирующих EPCR на своей поверхности, может быть одним из механизмов, посредством которого эти аутоантитела осуществляют свои патологические функции.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 проиллюстрирована экспрессия rhsEPCR в Pichia pastoris. rhsEPCR был очищен из супернатанта стабильно трансформированных клеток P. pastoris, как описано в разделе “Материалы и методы” (см. примеры). 10 мкл каждой из трех фракций, содержащих rhsEPCR, выделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и белки детектировали с использованием синего GELCODE (А), или с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием моноклонального анти-myc антитела (Invitrogen)(В).

На фигуре 2 проиллюстрировано сравнение уровней анти-EPCR аутоантител у пациентов с диагностированным APLS и в контрольном образце. На этой фигуре показаны уровни анти-EPCR аутоантител. Антитела изотипа IgМ: контроль (среднее = 45 AU, условных единиц), пациенты (среднее = 57 AU); антитела изотипа IgА: контроль (среднее = 31 AU), пациенты (среднее = 39 AU); антитела изотипа IgG: контроль (среднее = 72 AU), пациенты (среднее = 75 AU).

На фигуре 3 проиллюстрировано влияние анти-EPCR аутоантител на генерирование АРС эндотелиальными клетками, где генерирование АРС в присутствии анти-EPCR аутоантител изотипа М можно было наблюдать у пациента С по сравнению с генерированием АРС в отсутствии антитела и в присутствии не-ингибирующего антитела. Для каждого случая было проведено 2-4 независимых эксперимента.

Подробное описание изобретения

Определения

Для лучшего понимания настоящей патентной заявки ниже приводится объяснение некоторых терминов и выражений, используемых в контексте настоящего изобретения.

Термин “индивидуум” относится к члену определенного вида млекопитающих, но не ограничивающегося ими, и включает таких животных, как домашние питомцы, приматы и человек; при этом предпочтительным индивидуумом является человек (мужчина или женщина) любого возраста или любой расы.

Термин “аутоиммунное заболевание” означает нарушения, при которых иммунная система реагирует на ткани хозяев, что приводит к развитию широкого спектра заболеваний. Репрезентативными примерами таких заболеваний являются (среди прочих заболеваний) APLS, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунный васкулит и т.п.

Термин “сосудистые заболевания” означает нарушения, которые поражают кровеносные сосуды. При поражении артерий недостаточная перфузия наблюдается и на других участках, орошаемых этими сосудами, и такое состояние является вторичным состоянием, возникающим вследствие окклюзии артерий, обусловленной атеросклеротическим поражением стенок сосудов или тромбозом, либо тем и другим одновременно. Венозные поражения, в свою очередь, характеризуются нарушением кровообращения, а именно нарушением возврата потока крови в сердце из пораженных периферических участков, и такие поражения обычно являются результатом образования венозных тромбов, приводящих к окклюзии сосудов. Если указанное поражение затрагивает капиллярное кровообращение, то оно характеризуется повреждением органа, в котором нарушено капиллярное кровообращение, необходимое для осуществления его функции. Примерами таких заболеваний являются (среди прочих) сосудистые заболевания, поражающие артерии, такие как инфаркт миокарда, инсульт, преходящие нарушения мозгового кровообращения, ишемия конечностей, атеросклероз, аневризмы и т.п., а также сосудистые заболевания, поражающие вены, такие как поверхностный и глубокий венозный тромбоз, эмболия легких и т.п., и патологии капиллярного кровообращения (тромбоз), проявляющиеся недостаточностью органов, наблюдаемой во время инфекций или на фоне аутоиммунных заболеваний.

Термин “осложнения беременности” означает нарушения, негативно влияющие на протекание беременности и возникающие у беременных в эмбрионе или в плоде. Примерами таких осложнений могут служить выкидыш, смерть плода, преждевременные роды, замедленное внутриутробное развитие плода, эклампсия и преэклампсия.

