Клетки легких хлопковых крыс для культивирования вирусов

Клетки легких хлопковых крыс для культивирования вирусов

Реферат

Релевантные заявки/включение для сведения

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №60/366014, поданной 20 марта 2002 г., включенной сюда в виде ссылки. Вышеупомянутая заявка и все документы, цитированные здесь или во время ее выполнения («приложенные цитированные документы»), и все документы, цитированные или упомянутые в приложенных цитированных документах, и все документы, цитированные или упомянутые здесь («цитированные здесь документы»), и все документы, цитированные или упомянутые в цитированных здесь документах, наряду с инструкциями, описаниями, техническими условиями продуктов и вкладышами для любых продуктов изготовителей, упомянутые здесь или в любом документе, включенном здесь для сведения, включены здесь для сведения и могут быть использованы в практике изобретения.

Область изобретения

Данное изобретение относится к новой клеточной линии и ее применениям, включая новый способ получения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вируса, вызывающего заболевание свиней, известное как репродуктивный и респираторный синдром свиней (РRRS).

В более общем смысле изобретение относится к размножению микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению (например, депонированных клеток или клеточной линии, или клеток, или клеточной линии, обладающих всеми их отличительными свойствами) для получения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие как микроорганизмы или патогены, например, вирусы, для которых обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, или РНК-вирусы, например, одноцепочные с «плюс»-цепью РНК-вирусы, например, вирусы порядка Nidovirales, например, артевирусы или вирусы семейства Arteriviridae, например, вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус инфекционного артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и вирус PRRS (переносчиками которого, как правило, являются членистоногие), вирусы семейства Coronaviridaе, например, коронавирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов (также вирусы, переносчиками которых, как правило, являются членистоногие) и торовирусы, такие как торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота.

Вирусы, преимущественно размножающиеся с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, включают вирус парагриппа собак (CPI), например, CPI типа 2 (CPI-2), аденовирус, такой как аденовирус собак (CAV), например, аденовирус собак типа 2 (CAV-2), аденовирус свиней (PAV), например, аденовирус свиней типа 3 (PAV-3) и типа 5, герпесвирус крупного рогатого скота, например, герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (является возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR)), герпесвирус лошадей (EHV), например, типа 1 (EHV-1) или типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (PI-3), кишечный и респираторный коронавирус крупного рогатого скота (BCV), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).

Более предпочтительно вирус представляет собой вирус PRRS.

В более предпочтительных воплощениях клетки легких хлопковых крыс или клеточная линия представляют таковую, депонированную в АТСС как РТА-3930, или клетки легких, или клеточную линию, обладающую всеми отличительными свойствами АТСС РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, полученную культивированием клеток легких хлопковых крыс, по меньшей мере, в течение 10, например, по меньшей мере, в течение 21 или 76, или 100 пассажей, например, 10 или более, или 21 или более, или 76, или более пассажей, например, по меньшей мере, в течение 10 или 21, или 76 пассажей и преимущественно до (и включая) 100 пассажей и получение такой клеточной линии, в которой клетки легких хлопковых крыс, в основном, являются эпителиальными клетками, и морфологические характеристики сохраняются при пассажах.

Следовательно, изобретение относится к подобным клеткам или клеточной линии, а также ко всем их применениям.

Вирусы, размноженные с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, пригодны для получения иммуногенных композиций и вакцин против заболеваний, вызванных вирусами, такими как PRRSV. Аналогичным образом, микроорганизмы или другие патогены, культивированные с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, пригодны для получения иммуногенных и вакцинных композиций против других патогенов или микроорганизмов.

Также изобретение относится к применению вирусов, выращенных пассажами в клетках по изобретению, например, для получения аттенуированных, инактивированных и субъединичных иммуногенных композиций и вакцин; и таким образом, изобретение относится к подобным аттенуированным, инактивированным и субъединичным иммуногенным композициям и вакцинам.

