Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, способный связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (vegf), слитый полипептид, реплицируемый экспрессионный вектор, способ получения слитого полипептида, ловушка vegf, фармацевтическая композиция, способ лечения и набор для лечения vegf-опосредованного заболевания или состояния

Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, способный связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (vegf), слитый полипептид, реплицируемый экспрессионный вектор, способ получения слитого полипептида, ловушка vegf, фармацевтическая композиция, способ лечения и набор для лечения vegf-опосредованного заболевания или состояния

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к слитым полипептидам, способным связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), представителей семейства VEGF и варианты сплайсинга с конкретными требуемыми характеристиками, а также к терапевтическим способам применения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте отличительным признаком изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, содержащий компоненты рецепторов (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y, где R1 означает компонент рецептора фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) в виде Ig-домена 2 Flt-1 (Flt1D2), R2 означает компонент рецептора VEGF в виде Ig-домена 3 Flk-1 (Flk1D3) и R3 означает компонент рецептора VEGF в виде Ig-домена 3 Flt-4 (Flt1D3 или R3) и где Х≥1 и Y≥1.

В связанном втором аспекте отличительным признаком изобретения является мономерная ловушка VEGF или слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y, где X≥1, Y≥1 и R1, R2 и R3 имеют значения, определенные выше. Компоненты рецептора VEGF R1, R2 и R3 могут быть непосредственно связаны друг с другом или связаны посредством одной или нескольких спейсерных последовательностей. В одном конкретном варианте мономерная ловушка VEGF представляет собой (R1R2)_X, где X=2. В более конкретном варианте мономерной ловушкой VEGF является SEQ ID NO: 24 или ее функционально эквивалентный аминокислотный вариант. Изобретение относится к мономерной ловушке VEGF, главным образом состоящей из компонентов рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и их функционально эквивалентных аминокислотных вариантов.

В третьем аспекте отличительным признаком изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и компонент, являющийся партнером в слиянии (FP), выбранный из группы, состоящей из мультимеризующего компонента (MC), сывороточного белка или молекулы, способной связывать сывороточный белок. В предпочтительном варианте FP является мультимеризующим компонентом (MC), способным взаимодействовать с мультимеризующим компонентом в другом слитом полипептиде с образованием мультимерной структуры, например димера или тримера. Наиболее предпочтительно MC выбран из группы, состоящей из (i) мультимеризующего компонента, содержащего расщепляемую область (C-область), (ii) укороченного мультимеризующего компонента, (iii) аминокислотной последовательности длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, имеющей по меньшей мере один остаток цистеина, (iv) лейциновой молнии, (v) мотива спиральной петли, (vi) coil-coil мотива и (vii) домена иммуноглобулина. Кроме того, предлагаются слитые полипептиды, по существу состоящие из (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и FP. В предпочтительном варианте слитый полипептид по существу состоит из

(R1R2)_X и MC.

В четвертом аспекте отличительным признаком изобретения является слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и FP, которые описаны выше. Компоненты рецептора могут быть расположены в разном порядке, например (R1R2)_X-FP; (R1R2)_X-FP-(R1R2)_X; FP-(R2R1)_X и т.д. Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или связаны посредством спейсерной последовательности.

В пятом аспекте отличительным признаком изобретения является ловушка VEGF, содержащая мультимер из двух или более слитых полипептидов, состоящих из компонентов рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и FP, где компонент FP является мультимеризующим компонентом (MC), содержащим C-область. C-область может быть природного происхождения или искусственной и может находится в любой точке в мультимеризующем компоненте и функционирует, обеспечивая расщепление исходного MC до укороченного MC. Ловушка VEGF, состоящая из двух или более слитых полипептидов, имеющих по меньшей мере один укороченный MC, называется «укороченной миниловушкой».

C-область может быть создана в MC посредством инсерции, делеции или мутации так, чтобы был создан ферментативно или химически расщепляемый сайт. C-область может быть создана в любом MC и в любом положении в MC; предпочтительно C-область создают в полноразмерном домене Fc или его фрагменте или домене CH3. C-область может быть сайтом, расщепляемым ферментом, таким как тромбин, фицин, пепсин, матрилизин или пролидаза, или расщепляемым химически, например, муравьиной кислотой или CuCl₂.

В шестом связанном аспекте отличительным признаком изобретения является укороченная миниловушка VEGF, которая является мультимерным белком, содержащим два или более слитых полипептида, состоящих из (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и мультимеризующего компонента, который укорочен расщеплением исходного MC, содержащего C-область (tMC).

В седьмом аспекте отличительным признаком изобретения является слитый полипептид, состоящий из компонентов рецептора VEGF (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и MC, где MC представляет собой аминокислотную последовательность длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина, где по меньшей мере один остаток цистеина способен образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в MC другого слитого полипептида (cMC). В предпочтительном варианте cMC представляет собой аминокислотную последовательность длиной 1-50 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина. В более предпочтительном варианте cMC является аминокислотной последовательностью длиной 1-15 аминокислот, содержащей по меньшей мере один остаток цистеина. В еще более предпочтительном варианте cMC представляет собой аминокислотную последовательность длиной 1-10 аминокислот, содержащую 1-2 остатка цистеина. Иллюстрация данного варианта изобретения показана в SEQ ID NO: 27, имеющей сигнальную последовательность (1-26), за которой следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231), и далее следует последовательность из девяти аминокислот, заканчивающаяся остатком цистеина. В другом варианте, показанном в SEQ ID NO:28, за сигнальной последовательностью (1-26) следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231), за которыми следует последовательность из шести аминокислот, заканчивающаяся остатком цистеина.

