Лечение пролиферативных заболеваний с использованием антисмыслового олигомера iap и химиотерапевтического препарата

Лечение пролиферативных заболеваний с использованием антисмыслового олигомера iap и химиотерапевтического препарата

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Изобретение относится к лечению рака и других пролиферативных заболеваний.

Одним из путей гибели клеток является апоптоз или программируемая клеточная смерть. Апоптоз зачастую является естественной стадией развития и существования здоровых тканей. Этот процесс может происходить настолько быстро, что его трудно зафиксировать.

Известно, что вступление клеток в апоптоз играет критическую роль в таких процессах как, например эмбриогенез, вирусный патогенез, развитие рака, аутоиммунные нарушения и нейродегенеративные заболевания. Предполагают, что нарушение процесса апоптоза имеет место при развитии рака, аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и рассеянный склероз, и вирусных инфекциях, включая инфекции, ассоциированные с вирусом герпеса, поксвирусом и аденовирусом.

В последние годы стала ясна важная роль апоптоза при раке.

Идентификация в конце 70-х годов онкогенов, стимулирующих деление клеток, дала начало практически всеобщей концентрации внимания на клеточной пролиферации, что являлось доминирующей темой исследований в онкобиологии на протяжении многих лет. Господствовавшая долгое время догма постулировала, что способы противораковой терапии предпочтительно должны быть направлены на быстро делящиеся по сравнению с нормальными «раковые» клетки. Это объяснение не было полностью удовлетворительным, поскольку некоторые медленно растущие опухоли легко поддаются лечению, в то время как многие опухоли, характеризующиеся быстрым делением клеток, оказываются исключительно устойчивыми к противораковой терапии. Прогресс в области онкологии привел к появлению в онкобиологии новой парадигмы, согласно которой новообразование рассматривается как неспособность клетки осуществлять нормальный путь программируемой клеточной смерти. Нормальные клетки получают постоянную обратную связь от своих соседей посредством разнообразных факторов роста и совершают «самоубийство» при нарушении контекста межклеточных взаимодействий. Раковые клетки некоторым образом способны игнорировать эти команды и продолжают неуместное деление. В настоящее время считается, что многие способы противораковой терапии, включая лучевую терапию и многие химиотерапевтические схемы, как считалось действующие посредством повреждения клеток, в действительности представляют собой пусковые факторы апоптоза.

Как нормальные типы клеток, так и раковые клетки проявляют широкий спектр восприимчивости к факторам, запускающим апоптоз, однако детерминанты этой устойчивости находятся до сих пор на стадии изучения. Многие типы нормальных клеток претерпевают временную остановку роста в ответ на сублетальную дозу излучения или цитостатика, в то время как находящиеся по соседству раковые клетки входят в апоптоз. Этот дифференцированный эффект при определенной дозе открывает ключевые терапевтические возможности, обеспечивающие успешное лечение онкологических заболеваний. Исходя из этого, не вызывает удивления тот факт, что устойчивость раковых клеток к апоптозу, вероятнее всего, является главной причиной неэффективности лечения рака.

Идентифицированы несколько эндогенных белков, которые являются мощными ингибиторами апоптоза, включая семейства белков IАР и Всl-2 у млекопитающих. Некоторые представители IАР семейства непосредственно ингибируют терминальные эффекторные каспазы, например каспазу-3 и каспазу-7, принимающих участие в осуществлении смерти клетки, наряду с ключевой инициаторной митохондриальной каспазой, каспазой-9, играющей важную роль в опосредовании клеточной смерти, вызванной химиотерапией. Белки IАР являются единственными известными на сегодняшний момент эндогенными ингибиторами каспаз и таким образом играют центральную роль в регуляции апоптоза. Установлено, что белки IАР играют важную роль в развитии некоторых видов рака и предполагаемая хромосомная транслокация, затрагивающая конкретный IАР (с1АР2/Н1АР1) была идентифицирована при MALT-лимфоме. Недавно у больных острой миелогенной лейкемией была выявлена взаимосвязь между повышением уровня XIAP, неблагоприятным прогнозом и коротким периодом выживания. Более того, отмечалась значительная гиперэкспрессия гена XIAP во многих линиях опухолевых клеток, депониированных НИР (Национальный институт рака).

Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных противоопухолевых препаратах, в особенности препаратов, способных индуцировать в клетках процесс апоптоза и обходить анти-апоптозные сигналы, возникающие в таких клетках.

Краткое описание изобретения.