Уровень техники

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS) впервые был описан в Северной Каролине (США) в 1987 г. В то время данное заболевание свиней называли «загадочным» заболеванием свиней или MSD, позднее оно стало известно как «синдром бесплодия и респираторных расстройств у свиней» или SIRS. Затем, в 1990 г., оно появилось в Центральной Европе. В начале его называли в Европе «синдромом эпидемических абортов и респираторных расстройств» или PEARS, и наконец «репродуктивным и респираторным синдромом свиней» или PRRS, которое стало общепринятым названием в мире.

Вирус PRRS представляет собой покрытый оболочкой вирус с одноцепочечной РНК, впервые был выделен в Нидерландах и назван вирусом Лелистада. Его отнесли к семейству Arteriviridaе. Вирусы семейства Arteriviridaе входят в порядок Nidovirales. Другими вирусами в порядке Nidovirales являются вирусы семейства Coronaviridae, такие как коронавирусы и торовирусы.

Вирус PRRS был описан в заявке WO 92/21375. Изолят был депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) в Институте Пастера, Париж, Франция, под инвентарным номером I-1102. Был также выделен североамериканский тип (WO 93/03760), и вирус был помещен на хранение в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под инвентарным номером VR-2332.

У свиней заболевание PRRS характеризуется нарушениями со стороны репродуктивной системы и респираторными симптомами. Клетками-мишенями для вируса PRRS являются макрофаги.

Одной из проблем, затрудняющих получение иммунологических продуктов против вируса PRRS, является ограниченная доступность стабильных субстратов для репликации вируса.

Вирус PRRS может размножаться только на альвеолярных макрофагах (РАМ) свиней (Wensvoort G. et al., in The Vet. Quart. 13:121-130, 1991). Необходимость использования здоровых свиней определенного возраста для получения данных макрофагов имеет несколько недостатков. Кроме того, чувствительность к заражению вирусом не гарантирована у выделенных РАМ, поскольку клеточные субстраты, полученные от различных животных, всегда очень вариабельны. Это создает основной недостаток при получении партий антигена постоянного и однородного качества, и каждую партию необходимо оценивать для определения ее чувствительности.

Проводились исследования с целью поиска других клеточных субстратов. Так, в патенте США №5476778 тестировали 15 клеточных линий, полученных от других видов животных (например, крупного рогатого скота, собак, кошек, человека, свиней, обезьян) и из других тканей (например, почек, легких, семенников) для культивирования вируса PRRS. Только на одном типе (клетки МА-104) из 15 клеточных линий имел место рост вируса PRRS.

Линии клеток почек обезьян (например, VERO, MA-104, MARC-145, см. соответственно патент США №5476778 и заявку WO 98/00165) используют для культивирования и аттенуирования вируса PRRS. Но титры вируса PRRS на данных клетках являются низкими и, следовательно, стоимость получения - высокой.

Несмотря на то, что в настоящее время инактивированные и аттенуированные вакцины против PRRS являются промышленно доступными, было бы очень важным иметь альтернативные клеточные субстраты для получения вируса PRRS, например, для производства вакцин или иммуногенных композиций. И в более общем смысле является очень важным иметь альтернативные клеточные субстраты для получения патогенов, таких как вирусы, например, РНК-вирусы, например, одноцепочечные с «плюс»-цепью РНК-вирусы, такие как вирусы порядка Nidovirales, такие как артевирусы, или вирусы семейства Arteriviridaе, и вирусы семейства Coronaviridae, например, для получения вакцин или иммуногенных композиций.

Кроме того, было бы предпочтительно обеспечить новую линию клеток легких хлопковых крыс.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основано на установлении того факта, что, несмотря на то, что грызуны не являются естественными хозяевами вируса PRRS, вирус PRRS растет или размножается в клетках легких хлопковых крыс. Кроме того, была получена и депонирована новая клеточная линия, произведенная из тканей легких хлопковых крыс.