Термин “аутоантитела” означает антитела, продуцируемые индивидуумом и направленные против структур и тканей самого организма-хозяина (или специфичные к этим структурам и тканям), такие как, например, аутоантитела против тромбоцитов, аутоантитела против клеток щитовидной железы, аутоантитела против эритроцитов и т.п. В этом смысле термин “анти-EPCR аутоантитела” означает иммуноглобулины или антитела, продуцируемые указанным индивидуумом и специфичные к EPCR, присутствующим в тканях самого организма.

Используемый в настоящем изобретении термин “эпитоп” означает антигенную детерминанту белка, такую как его аминокислотная последовательность, распознаваемая рассматриваемым антителом.

Термины “пептид” и “полипептид” означают молекулярные цепи аминокислот, которые представляют собой фрагмент белка. Используемые здесь термины “белок” и пептид” являются взаимозаменяемыми.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что продуцирование анти-EPCR аутоантител у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, и/или у пациентов с сосудистыми заболеваниями, и/или у пациенток с осложнениями беременности усиливается по сравнению с продуцированием этих антител в образцах, взятых у здоровых индивидуумов, не страдающих указанными заболеваниями. Эти данные позволяют использовать указанные анти-EPCR аутоантитела в качестве маркера для in vitro оценки степени риска и восприимчивости индивидуума к развитию патологии, ассоциированной с присутствием высоких уровней аутоантител против EPCR.

Используемое с настоящем описании выражение “высокие уровни анти-EPCR аутоантител” означает уровни в AU (условных единицах), равные или превышающие 50-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов, включая, например, уровни в AU, равные или превышающие 60-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов, равные или превышающие 70-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов, равные или превышающие 80-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов, равные или превышающие 90-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов и равные или превышающие 95-тый процентиль в группе нормальных индивидуумов. Из-за различий между индивидуумами (например, по расе и т.п.) очень трудно (а практически невозможно) определить абсолютные величины, характерные для высоких уровней анти-EPCR аутоантител, которые были бы универсальными для всех индивидуумов. Указанные процентили могут быть легко вычислены стандартным методом, включающим тестирование группы здоровых индивидуумов (то есть людей, у которых не были диагностированы аутоиммунные заболевания или предшествующие эпизоды сосудистого заболевания или осложнения беременности во время обследования) на уровни анти-EPCR аутоантитела. Обнаружение анти-EPCR аутоантител может быть осуществлено любым стандартным методом, например посредством ELISA-анализа, описанного в разделе “Материалы и методы” (пример 1). Логично отметить, что у каждого индивидуума присутствует определенный уровень (AU) анти-EPCR аутоантител, и может быть определен конкретный уровень анти-EPCR аутоантител, который будет превышать уровень указанных аутоантител у 50% обследованных индивидуумов. Это значение представляет собой 50-тый процентиль. Очевидно, что существует также величина (AU, условные единицы), выше которой будет обнаружен уровень анти-EPCR аутоантител у 40% нормальных индивидуумов, и эта величина будет соответствовать 60-тому процентилю. В свою очередь, могут быть определены и другие величины, выше которых будут обнаруживаться антитела у 30%, 20%, 10% и 5% нормальных индивидуумов, и эти величины соответствуют 70-, 80-, 90- и 95-му процентилю соответственно.

Настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия высоких уровней аутоантител против эндотелиального рецептора белка С/активированного белка С (ЕРCR) в образце, где указанный способ отличается тем, что он предусматривает количественную оценку in vitro анти-EPCR аутоантител в указанном образце, взятом у индивидуума. Указанные высокие уровни аутоантител связаны с патологией, выбранной из аутоиммунного заболевания (например, APLS, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, аутоиммунного васкулита и т.п.); сосудистого заболевания (например, артериального сосудистого заболевания, такого как инфаркт миокарда, инсульт, преходящие нарушения мозгового кровообращения, ишемия конечностей, атеросклероз, аневризмы, тромбоз и т.п., или венозного сосудистого заболевания, такого как поверхностный или глубокий венозный тромбоз, эмболия легких и т.п., или сосудистые патологии капиллярного кровообращения); и осложнения беременности (например, выкидыша, внутриутробной смерти плода, преждевременных родов, замедленного внутриутробного развития, эклампсии и преэклапсии). Таким образом, рассматриваемый способ согласно изобретению может быть применен для определения изменения уровней анти-EPCR аутоантител в течение данного периода времени. Такие определения согласно изобретению осуществляют путем их сравнения с нормальными уровнями анти-EPCR аутоантител.