Настоящее изобретение относится к способам индуцирования апоптоза в клетке. Способы, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы для лечения рака и других пролиферативных заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациентов, страдающих пролиферативными заболеваниями, такими как рак, посредством введения антисмыслового олигонуклеотида IAP и химиотерапевтического препарата. Химиотерапевтический препарат и антисмысловой олигонуклеотид IAP вводят одновременно или с интервалом, не превышающим 28 дней (например, 21 день, 14 дней, 7 дней, 1 день или 1 час), в дозах, которые в совокупности достаточны для оказания удовлетворительного лечебного эффекта. Антисмысловые олигонуклеотиды IAP сокращают количество продуцируемого белка IAP, что позволяет клетке, которая нормально экспрессирует IAP, войти в апоптоз. Указанный процесс осуществляется посредством введения олигонуклеотидов, которые специфично гибридизуются с одним и более полинуклеотидом, кодирующим IAP. Специфичная гибридизация олигонуклеотида согласно настоящему изобретению с полинуклеотидом, кодирующим IAP (например, РНК или ДНК), препятствует нормальной функции вышеуказанного полинуклеотида, кодирующего IAP, что приводит к сокращению продукции IAP. Молекула нуклеиновой кислоты, которая модулирует функцию нуклеиновой кислоты-мишени путем специфической гибридизации с указанной кислотой-мишенью, обычно называется «антисенс-препарат». Несмотря на то, что может быть использован любой антисмысловой олигонуклеотид IАР, уменьшающий экспрессию IАР, в одном аспекте настоящего изобретения олигонуклеотид насчитывает от 8 до 30 нуклеотидов в длину и содержит, по меньшей мере, восемь последовательно идущих нуклеотидов последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289, и 300-460.

В отдельных способах реализации олигонуклеотид содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289, и 300-460. Желательно, чтобы олигонуклеотид состоял (или преимущественно состоял) из одной или более вышеуказанных SEQ ID NO. Например, олигонуклеотид может содержать последовательность, выбранную из SEQ ID NO 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, и 289; SEQ ID NO 300-389, или SEQ ID NO 390-460. В наиболее предпочтительном способе реализации, настоящее изобретение, предусматривает олигонуклеотид, который содержит 11 остатков ДНК (дезоксирибонуклеотидов), фланкированных с каждой стороны (находящихся между) четырьмя 2'-O-метилированными остатками РНК (остатки 2'-O-метил РНК) и состоящий из одной из следующих последовательностей: 5'-UUGGT TTCCAATGTGUUCU-3" (SEQ ID NO: 155); 5'-ACACGACCGCTAAGAAACA-3' (SEQ ID NO: 16); 5'-ACAGGACTACCACTTGGAA-3' (SEQ ID NO: 157); 5"-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3' (SEQ ID NO: 27); 5'GCUGAGTCTCCATATUGCC-3" (SEQ ID NO: 141); 5'-UCGGGTATA TGGTGTCUGA-3' (Номер SEQ ID: 41); 5'-AAGC ACTGCACTTGGUCAC-3' (SEQ ID NO: 47); 5'-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 51); 5'-ACCCTGGATACCATTUAGC-3' (Номер SEQ ID: 63); 5'-UGUCAGTACA TGTTGGCUC-3' (Номер SEQ ID NO: 161); и 5'-UGCACCCTGGATGCCAUUU-3' (Номер SEQ ID NO: 151).

В другом способе реализации настоящего изобретения антисмысловой олигонуклеотид IAP насчитывает до 30 нуклеотидов в длину и содержит, по меньшей мере, 8 последовательных нуклеотидов из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 461-490.

Другие олигонуклеотиды IAP, которые могут назначаться в сочетании с химиотерапевтическим препаратом, - это олигонуклеотиды, которые гибридизуются при жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид IАР и отобранным из белков NAIP (Bircl), HIAP1 (cIAP2, API2, MIHC, hITA), HIAP2 (cIAPI, MIHB), XIAP (hILP, hILP1, MIHA, AP13), сурвивина (TIAP, MIHD, AP14), ливина (KIAP, ML-IAP, cIAP3, HIAP3) и hILP2 (Ts-IAP, TIAP.

Олигонуклеотид, который используют в способе согласно настоящему изобретению, может содержать, по меньшей мере, одну модифицированную связь (например, фосфоротиоатную, метилфосфонатную, фосфотриэфирную, фосфородитиоатную или фосфоселенатную связи), модифицированный нуклеотид (например, 5-метил цитозин) и/или модифицированную остаток сахара (например, 2'-O-метоксиэтильная группа или 2'-O-метильная группа). В одном из способов реализации изобретения олигомер представляет химерный олигомер (например, олигонуклеотид, содержащий остатки ДНК, связанные вместе фосфоротиоатными или фосфодиэфирными связями, и фланкированные, по меньшей мере, одной, двумя, тремя или четырьмя 2'-O-метилированными остатками РНК, связанными между собой фосфоротиоатными связями).