Настоящее изобретение также основано на установлении того факта, что другие вирусы также растут и размножаются в клетках легких хлопковых крыс, такие вирусы, которые не являются природными патогенами грызунов. Данные вирусы включают вирус парагриппа собак типа 2 (CPI-2), аденовирус собак типа 2 (CАV-2), герпесвирус лошадей типа 1 (EHV-1), герпесвирус лошадей типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV) и коронавирус крупного рогатого скота (BCV).

В более общем смысле настоящее изобретение включает применение клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению для размножения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие вирусы, для которых обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, или вирусы порядка Nidovirales, например, артевирусы или вирусы семейства Arteriviridaе, например, вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус инфекционного артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и вирус PRRS (переносчиками которого, как правило, являются членистоногие), вирусы семейства Coronaviridaе, например, коронавирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов (также вирусы, переносчиками которых, как правило, являются членистоногие) и торовирусы, такие как торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота.

Вирусы, преимущественно размножающиеся с использованием линии клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, включают вирус парагриппа собак (CPI), например, CPI типа 2 (CPI-2), аденовирус, такой как аденовирус собак (CAV), например, аденовирус собак типа 2 (CAV-2), аденовирус свиней (PAV), например, аденовирус свиней типа 3 и (PAV-3), герпесвирус крупного рогатого скота, например, герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (является возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR)), герпесвирус лошадей (EHV), например, типа 1 (EHV-1) или типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (PI-3 или bPI-3), коронавирус крупного рогатого скота (BCV) и вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Более предпочтительно вирус представляет вирус PRRS. Следовательно, изобретение относится к размножению, или культивированию, или выращиванию данных вирусов.

Некоторые вирусы могут расти в клетках легких хлопковых крыс, такие как герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (BHV-1) (см. Papp Z. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2933-2943, например, p.2935), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (bPI-3) (см. Breker-Klassen M.M. et al., J. Virol., 1995, 69 (7), 4308-4315) и аденовирус свиней типа 3 (PAV-3) (см. заявку РСТ на патент WO-А3-99/53047). Однако в данных документах не описывается или не предлагается применение подобных клеток и вирусов, культивированных в них, для получения инактивированных, аттенуированных и субъединичных иммуногенных композиций или вакцин и их введение животным, и способы иммунизации или вакцинации.

Изобретение также включает клетки легких хлопковых крыс или клеточную линию, депонированную в АТСС как РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, обладающую всеми отличительными свойствами АТСС РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, полученную культивированием клеток легких хлопковых крыс, по меньшей мере, в течение 10, или 21, или 76 пассажей, например, 10 или более, или 21 или более, или 76, или более пассажей, например, по меньшей мере, в течение 10 или 21, или 76 пассажей и предпочтительно до и включая 100 пассажей и получение такой клеточной линии, в которой клетки легких хлопковых крыс, в основном, являются эпителиальными клетками, и морфологические характеристики сохраняются при пассажах.

Преимущественно настоящее изобретение включает применение клеток легких хлопковых крыс (клеток CRL), например, клеточных линий, полученных из данных клеток, для размножения вирулентного или аттенуированного вируса PRRS.

Преимущественно настоящее изобретение также включает применение клеток CRL, например, клеток или клеточных линий, полученных из данных клеток, таких как клетки или клеточные линии по изобретению (например, депонированные клеточные линии или клетки, обладающие их свойствами), для размножения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие как CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования или размножения вируса, такого как PRRSV, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV, LDV, EAV, SHFV, вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота, включающий контактирование вируса с клетками легких хлопковых крыс в условиях, подходящих для культивирования или размножения. Способ может дополнительно включать сбор полученного вируса. Для получения иммуногенной или иммунологической, или вакцинной композиции вирус необязательно можно инактивировать и/или он может включать белок(белки) или антиген(ы), или эпитоп(ы), выделенные из них (для инактивированных или субъединичных композиций), и вирус или субъединицу можно смешать с подходящим носителем или разбавителем, и/или адъювантом, например, подходящим для ветеринарии или фармацевтически приемлемым носителем, или разбавителем, и/или адъювантом.