Указанный способ включает стадию, в которой у индивидуума берут образец, такой как образец сыворотки или плазмы, который может быть получен любым стандартным методом, например путем забора крови.

Образцы могут быть взяты у индивидуумов, у которых ранее были диагностированы или не были диагностированы аутоиммунные заболевания или сосудистые заболевания или осложнения беременности. Эти образцы могут быть также взяты у индивидуумов, проходящих курс лечения, или у индивидуумов, которые ранее подвергались лечению по поводу указанных заболеваний или осложнений.

В зависимости от конкретного способа согласно изобретению детекцию и количественную оценку этих анти-EPCR аутоантител осуществляют посредством иммунологического теста, проводимого с использованием маркера, который позволяет детектировать и количественно определять уровень образования специфических комплексов антиген-антитело, например иммунохроматографического теста (с использованием латекса, коллоидного золота и т.п.) и иммунологического теста, в котором указанным маркером является флуоресцентное вещество, изотоп, тяжелый металл, фермент, люминесцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, хромоген и т.п.

В настоящем изобретении могут быть применены хорошо известные тесты широкого ряда, включая использование немеченных антител (“первого антитела”) и меченного антитела (“второго” антитела). Такими методами являются Вестерн-блоттинг или Вестерн-перенос, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), RIА (радиоиммуноанализ) и т.п.

В конкретном варианте изобретения предпочтительным иммунологическим тестом в способе согласно изобретению, который позволяет осуществлять детекцию и/или количественную оценку указанных анти-EPCR аутоантител, является ELISA-анализ, который предусматривает:

а) иммобилизацию на твердом носителе полипептида, содержащего последовательность аминокислот EPCR, или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR аутоантителом;

b) инкубирование указанного иммобилизованного полипептида с образцом, предположительно содержащим анти-EPCR аутоантитела и взятым от указанного индивидуума, в течение периода времени, достаточного для связывания антител с иммобилизованным полипептидом и образования комплексов “полипептид - анти-EPCR аутоантитело”;

с) удаление оставшегося образца, не связанного с иммобилизованным полипептидом;

d) инкубирование указанных комплексов “полипептид - анти-EPCR аутоантитело” со “вторым антителом”, конъюгированным с ферментом, где указанное “второе” антитело обладает способностью связываться с указанными анти-EPCR аутоантителами.

Таким полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность EPCR или ее фрагмент, включающий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR аутоантителом, может быть полипептид, содержащий аминокислотную последовательность полноразмерного EPCR, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента EPCR и содержащий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR антителом. В конкретном варианте изобретения вышеуказанным полипептидом является гибридный белок, содержащий:

(i) область А, состоящую из полипептида, содержащего аминокислотную последовательность EPCR или ее фрагмент, включающий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR антителом; и

(ii) область В, состоящую из полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, используемую для выделения или очистки вышеупомянутого гибридного белка, и/или аминокислотную последовательность, используемую для иммобилизации вышеупомянутого гибридного белка на твердом носителе.

Эта область В может быть связана с амино-концом области А или с карбокси-концом области А.

В конкретном варианте изобретения область А содержит аминокислотную последовательность растворимой части человеческого EPCR.