В другом своем аспекте настоящее изобретение отностся к способу стимуляции процесса апоптоза в клетке. Этот способ включает стадию введения в клетку антисмыслового олигонуклеотида IAP и химиотерапевтического препарата одновременно, либо с интервалом не более 28 дней в таких количествах, которые в совокупности достаточны для стимуляции апоптоза. Клетка может находиться ех vivo или in vitro. В одном способе реализации изобретения в качестве клетки выступает раковая клетка (например, раковая клетка человека) или клетка лимфоидного или миеломного происхождения.

Рак может представлять собой, например острый лейкоз, острый лимфолейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, промиелоцитарная лейкемия, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, миелодиспластический синдром, хронический лимфолейкоз, истинная полицитемия, лимфома, болезнь Ходжкина, макроглобулинемия Вальденстрома, фибросаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, рак кишечника, рак поджелудочной железы, рак груди, рак яичника, рак простаты, папиллярная карцинома, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарцинома, рак потовой железы, рак сальной железы, цистаденокарцинома, медуллярный рак, рак бронха, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, тератокарцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичка, рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак желчного пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, шваннома, менингиома, меланома, нейробластома или ретинобластома. При лечении рака может быть желательно назначать дополнительно один или несколько химиотерапевтических препаратов, препарат, влияющий на биологический ответ и/или химиосенсибилизирующие средства. Желательно, чтобы введение одного или нескольких вышеперечисленных препаратов проводилось в пределах 28 дней со дня введения олигонуклеотида.

Химиотерапевтический препарат и олигонуклеотид можно вводить одним путем либо различными путями. Несмотря на то, что допустим любой способ введения, обеспечивающий адекватное количество препарата в нужном месте, предпочтительными являются внутривенный и внутриопухолевый пути введения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармакологическому составу, который содержит химиотерапевтический препарат и антисмысловой олигонуклеотид IАР, где оба компонента представлены в таких количествах, которые в совокупности достаточны для оказания лечебного эффекта у пациента, страдающего пролиферативным заболеванием (например, раком). При необходимости, фармакологический препарат может дополнительно содержать другие компоненты (например, коллоидную дисперсную систему).

Изобретение также относится к способу лечения пациентов, страдающих пролиферативным заболеванием (например, таким как рак или лимфопролиферативные процессы), который предусматривает введение больному химиотерапевтического препарата и каталитической молекулы РНК или экспрессионного вектора, кодирующего данную молекулу РНК, где оба компонента вводятся одновременно или с интервалом, не превышающим 28 дней в дозе, которая в совокупности достаточна для оказания лечебного эффекта. В предпочтительном способе реализации изобретения связующие фрагменты каталитической молекулы РНК содержат, по меньшей мере, восемь последовательных нуклеотидов, соответствующих антисмысловому олигонуклеотиду IАР (например, любую последовательность нуклеотидов, из приведенных в таблицах 2, 3, 7, 8 и 9). Молекула РНК предпочтительно содержит структуру типа «головки молотка», но допустима, также, структура типа «шпильки», дельта-вируса гепатита, интрона группы 1, структур типа VS РНК или РНК RNaseP.

Изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего раком или лимфопролиферативным заболеванием, который предусматривает введение указанному пациенту химиотерапевтического препарата и двухцепочечной молекулы РНК, содержащей от 21 до 29 нуклеотидов, из которых, по меньшей мере, восемь последовательно идущих нуклеотидов соответствуют антисмысловому олигонуклеотиду IAP (например, любая последовательность, из приведенных в таблицах 2, 3, 7, 8 и 9). Химиотерапевтический препарат и двухцепочечная молекула РНК вводятся одновременно или с интервалом, не превышающим 28 дней, в количествах, которые в совокупности достаточны для оказания благоприятного лечебного эффекта.