Термины «иммуногенная композиция» и «иммунологическая композиция», и «иммуногенная или иммунологическая композиция» включают любую композицию, которая вызывает иммунный ответ против патогена-мишени; например, после введения или инъекции животному (такому, как свинья) стимулируется иммунный ответ против патогена-мишени (например, PRRS). Термины «вакцинная композиция» и «вакцина», и «вакцинная композиция» включают любую композицию, которая индуцирует защитный иммунный ответ против патогена-мишени или которая эффективно защищает от патогена; например, после введения или инъекции животному (например, свинье) развивается защитная иммунная реакция против патогена-мишени или обеспечивается эффективная защита от патогена (например, PRRS). Субъединица патогена, например вируса, представляет собой антиген или иммуноген, или эпитоп, выделенные из патогена, например вируса; и субъединичная композиция включает или состоит в основном из одного или более антигенов, иммуногенов или эпитопов, выделенных из патогена, например вируса.

Настоящее изобретение также обеспечивает культуры микроорганизма или патогена, например вируса, такого вируса, для которого обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, например, такого, как PRRSV, LDV, EAV, SHFV, вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV, преимущественно вирус PRRS, CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV, полученных в результате культивирования или размножения в клетках легких хлопковых крыс или клетках, или клеточной линии по изобретению, например, инактивированные, аттенуированные и субъединичные культуры или препараты.

Подобные культуры отличаются от предшествующих культур, поскольку они могут не содержать загрязняющих веществ из культур, полученных в других клетках, и могут иметь другие титры по сравнению с культурами, полученными в других клетках. Например, если вновь вернуться к вирусу PRRS, полученному в свиных клетках, то данные культуры содержат загрязняющие вещества из свиных клеток, в то время как PRRSV, культивированный в клетках CRL, не содержит загрязняющих веществ, обнаруживаемых в свиных клетках. Данный анализ можно распространить на культуры PRRSV и других вирусов, культивированных в других клетках, которые использовались для размножения PRRSV и других вирусов, по сравнению с культурами вирусов, полученными в клетках CRL по настоящему изобретению, в результате чего становится очевидным, что культуры по настоящему изобретению отличаются от культур предшествующего уровня техники.

Настоящее изобретение также включает иммуногенные композиции и вакцины против PRRS или против PRRSV, которые можно получить из культуры вируса PRRS по изобретению, преимущественно живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины и субъединичные иммуногенные композиции и вакцины.

Настоящее изобретение также включает иммуногенные композиции и вакцины против других патогенов или микроорганизмов, культивированных и размноженных в клетках CRL или клеточной линии, или клетках по изобретению, например, живые, аттенуированные, инактивированные или субъединичные композиции или вакцины. Данные иммуногенные композиции или вакцины могут быть против любого микроорганизма или патогена, или вируса, выращенного, культивированного, размноженного или тому подобное, в клетках CRL или клеточной линии, или клетках по изобретению, например, это иммуногенные или вакцинные композиции против любого из упомянутых здесь вирусов или микроорганизмов, или патогенов, таких как CPI-2, CAV-2, ВHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV.

Изобретение включает наборы, содержащие клетки и вирус, или микроорганизм, или патоген для культивирования в них, предпочтительно в отдельных контейнерах и еще более предпочтительно, когда отдельные контейнеры находятся в одной упаковке, и набор необязательно содержит инструкции для культивирования, выращивания, содержания клеток и/или вируса с инструкциями, необязательно включающими инструкции для сбора и/или инактивации вируса, и/или выделения субъединичного антигена или иммуногена, или эпитопа.