Область В содержит аминокислотную последовательность, используемую для выделения или очистки определенного выше гибридного белка, и/или аминокислотную последовательность, используемую для иммобилизации вышеупомянутого гибридного белка на твердом носителе. В области В может присутствовать практически любая аминокислотная последовательность, которая может быть использована для выделения или очистки гибридного белка (обычно называемая общим термином пептидная “метка” (tag)), и/или любая аминокислотная последовательность, которая может быть использована для иммобилизации гибридного белка на твердом носителе. Иногда аминокислотная последовательность, используемая для выделения или очистки гибридного белка, может также действовать как аминокислотная последовательность, используемая для иммобилизации вышеупомянутого гибридного белка на твердом носителе, и наоборот. В конкретном варианте изобретения область В содержит аминокислотную последовательность, используемую для выделения или очистки гибридного белка, и аминокислотную последовательность, используемую для иммобилизации гибридного белка на твердом носителе.

В качестве примера такой аминокислотной последовательности, используемой для выделения или очистки гибридного белка, и/или аминокислотной последовательности, используемой для иммобилизации гибридного белка на твердом носителе, может служить Arg-метка, His-метка, FLAG-метка, Strep-метка, эпитоп, который может распознаваться антителом, такой как с-myc-метка, SВР-метка, S-метка; кальмодулин-связывающий пептид; домен, связывающийся с целлюлозой; хитин-связывающий домен; глутатион-S-трансферазная метка; белок, связывающийся с мальтозой; NusA, TrxA, DsbA, Avi-метка и т.п. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), аминокислотная последовательность, такая как Ala-His-Gly-His-Arg-Pro (SEQ ID NO:4)(2, 4 и 8 копий), Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser (SEQ ID NO:5), Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys (SEQ ID NO:6)(6 повторов), β-галактозидаза, VSV-гликопротеин (YTDIEMNRLGK).

В конкретном варианте изобретения указанная область В состоит из полипептида, содержащего эпитоп, который может распознаваться антителом (такой как эпитоп с-myc, распознаваемый анти-с-myc антителом) и концевые гистидины (His-метку).

В примере, который приводится в данном описании, описано продуцирование полипептида, обозначенного rhsEPCR и состоящего из гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность растворимой части человеческого EPCR (hsEPCR), аминокислотную последовательность, соответствующую эпитопу с-myc, и концевые гистидины, то есть аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

Полипептид, используемый в способе согласно изобретению, может быть получен стандартными методами, например путем экспрессии в соответствующей экспрессионной системе.

“Вторым антителом”, используемым в вышеупомянутом ELISA-анализе, является антитело, специфичное к иммуноглобулину определенного изотипа и происходящее от вида, к которому не относится исследуемый индивидуум, что позволяет охарактеризовывать данный изотип анти-EPCR аутоантител. Так, например, это “второе” антитело, специфичное к иммуноглобулину данного изотипа, выбирают из антитела против человеческого IgG, антитела против человеческого IgМ, антитела против человеческого IgА и их смесей. В конкретном варианте изобретения указанное “второе” антитело конъюгируют с маркером, что позволяет осуществлять детекцию комплекса, такого как ферментный комплекс (например, с пероксидазой, щелочной фосфатазой и т.п.).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки риска и восприимчивости индивидуума к развитию патологии, ассоциированной с присутствием высоких уровней анти-EPCR аутоантител у данного индивидуума, где указанный способ предусматривает количественную оценку in vitro аутоантител против EPCR в образце, взятом у указанного индивидуума.

В конкретном варианте изобретения указанную патологию, ассоциированную с присутствием высоких уровней анти-EPCR аутоантител у индивидуума, выбирают из аутоиммунного заболевания, такого как APLS, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунный васкулит и т.п.; сосудистого заболевания, такого как артериальное сосудистое заболевание, например инфаркт миокарда, инсульт, преходящие нарушения мозгового кровообращения, ишемия конечностей, атеросклероз, аневризмы, тромбоз и т.п., или венозного сосудистого заболевания, такого как поверхностный или глубокий венозный тромбоз, эмболия легких и т.п., или сосудистых патологий капиллярного кровообращения, таких как тромбоз капиллярных сосудов, недостаточность органов при инфекциях или при аутоиммунном заболевании и т.п.; и осложнений беременности, например выкидыша, смерти плода, преждевременных родов, замедленного внутриутробного развития, эклампсии и преэклапсии и т.п.