В другом родственном аспекте настоящее изобретение также оотносится к способу лечения пациента, страдающего раком или лимфопролиферативным заболеванием, который предусматривает введение указанному пациенту химиотерапевтического препарата и двухцепочечной молекулы РНК, состоящей из 50-70 нуклеотидов, первый домен которой состоит из 21-29 нуклеотидов, содержащих, по меньшей мере, восемь последовательных нуклеотидов, соответствующих антисмысловому олигонуклеотиду IPA (например, любая последовательность из приведенных в таблицах 2, 3, 7, 8, и 9); второй домен, которой комплементарен первому домену, а петля домена расположена между первым и вторым доменами таким образом, что первый и второй домены способны формировать двойную спираль молекулы РНК. Химиотерапевтический препарат и двухцепочечная молекула РНК вводятся одновременно или с интервалом не более 28 дней в количествах, которые в совокупности достаточны для оказания благоприятного лечебного эффекта.

Изобретение предусматривает несколько наборов. Один из наборов включает 1) антисмысловой олигонуклеотид IAP, имеющий в длину от восьми до тридцати нуклеотидов, 2) химиотерапевтический препарат и 3) инструкцию по введению антисмыслового олигонуклеотида IAP и химиотерапевтического препарата пациентам с пролиферативным заболеванием в количествах, которые в совокупности достаточны для оказания благоприятного лечебного эффекта у пациента.

Другой комплект включает: 1) антисмысловой олигонуклеотид IAP, имеющий в длину от восьми до тридцати нуклеотидов, 2) инструкцию по введению антисмыслового олигонуклеотида IAP и химиотерапевтического препарата пациентам с пролиферативным заболеванием в количествах, которые в совокупности достаточны для оказания благоприятного лечебного эффекта.

Кроме того, еще один комплект включает в себя 1) состав, представляющий собой предмет изобретения (описан выше) и 2) инструкции по назначению состава пациентам с пролиферативным заболеванием в количествах, которые в совокупности достаточны для оказания благоприятного лечебного эффекта у пациента.

Под «олигонуклеотидом» подразумевается соединение, которое содержит цепочку, состоящую, по меньшей мере, из восьми нуклеотидов, соединенных между собой группами сцепления (связями). В это определение входят естественные и синтетические олигонуклеотиды, как модифицированные, так и немодифицированные, а также миметики олигонуклеотидов, например пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНА), кольцевые нуклеиновые кислоты (LNA) и арабинонуклеиновые кислоты (АНК). Олигонуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать многочисленные нуклеотиды и связи, включая подробно описанные ниже, в разделе «Олигонуклеотиды и другие нуклеотидные олигомеры».

«Белок», «полипептид» или «полипептидный фрагмент» обозначает любую цепочку, состоящую из двух и более аминокислот независимо от модификации, происшедшей после трансляции (например, гликозилирования или фосфорилирования), полностью или частично состоящую из природных полипептидов или пептидов, или искусственно синтезированных полипептидов/пептидов.

«Апоптоз» обозначает процесс смерти клетки, в ходе которого погибающая клетка демонстрирует ряд хорошо известных биохимических признаков, включающих образование пузырьков в клеточной мембране, сморщивание сомы клетки, конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК.

Под термином «ген IAP» подразумевается ген, кодирующий полипептид, имеющий, по меньшей мере, один BIR-домен и способный регулировать (ингибировать или стимулировать) процесс апоптоза в клетке или в тканях при его введении любыми способом интрацеллюлярной или экстрацеллюлярной доставки (см., например, патент США №5,919,912). В наиболее предпочтительных способах реализации настоящего изобретения ген IAP представляет собой ген, нуклеотидная последовательность которого идентична, по меньшей мере, одному из XIAP, НIАР1 или HIAP2 человека или крысы (каждый из которых описан в патенте США №6,156, 535) на 50% или более (например, 85%, 90% или 95%). Участок последовательности, по которому производится идентификация, предпочтительно представляет собой участок, кодирующий, по меньшей мере, один BIR-домен и кольцевой домен «цинковых пальцев». Гены IAP млекопитающих включают нуклеотидные последовательности, которые могут быть выделены у любого млекопитающего. Предпочтительно, в качестве млекопитающего выступает человек.

Под «Белком IAP» или «полипептидом IAP» подразумевается полипептид или его фрагмент, кодируемый геном IAP. Полипептиды IAP включают NAIP (Birc1), НIАР1 (cIAP2, API2, MIHC, hIТА), HIAP2 (сIАР1, MINB), XIAP (hILP, hILPI, MIHA, API3), сурвивин (TIAP, MIHD, AP14), ливин (KIАР, ML-IAP, HIAP3), и hILP2 (Ts-IAP, TIAP).

Под «биологической активностью» подразумевается любая активность, вызванная полипептидом IАР в условиях in vivo и in vitro.