Изобретение дополнительно включает комбинированные композиции, например, композиции, содержащие одну или более вакцин, или иммуногенных композиций по изобретению, или вакцину, или иммуногенную композицию по изобретению в комбинации с другой вакцинной или иммунногенной композицией, или активным компонентом (например, инактивированным или аттенуированным вирусом, или патогеном, или микроорганизмом, или их субъединичным антигеном, или иммуногеном, или белком, или эпитопом).

Таким образом, изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания свиней, содержащие смесь культур вирусов PRRS и PAV-3 по изобретению, такие как живые, аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. PAV-3 может также представлять собой рекомбинантный PAV-3, который содержит одну или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и экспрессирующие один или более чужеродный или гетерологичный, или экзогенный иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы) (чужеродный, гетерологичный или экзогенный по отношению к аденовирусу). В заявках WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737 и WO 00/47756 приводятся примеры рекомбинантных аденовирусов свиней, которые можно использовать в практике изобретения.

Другим примером является то, что изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания собак, содержащие смесь культур вирусов CPI-2 и CAV-2 по изобретению, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. CAV-2 также может представлять собой рекомбинантный СAV-2, который содержит одну или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и экспрессирующие один или более чужеродный или гетерологичный, или экзогенный иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы) (чужеродный, гетерологичный или экзогенный по отношению к аденовирусу). В патенте США №6090393 приводятся примеры аденовирусов собак, которые можно использовать в практике изобретения.

Дополнительным примером является то, что изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух или, по меньшей мере, трех, или всех четырех вирусных культур по изобретению, включая BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV, например, BHV-1+BRV, BHV-1+BRV+bPI-3, BHV-1+BRV+bPI-3+BCV, BRV+bPI-3, BRV+bPI-3+BCV, bPI-3+BCV, BHV+bP-3, BHV+bPI-3+BCV, BHV-1+BCV, BRV+BCV, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. Иммуногенные композиции и вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух культур вирусов по изобретению, включая BHV-1 и bPI-3, и иммуногенные композиции и вакцины против кишечного заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух культур вирусов по изобретению, включая BCV и BRV, являются предпочтительными.

Еще одним дополнительным примером комбинированных композиций по изобретению являются иммуногенные композиции и вакцины против заболевания лошадей, содержащие смесь культур вирусов EHV-1 и EHV-4 по изобретению, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины.

Изобретение включает получение подобных комбинированных композиций, например, смешением активных компонентов, преимущественно вместе с носителем или разбавителем, и/или адъювантом.

Изобретение также включает набор для получения комбинированных иммуногенных и вакцинных композиций по изобретению, например, набор, содержащий (а) микроорганизм, патоген или вирус, или их антиген, или эпитоп (предпочтительно вирус, упомянутый здесь) и (b) микроорганизм, патоген или вирус, или их антиген, или эпитоп (преимущественно вирус или его иммуноген, антиген или эпитоп, но также включаются другие микроорганизмы, упомянутые здесь), который отличается от (а), в отдельных контейнерах, необязательно в одной упаковке и необязательно с инструкциями для смешивания и/или введения.

Изобретение дополнительно включает способы индукции иммунного ответа введением хозяину, такому как хозяину, предрасположенному к заболеванию, вызываемого патогеном или микроорганизмом, или вирусом, полученным в клетках легких хлопковых крыс или клеточной линии, например, клетках легких хлопковых крыс или клеточной линии по изобретению, например, вирусом, упомянутым здесь, иммуногенной или вакцинной композиции по изобретению, содержащей подобный инактивированный, или аттенуированный патоген или микроорганизм, или вирус, или их антиген, или иммуноген, или эпитоп в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или индукции иммунного ответа против заболевания PRRS или против вируса с использованием иммуногенной композиции и/или вакцины по изобретению, например, введением иммуногенной или вакцинной композиции хозяину, например, свинье, в количестве, достаточном для индукции соответствующего иммунного ответа. И изобретение дополнительно обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или индукции иммунного ответа против заболевания CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, или против вирусов, с использованием иммуногенной композиции и/или вакцины по изобретению, введением иммуногенной или вакцинной композиции хозяину, например, естественному хозяину вируса, в количестве, достаточном для индукции соответствующего иммунного ответа.