Указанный способ согласно изобретению основан на обнаружении того факта, что у индивидуумов, у которых было диагностировано аутоиммунное или сосудистое заболевание или осложнение беременности, присутствуют высокие уровни анти-EPCR аутоантител по сравнению с соответствующими уровнями у индивидуумов, в истории болезни которых отсутствуют указанные заболевания или осложнения беременности.

Способ согласно изобретению, применяемый для оценки (анализа) риска и восприимчивости индивидуума к развитию патологии, ассоциированной с присутствием высоких уровней анти-EPCR аутоантител, осуществляют путем сравнения уровней аутоантител, определяемых в образце обследуемого индивидуума, с нормальными уровнями (определяемыми как уровни, обнаруживаемые у группы нормальных индивидуумов, такие как уровни, упомянутые выше при определении термина “высокие уровни”). Указанный способ основан на иммунологических анализах, описанных в данном разделе.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro мониторинга эффекта терапии, проводимой индивидууму с патологией, связанной с присутствием высоких уровней анти-EPCR аутоантител, где указанный способ предусматривает количественную оценку in vitro этих анти-EPCR аутоантител в образце, взятом у вышеупомянутого индивидуума. Этот способ проводят, как описано выше, однако в данном случае образцы берут у индивидуумов, у которых ранее были диагностированы некоторые из аутоиммунных или сосудистых заболеваний, или некоторые осложнения беременности, подвергаемые терапии. Этот способ позволяет оценивать эффект терапии, то есть ее эффективность или действенность для индивидуума, подвергаемого такой терапии, для того чтобы (например) решить, продолжать ли данную терапию или внести в нее определенные изменения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению анти-EPCR аутоантител в способе оценки присутствия высоких уровней аутоантител против EPCR в образце, взятом у индивидуума. В конкретном варианте изобретения такое присутствие высоких уровней анти-EPCR аутоантител связано с патологией, выбранной из аутоиммунного заболевания, сосудистого заболевания и осложнений беременности. Повышенный уровень анти-EPCR аутоантител у индивидуума ассоциируется с повышенным риском или восприимчивостью индивидуума к развитию заболевания, ассоциированного с присутствием высоких уровней аутоантител против EPCR, такого как аутоиммунное заболевание, сосудистое заболевание или осложнения беременности.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида, содержащего последовательность аминокислот EPCR или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR аутоантителом, в способе анализа на присутствие аутоантител против эндотелиального рецептора EPCR в образце. Указанный способ предусматривает детекцию и количественную оценку in vitro анти-EPCR аутоантител в указанном образце. В конкретном варианте изобретения указанную патологию, ассоциированную с высокими уровнями анти-EPCR аутоантител, выбирают из аутоиммунного заболевания, сосудистого заболевания и осложнения беременности.

В конкретном варианте изобретения вышеупомянутым полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность EPCR или ее фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR аутоантителом, является такой полипептид, который был ранее определен в описании ELISA-теста, проводимого для детекции и/или количественной оценки анти-EPCR аутоантител. В конкретном варианте изобретения этот полипептид представляет собой так называемый rhsEPCR (см. пример), состоящий из гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность растворимой части человеческого EPCR (hsEPCR), аминокислотную последовательность, соответствующую эпитопу с-myc и концевые гистидины, то есть аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к набору, предназначенному для in vitro оценки высоких уровней анти-EPCR аутоантител и включающему полипептид, имеющий аминокислотную последовательность EPCR или ее фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознваться анти-EPCR аутоантителом. В конкретном варианте изобретения вышеуказанным полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность EPCR или ее фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп, который может распознаваться анти-EPCR аутоантителом, является такой полипептид, который был ранее определен в описании ELISA-теста, проводимого для детекции и/или количественной оценки анти-EPCR аутоантител. В конкретном варианте изобретения этот полипептид представляет собой так называемый rhsEPCR (см. пример), состоящий из гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность растворимой части человеческого EPCR (hsEPCR), аминокислотную последовательность, соответствующую эпитопу с-myc, и концевые гистидины, то есть аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