Под «стимуляцией апоптоза» подразумевается увеличение числа клеток, находящихся в состоянии апоптоза, в данной клеточной популяции (например, раковых клеток, лимфоцитов, фибробластов и любых других клеток). Подразумевается, что степень стимуляции апоптоза, происходящей под воздействием апоптоз-стимулирующего препарата в каждом отдельном исследовании отличается, но квалифицированный специалист сможет определить статистически значимое усиление уровня апоптоза, свидетельствующее о том, что олигонуклеотид стимулирует апоптоз, который до этого был ингибирован белком IАР. Предпочтительно, чтобы под «стимуляцией апоптоза» подразумевалось, что количество клеток, входящих в состояние апоптоза составляет, по меньшей мере, 10%, предпочтительно 25% или даже 50%, причем наиболее желательным является, по меньшей мере, двукратное усиление апоптоза по сравнению с клетками, в которые не вводили олигомер согласно настоящему изобретению, но которые в остальном подвергались идентичному воздействию. Предпочтительно, образец, подвергающийся мониторингу, представляет собой образец культуры клеток, которые обычно претерпевают неполноценный апоптоз (например, раковые клетки). Способы, используемые для определения изменения степени апоптоза (например, стимуляции или сокращения) описаны ниже.

Под олигонуклеотидом, который «ингибирует экспрессию» гена-мишени (например, IAP), подразумевается такой олигонуклеотид, который сокращает количество мРНК-мишени, или белка, кодируемого данной мРНК, по меньшей мере, на 5%, предпочтительно на 10%, 25% или даже 50% по отношению к не обработанным образцам. Способы, используемые для измерения уровня мРНК и белков хорошо известны, примеры методик описаны ниже.

Под «гибридизацией» подразумевается образование водородных связей, которые могут быть в конформации Уотсона-Крика, Hoogsteen-a или обратной конформации Hoogsteen-a между комплиментарными нуклеотидами. Например, аденин или тимин являются комплиментарными нуклеотидами, которые образуют пару благодаря формированию водородных связей.

Под «пролиферативным заболеванием» подразумевается заболевание, которое вызвано или развилось в результате неадекватно интенсивного деления клеток, неадекватно низкого уровня апоптоза или обоих этих процессов одновременно. Одним из примеров пролиферативного заболевания является рак. Примеры рака включают все без ограничения лейкозы (например, острый лейкоз, острый лимфолейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, промиелоцитарная лейкемия, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, миелодиспластический синдром, хронический лимфолейкоз, истинная полицитемия, лимфома (лимфогранулематоз, лимфома не Ходжкина), макроглобулинемия Вандельстрема, болезнь Н-цепей и солидные опухоли, такие как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак, аденокарцинома, рак потовой железы, рак сальной железы, папиллярный рак, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярный рак, рак бронха, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, тератокарцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичка, рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак желчного пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, шваннома, менингиома, меланома, нейробластома или ретинобластома. К пролиферативным процессам относятся также лимфопролиферативные заболевания.

Предпочтительно, олигонуклеотид, который используют в способе согласно настоящему изобретению, находясь в клетке, которая неспособна нормальным путем войти в состояние апоптоза, оказывает влияние на его стимуляцию и/или снижает уровень мРНК IАР либо содержания белка. Предпочтительно, чтобы это стимулирование уровня апоптоза составляло, по меньшей мере 10% по отношению к контрольным образцам, предпочтительней - 25%, и наиболее предпочтительно - 100% и более. Желательно, чтобы олигонуклеотид, который используют в способе согласно настоящему изобретению, содержал от 8 до 30 нуклеотидов. В конкретных примерах осуществления изобретения, по меньшей мере восемь последовательных нуклеотидов относятся к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289, 300-490. Олигонуклеотид согласно настоящему изобретению может также дополнительно содержать, например, 20, 40, 60, 85, 120 или более последовательных нуклеотидов, комплементарных полинуклеотиду, кодирующему полипептид IAP. Олигонуклеотид (или его фрагмент) может содержать измененный (модифицированный) полипептидный остов. Известны фосфоротиоатные, фосфородитиоатные и другие модифицированные остовы. Олигонуклеотид может также содержать одну или несколько искусственных связей.

Под «пациентом» подразумевается любое животное (в том числе и человек). К числу животных, которые могут подвергаться лечению с использованием способов, комплектов и составов, описанных в настоящем изобретении, относятся лошади, собаки, кошки, свиньи, козы, кролики, хомяки, обезьяны, морские свинки, крысы, мыши, ящерицы, змеи, овцы, крупный рогатый скот, рыбы и птицы.