Настоящее изобретение, например, когда используются смешанные или комбинированные композиции, включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у животного-хозяина против двух или более различных антигенов, эпитопов или патогенов, или микроорганизмов, или вирусов, такого как у свиньи, против PRRS и PAV-3, включающие введение эффективного количества для стимуляции ответа на иммунную композицию(и) и/или вакцину(ы) по изобретению. (Множественное число используют, поскольку способ можно также осуществлять на практике последовательным введением композиций или вакцин по изобретению.) Аналогичным образом в качестве дополнительного примера изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у собаки против заболевания CPI-2 и CAV-2 или против вирусов, с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Аналогично изобретение обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота, по меньшей мере, против двух или, по меньшей мере, трех, или, по меньшей мере, четырех заболеваний крупного рогатого скота или против вирусов с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Дополнительно изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота против заболевания BHV-1 и bPI-3 или против вирусов, с использованием или введением иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Изобретение также включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота против заболевания BCV и BRV или против вирусов, с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. И изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у лошадей против заболевания EHV-1 и ЕHV-4 или против вирусов с использованием или введением иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению.

Необходимо отметить, что в данном описании и, в частности, в формуле изобретения термины, такие как «содержит», «содержащийся», «содержащий» и тому подобное могут иметь значение, относящееся к таковому в патентном законе США, например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное, и термины, такие как «в основном состоящий из» и «состоит в основном из» имеют значения, определенные в патентном законе США, например, они позволяют неточно цитировать элементы, но исключают элементы, которые имеются в предшествующем уровне техники или влияют на основные или новые свойства изобретения.

Эти и другие воплощения раскрыты здесь или являются очевидными из сути следующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Заявители разработали способ получения или размножения вирусов, в котором используются клетки легких хлопковых крыс, а также новую клеточную линию, и способ размножения или получения, или культивирования, или выращивания микроорганизмов, или патогенов, или вирусов в подобных клетках.

Легкие извлекают из хлопковых крыс и подвергают ферментативному расщеплению (например, под действием трипсина и/или коллагеназы). Собирают супернатант, содержащий разделенные клетки, и культивируют, например, в виде монослоя или в суспензии. Предпочтительно клетки культивируют в виде монослоя, например, на минимальной поддерживающей среде (МЕМ) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (FBS) и/или лактальбумина гидрозилата (LAH). Преимущественно культуральная среда может содержать антибиотики, например, гентамицин, стрептомицин и/или пенициллин.

Вирус PRRS культивируют в подобной культуре клеток легких. Вирусы PAV-3, CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV также можно культивировать в подобной культуре клеток легких.

Клеточную культуру предпочтительно получают в результате нескольких пассажей данных клеток. Преимущественно в результате пассажей данных клеток можно получить клеточные линии, которые пригодны, например, для размножения вируса PRRS. Например, клетки можно подвергнуть, по меньшей мере, 10 пассажам, например, от 10 до 100 пассажей. Предпочтительно данные клеточные линии длительно сохраняют жизнеспособность при отсутствии фетальной телячьей сыворотки (FВS), хотя для получения монослоя необходимо некоторое количество FBS или другого подходящего фактора роста клеток.

Другим преимуществом культуры клеток CRL по настоящему изобретению является то, что культура клеток может существовать, по меньшей мере, в течение месяца в виде жизнеспособного монослоя или суспензии без необходимости в замещении израсходованной среды или дополнительном добавлении питательных веществ. Эта прочность обеспечивает преимущество многократного получения вируса из одной и той же культуры клеток без необходимости в стартовом периоде (приживании культуры) и без истощения маточной культуры клеток.