В другом аспекте настоящего изобретения указанный набор используют для оценки in vitro риска и восприимчивости индивидуума к развитию патологии, ассоциированной с присутствием высоких уровней анти-EPCR аутоантител и выбранной из аутоиммунного заболевания, сосудистого заболевания и осложнений беременности.

Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1

Использование анти-EPCR аутоантител в качестве маркеров для оценки риска и восприимчивости индивидуума к развитию патологии, ассоциированной с присутствием высоких уровней указанных аутоантител

1. Материалы и методы

Пациенты

1. Пациенты с APLS и контроль

В программу исследований были включены всего 43 пациента (в возрасте 44 года ± 11 лет (среднее ± стандартное отклонение (ср.откл.)), а конкретно 39 женщин и 4 мужчин, у которых был диагностирован антифосфолипидный синдром (APLS) в соответствии с Международными диагностическими критериями [Wilson WA, Gharavi AE, Koike T., Lockshin MD, Branch DW, Piette JC, Brey R, Derksen R, Harris EN, Hughes GR, Triplett DA, Khamashta MA. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphosholipid syndrome: report of an international workshop. Arthritis Rheum. 1999; 42:1309-11; Brandt JT, Barna LK, Triplett DA. Laboratory identification of lupus anticoagulants: results of the Second International Workshop for Identification of Lupus Anticoagulants. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulants/Antiphosholipids Antibodies of the ISTH. Thromb. Haemost. 1995; 74:1597-603], и эти исследования проводили с февраля 1998 до марта 2002. Все пациенты были охарактеризованы на присутствие волчаночных антикоагулирующих антител (АСL) и на наличие в истории болезни диагноза венозного тромбоза (n=17), или артериального тромбоза (n=13, из которых у 4 пациентов был диагностирован острый инфаркт миокарда (AMI), у 7 пациентов было диагностировано сердечно-сосудистое тромботическое заболевание (CVTD), а у 2 пациентов - заболевание других органов), либо того и другого [n=13, у всех этих пациентов был диагностирован глубокий венозный тромбоз + CVTD (n=8), AMI (n=1), CVTD+AMI (n=3) или артериальный тромбоз в мезентриальной области (n=1)]. У двадцати семи из этих пациентов была диагностирована системная красная волчанка (SLE). Пробы сыворотки брали в тот период времени, когда анализ на ACL был положительным, и, по крайней мере, через 3 месяца после последнего эпизода тромботического осложнения. Пробы хранили при -80°С до проведения обработки в целях детекции анти-EPCR аутоантител.

В контрольную группу входили 43 здоровых добровольца, у которых в истории болезни не был диагностирован тромбоз или ACL. Все пациенты и все индивидуумы контрольной группы давали информированное согласие на участие в исследовании.

2. Женщины, беременность которых заканчивалась смертью плода, и контроль

Было проведено парное исследование внутриутробной смерти плода методом “случай - контроль”. В исследовании участвовало 87 женщин, в возрасте от 19 лет до 31 года (средний возраст: 27 лет), и это исследование проводили с сентября 1996 до сентября 2002, то есть после первого эпизода внутриутробной смерти плода, зарегистрированной на десятую неделю после наступления аменореи, и в последнюю беременность. В это исследование были включены женщины с ранее диагностированным эпизодом осложнения тромбоза; женщины с диагностированными хроническими инфекционными заболеваниями и некоторыми извест