Под «химиотерапевтическим препаратом» подразумевается препарат, который убивает раковые клетки или замедляет их рост. Соответственно, химиотерапевтическими препаратами считаются как цитотоксические, так и цитостатические препараты. Типичными химиотерапевтическими препаратами являются таксаны (например, паклитаксель, доксетаксель, RPR 109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, BMS-275183, BRT 216, DJ-927, MAC-321, IDN5109 и IDN5390), алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин, винфлунин, винорелбин и ангидровинбластин), доластины (доластин-10, доластин-15, ILX651, TZT-1027, симплостатин 1, симплостатин 3 и LU103793), криптофицины (например, эпотилон А, эпотилон В, дезоксиэпотилон В и эпотилон В пактам), элеутеробин, дискодермолид, 2-эпидискодермолид, 2-десметилдисеодермолид, 5-гидроксиметилдискодермолид, 19-десаминокарбонилдискодермолид, 9(13)-циклодискодермолид и лаулималид. Другие препараты приведены в Таблице 1.

Под «модулятором биологического ответа» подразумевается препарат, который стимулирует или восстанавливает способность иммунной системы сопротивляться болезни. Некоторые (но не все) препараты, модулирующие биологический ответ, способны замедлять рост опухолевых клеток и поэтому также относятся к химиотерапевтическим препаратам. Примерами препаратов, модулирующих биологический ответ, являются интерфероны (альфа, бета, гамма), интерлейкин-2, ритуксимаб и трастузумаб.

Под «химиосенсибилизатором» подразумевается препарат, который делает опухолевые клетки более чувствительными к воздействию химиотерапевтических препаратов.

Под «лимфопролиферативным заболеванием» подразумевается заболевание, при котором имеет место патологическая пролиферация клеток лимфатической системы (например, Т-клеток и В-клеток)

Под «рибозимом» подразумевается РНК, которая обладает ферментативной активностью, обладающая специфичностью и способностью к расщеплению молекулы РНК-мишени. Рибозимы можно использовать для снижения экспрессии полипептида. Способы использования рибозимов для снижения экспрессии полипептидов описаны, например, у Turner et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 465: 293-301,2000) и Norris et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 465: 293-301, 2000).

Под «репортерным геном» подразумевается ген, кодирующий полипептид, экспрессия которого может быть оценена. Такие полипептиды включают, помимо прочего, глюкуронидазу, люциферазу, хлорамфеникол трансацетилазу и бета-галактозидазу.

Под «промотором» подразумевается полинуклеотид, контролирующий транскрипцию.

«Функционально связанный» означает, что первый нуклеотид непосредственно примыкает ко второму полинуклеотиду, контролирующему транскрипцию первого, если при этом со вторым нуклеотидом связаны соответствующие молекулы (например, белки - активаторы транскрипции).

Другие особенности и преимущества изобретения будут представлены в описании модификаций и формуле изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1A-1L представляют собой диаграммы, показывающие действие антисмыслового олигонуклеотида XIAP на экспрессию белка XIAP по отношению к общему содержанию белка (тотальному белку) (Фиг.1А, 1C, 1Е, 1G, 1I и 1К). На фиг.1В, 1D, 1F, 1Н, 1J и 1L приведены значения концентрации тотального белка для каждой трансфекции нуклеотидом по сравнению с результатами контрольной трансфекции без нуклеотида, проводившейся с целью стандартизации результатов для вышеописанного белка XIAP.

На Фиг.2F-2C представлены диаграммы, показывающие влияние различных антисмысловых XIAP олигонуклеотидов, применявшихся по отдельности или в комбинации, на (количество) РНК XIAP (Фиг.2А) и белок (Фиг.2В). На Фиг.2С представлена диаграмма значений концентрации тотального белка для каждой трансфекции олигонуклеотида по сравнению с результатами контрольной трансфекции, использовавшихся для стандартизации результатов белка XIAP, показанных на Фиг.2В.

На Фиг.3 и 4 представлены диаграммы, показывающие действие смеси 4Х4 олигонуклеотидов остова (mixed backbone nucleotides, MBO) FG8 или Е12 в концентрации 31 нМ (Фиг.3) или 63 нМ (Фиг.4). Клетки рака легких линии Н460 подвергали трансфекции на протяжении 18 часов в течение одного, двух или трех дней олигонуклеотидами MBO в концентрации 125 нМ и Липофектамином 2000. В определенное время производили отбор образцов для вестерн-блот анализа. Производили сканирующую денситометрию, после чего уровни белка XIAP стандартизировали до значений GAPDH и сравнивали с контрольной группой трансфекции, принятой за 100%. Указанные значения в процентах выражают % нокдауна белка XIAP по отношению к специфичным контрольным обработкой смесью нуклеотидов (scrambled control).