Таким образом, можно получать высокий выход вируса из одной и той же клеточной культуры. В одном воплощении процесс культивирования включает два или более сбора вируса с или без повторного посева вируса и/или добавления свежей культуральной среды. Предпочтительно, чтобы после каждого сбора в клеточную культуру добавляли свежую культуральную среду.

Следуя данному способу, клетки легких хлопковых крыс культивируют до 76 пассажей и получают в виде клеточной линии. Данные клетки легких хлопковых крыс в основном представляют собой эпителиальные клетки, и их морфологические характеристики сохраняются во время пассажей. Пассаж 21 был депонирован 18 декабря 2001 г. по условиям Будапештского соглашения в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, под инвентарным номером АТСС РТА-3930.

При воплощении настоящее изобретение включает применение эпителиальных клеток легких хлопковых крыс, линий эпителиальных клеток, полученных из них, таких как клеточная линия РТА-3930, или клеточная линия, обладающая ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса PRRS. В дополнительных воплощениях настоящее изобретение включает применение эпителиальных клеток легких хлопковых крыс, линий эпителиальных клеток, полученных из них, таких как клеточная линия РТА-3930 или клеточная линия, обладающая ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV. В дополнительных воплощениях настоящее изобретение включает применение клеточной линии РТА-3930 или клеточной линии, обладающей ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса BHV-1 или bPI-3. Клеточную линию или клеточную линию, обладающую ее отличительными свойствами, можно также использовать в отношении других упомянутых здесь вирусов.

Таким образом, другим аспектом изобретения является способ получения вируса PRRS, включающий культивирование вируса PRRS в культуре клеток легких хлопковых крыс, содержащей эпителиальные клетки, предпочтительно в линии клеток легких хлопковых крыс. Например, вирус получают в клеточной линии РТА-3930 или клеточной линии, имеющей ее отличительные свойства. Данный способ получения вирусов можно также использовать в отношении вирусов CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, а также других упомянутых здесь вирусов.

Вирус может представлять собой вирулентный вирус или аттенуированный вирус.

Получение вируса включает стадии посева и культивирования вируса на данных клетках. Перед посевом клетки по изобретению можно подрастить в подходящей культуральной среде, например среде МЕМ с добавлением FBS или другого подходящего фактора роста клеток. Культивирование клеток предпочтительно проводят при температуре в пределах от 35 до 39°С, предпочтительно примерно при 37°С. Преимущественно клеточная культура является монослоем. Альтернативно клеточная культура представляет собой суспензию. В основном вирус высевают, когда клетки в монослое выращены до слияния. Внеклеточный вирус можно непосредственно выделить из супернатанта. Внутриклеточный вирус можно выделить после соответствующего разрушения клеток, например, замораживанием/оттаиванием или обработкой ультразвуком. В случае клеточных культур в суспензии вирус можно выделить, например, после фильтрования фильтрата. Вирус можно выделить через 2-15 суток, например, через 3-7 суток, более предпочтительно через 5-7 суток после посева. Выделение вируса проводят способами, хорошо известными специалистам в данной области, касающимися получения вирусов. На данной стадии получают неочищенную вирусную культуру.

В культуральную среду, используемую в данном изобретении, можно добавить антибиотики.

Если необходимо, вирус, например вирус PRRS, адаптируют к росту в клетках по изобретению. Адаптацию можно проводить совместным культивированием в клетках по изобретению и клетках почек обезьян, таких как МА-104. Как это хорошо известно, адаптацию проводят серийными пассажами в сокультурах при постепенном увеличении количества клеток по изобретению. Данную адаптацию также можно проводить для вирусов CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, а также других упомянутых здесь вирусов.

Неочищенную культуру можно сконцентрировать и/или очистить.

Концентрирование можно проводить любым обычным способом, известным специалистам в данной области, например избирательным осаждением или ультрафильтрацией. Очистку можно проводить любым обычным способом, известным специалистам в данной области, например ультрацентрифугированием или хроматографическими методами, например гель-фильтрацией. На данной стадии получают концентрированные вирусные культуры, очищенн