На Фиг.5A-5D представлены графики, отражающие влияние антисмыслового олигонуклеотида XIAP на жизнеспособность клетки (Фиг.5А, 5С и 5D) и химиосенсибилизацию в присутствии адриамицина (Фиг.5В).

На Фиг.6 представлена диаграмма, показывающая олигонуклеотид - опосредованную специфичную понижающую регуляцию (снижение уровня) ХIАР мРНК в клетках 1-1460 in vitro. На чертеже изображены уровни ХIАР мРНК в клетках Н640, на которые воздействовали только Липофектамином 2000 (LFA) или Липофектамином 2000 в комбинации с 1,2 ηМ олигонуклеотидов F3, G4, С5, АВ6, DE4 или D7, или соответствующие контрольные трансфекции олигонукелотидами обратной полярности (RP) или смесью олигонуклеотидов (Scrambled control, SC). На протяжение 6 часов трансфекции производилась в режиме реального времени оценка относительного количества XIAP мРНК с помощью RT-PCR. Все данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение (SD) троекратных измерений, произведенных в ходе репрезентативного эксперимента. Уровень XIAP мРНК клеток, не подвергавшихся никакому воздействию (контрольная группа) определяли в идентичных экспериментальных условиях и принимали за 1.

На Фиг.7 представлена диаграмма, показывающая уровень XIAP РНК в клетках Н460 после трансфекции их различными PS-XIAP олигонуклеотидами. Клетки рака легких человека линии Н460 подвергали трансфекции 1 микро Моль PS-олигонуклеотида и Липофектамином 2000 в течение 6 часов. После этого осуществляли сбор клеток для анализа способом Takman.

На Фиг.8 представлена диаграмма, показывающая уровень XIAP РНК в клетках Н460 через 9 часов после трансфекции 4Х4 олигонуклеотидами MOB. Клетки Н460 подвергали трансфекции 4Х4 олигонуклеотидами MOB (от 62,5 нМ до 1 µМ) и Липофектамином 2000 в течение 9 часов. После этого осуществляли сбор клеток анализа способом Takman.

На Фиг.9 представлена диаграмма, показывающая нокдаун белка XIAP в клетках Н460 через 24 часа после трансфекции 4Х4 МВО. Клетки Н460 в течение 24 часов подвергали трансфекции 4Х4 МВО в концентрации 1 µМ и Липофектимином 2000. После этого осуществляли сбор клеток для анализа способом вестерн-блота. Клетки подвергали сканирующей денситометрии, уровни белка XIAP стандартизировали по уровню актина и сравнивали со специфичными контрольными трансфекциями олигонуклеотидами (sm, rm), значения в которых принимались за 100%.

Фиг.10А и 10В представляют собой схематические иллюстрации, изображающие специфическую понижающую регуляцию (снижение уровня) белках XIAP в клетках Н460 in vitro, опосредованную антисенс-олигонуклеотидами. На схеме показаны уровни белка XIAP в клетках Н460, на которые воздействовали только Липофектамином 2000 (LFA) либо Липофектамином 2000 в сочетании с F3, G4, или С5 XIAP олигонуклеотидами в концентрации 1,2 µМ, или при соответствующих контрольных трансфекциях (RP, SC). Уровни белка XIAP анализировали с помощью вестерн-блот анализа (Фиг.10А), количество белка определяли с денситометрии (Фиг.10В). Значения уровней XIAP стандартизировали по уровню клеточного актина и сравнивали с уровнем контрольной группы (CNT).

Фиг.11А и 11В представляют собой схематические иллюстрации, показывающие влияние олигонуклеотидов XIAP на активацию каспаз. Показано действие XIAP-олигонуклеотидов F3, G4, или С5 или соответствующих им RP и SC ODN контрольных образцов в концентрации 1,2 µМ, на экспрессию прокаспазы-3, PARP (как полноразмерной - 116 кДа, так и процессированной - 85 кДа)) (Фиг.11А) и на уровни белков Bcl 2 и Вах (Фиг.11В) в клетках Н460, подвергшихся трансфекции по сравнению с контрольными образцами. Экспрессия белков оценивалась с помощью вестерн-блот анализа. Уровни белков Bcl 2 и Вах стандартизировали по уровню клеточного актина и производили их количественную оценку с помощью денситометрии. Соотношение Bcl 2/Bax представлено в виде средней величины двух или трех независимых экспериментов, причем это соотношение в контрольных образцах клеток (CNT) принималось за 1.

На Фиг.12А и 12В представлены схематические иллюстрации, показывающие специфическую индукцию апоптоза XIAP-олигонуклеотидами. Индукцию апоптоза определяли в клетках Н460, которые подвергали воздействию AS олигонуклеотида XIAP G4, в концентрации 1,2 µМ, SC олигонуклеотида G4 или в необработанных контрольных образцах (CNT). На Фиг.12 показан процент клеток с суб-G0/G1 (апоптозным) содержанием ДНК при анализе с помощью окрашивания пропидия йодидом (РI) и проточной цитометрии. На Фиг.12В показана морфология ядра клеток Н460, при окраске DAPI, после обработки олигонуклеотидами. Стрелки указывают на клетки, имеющие характерную апоптическую морфологию в виде коденсации или фрагментации ядерной ДНК.

На Фиг.13А представлена диаграмма, показывающая влияние обработки AS XIAP - олигонуклеотидом G4 на жизнеспособность клеток Н640. Клетки подвергали воздействию LFA или комплексов LFA-олигонуклеотид с AS или SC олигонуклеотидами G4 в возрастающих концентрациях, после чего спустя 24 часа после воздействия производили оценку жизнеспособности клеток анализом МТТ. Данные представляют собой среднее арифметическое ± SD трех независимых экспериментов.

На Фиг.13В представлена диаграмма, показывающая процент мертвых клеток Н460 после воздействия на них LFA и комплексов с AS или SC олигонуклеотидами G4 в количестве 0,4 µМ в присутствии или отсутствии доксорубицина (DOX), таксола, винорельбина (VNВ) или этопозида (Etop), который определяли способом МТТ. Данные представляют собой среднее арифметическое ± SD трех независимых экспериментов.

На Фиг.14 представлена диаграмма, показывающая относительный рост опухоли Н460 у мышей, получавших ASXIAP 2×2 МВО в сочетании с винорельбином. Производили внутриопухолевое введение олигонуклеотида в 50 опухолевых масс у мышей с подкожными ксенотрансплантатами клеток Н460. Данное лечение сочетали с введением винорельбина.

На Фиг.15 представлена диаграмма, показывающая средний размер Н460 опухолей у мышей, систематически получавших AS PS-олигонуклеотиды XIAP. Систематическое ведение AS PS-олигонуклеотидов XIAP мышам SCID-RAG2 с подкожными ксенотрансплантатами клеток Н460 привело к сокращению размера опухолей по сравнению с контрольной группой.

На Фиг.16 представлена диаграмма, показывающая размер опухоли, образованной клетками MDA-MB-435/LCC6 рака молочной железы человека (LCC-клетки) у мышей, систематически получавших AS PS-олигонуклеотиды XIAP. Систематическое введение (и.п.) AS PS-олигонуклеотидов XIAP самкам мышей SCID-RAG2 с ксеноимплантатом LCC-клеток в грудных жировых складках привело к уменьшению размера опухолей по сравнению с контрольной группой.

На Фиг.17 представлена схематическая иллюстрация, показывающая влияние олигонуклеотидов G4 на рост опухоли и уровень белка XIAP в опухоли in vivo. Было обнаружено противоопухолевое действие систематически вводимых, чистых AS или SC G4 нуклеотидов XIAP на рост подкожных ксенотрансплантатов клеток Н460 у самцов мышей SCID-RAG2. Все данные представлены в виде среднего арифметического ± SEM (n=6 мышей/группу).

На Фиг.18А и 18В представлены схематические иллюстрации, показывающие уровни экспрессии белка XIAP в ксенотрансплантатах опухоли Н460 у мышей SCID-RAG2 после 21-дневного ведения AS или SC олигонуклеотидов С4 или только носителя (контроль), которые анализировали с помощью вестерн-блотов и количественно определяли с помощью денситометрии. Затем уровень XIAP стандартизировали по уровню клеточного актина. Все данные представлены в виде среднего арифметического ± SD (n=3).

На Фиг.19А и 19В представлены микрофотографии, показывающие действие in vivo олигонуклеотидов G4 на гистопатологию опухоли Н460, имплантированной мышам SCID-RAG2, через 21 день после системного введения им AS или SC G4 олигонуклеотидов XIAP в дозе 15 мг/кг. На Фиг.19А изображены срезы опухоли, окрашенные гематоксилином и эозином. На Фиг.19В показана иммуногистохимия экспрессии убиквитина в срезах опухоли. Представлены репрезентативные микрофо