В восьмом аспекте отличительным признаком изобретения является миниловушка VEGF, содержащая мультимер из двух или более слитых полипептидов, состоящих из (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y и cMC. В более конкретном варианте миниловушка является димером. Иллюстрацией данного варианта миниловушки согласно изобретению является димер слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 2, в котором каждый слитый полипептид (R1R2-cMC) имеет молекулярную массу 23,0 кДа и pI 9,22.

В другом варианте cMC имеет 4 аминокислоты в длину и включает два остатка цистеина, например XCXC (SEQ ID NO: 3). В одном иллюстративном примере данного варианта изобретения миниловушка состоит из компонентов рецептора VEGF согласно изобретению и cMC состоит из ACGC (SEQ ID NO: 4). Одним иллюстративным примером данного варианта миниловушки согласно изобретению является димер слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 5, в котором каждый мономер имеет молекулярную массу 23,2 кДа и pI 9,22. Другой иллюстративный пример данного варианта изобретения показан в SEQ ID NO: 26, имеющей сигнальную последовательность (1-26), за которой следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231) с последующей последовательностью из девяти аминокислот, заканчивающейся CPPC.

Во всех вариантах ловушки VEGF согласно изобретению (включая укороченную миниловушку VEGF, миниловушки VEGF и мономерные миниловушки VEGF) сигнальная последовательность (S) может быть включена в начале (или на N-конце) слитого полипептида согласно изобретению. Сигнальная последовательность может быть нативной для клетки, рекомбинантной или синтетической. Если сигнальная последовательность связана с N-концом первого рецепторного компонента, то слитый полипептид может быть обозначен, например, как S-(R1R2)_X.

Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством спейсеров. В конкретных вариантах один или несколько рецепторных компонентов и/или компонентов, являющихся партнерами в слиянии, в слитом полипептиде непосредственно связаны друг с другом без спейсеров. В других вариантах один или несколько рецепторных компонентов и/или компонентов, являющихся партнерами в слиянии, связаны посредством спейсеров.

Изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включая экспрессирующие векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с последовательностью регуляции экспрессии. Изобретение, кроме того, относится к системам хозяин-вектор для получения слитого полипептида, которые содержат экспрессирующий вектор в подходящей клетке-хозяине; к системам хозяин-вектор, в которых подходящей клеткой-хозяином является бактериальная, дрожжевая клетка, клетка насекомых, клетка млекопитающих; клетка E. coli или клетка COS или CHO. Кроме того, предлагаются ловушки VEGF согласно изобретению, модифицированные ацетилированием или пэгилированием. Способы ацетилирования или пэгилирования белка хорошо известны в данной области.

В связанном девятом аспекте отличительным признаком изобретения является способ получения ловушки VEGF согласно изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, трансфицированной вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии белка клеткой-хозяином, и извлечение полученного таким образом слитого полипептида.

Ловушки VEGF согласно изобретению терапевтически применимы для лечения любого заболевания или состояния, которое улучшается, становится ослабленным или подавленным при удалении, ингибировании или уменьшении количества VEGF. Неполный список конкретных состояний, улучшаемых при ингибировании или уменьшении количества VEGF, включает например нежелательное просачивание плазмы или проницаемость сосудов, нежелательный рост кровеносных сосудов, например, такой как в опухоли, отек, связанный с воспалительными заболеваниями, такими как псориаз или артрит, включая ревматоидный артрит; астму; генерализованный отек, связанный с ожогами; асцит и плевральный выпот, связанный с опухолями, воспалением или травмой; хроническое воспаление дыхательных путей; астму; синдром капиллярной утечки; сепсис; болезнь почек, связанную с повышенным просачиванием белка; аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDAC) и глазные заболевания, такие как связанная с возрастом дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия. Миниловушка VEGF, в частности, применима для лечения заболеваний глаз и как вспомогательное средство при операциях на глазах, включая операцию по поводу глаукомы; и лечения внутриглазных опухолей, например, таких как увеальная меланома, ретинобластома, посредством доставки в стекловидное тело.

Соответственно в десятом аспекте отличительным признаком изобретения является терапевтический способ лечения связанного с VEGF заболевания или состояния, включающий введение ловушки VEGF согласно изобретению субъекту, страдающему от связанного с VEGF заболевания или состояния. Хотя любое млекопитающее можно лечить терапевтическими способами согласно изобретению, субъектом предпочтительно является больной человек, страдающий или подверженный риску развития состояния или заболевания, которое может быть улучшено, ослаблено, ингибировано или подвергнуто лечению ловушкой VEGF.

В одиннадцатом аспекте отличительным признаком изобретения являются способы диагностики и прогнозирования, а также наборы для выявления, количественного анализа и/или слежения за VEGF с использованием миниловушек согласно изобретению.

В двенадцатом аспекте отличительным признаком изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие ловушку VEGF согласно изобретению с фармацевтически приемлемым носителем. Такие фармацевтические композиции могут содержать ловушку из димерного слитого полипептида или нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый полипептид. Миниловушки согласно изобретению находят конкретные применения при состояниях, при которых требуется ловушка VEGF с пониженным временем полужизни в сыворотке (например, более быстрый клиренс) и/или повышенным проникновением в ткани вследствие меньшего размера. Конкретные применения миниловушки VEGF включают, например, заболевания, при которых желательно локальное введение в конкретную ткань или клетку. Примерами такого состояния являются офтальмологические болезни глаза.

Другие объекты и преимущества станут очевидными при ознакомлении со следующим подробным описанием.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед тем как ознакомиться с описанием предлагаемых способов, следует понимать, что данное изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условиями, как таковые способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология применяется только с целью описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В используемом в данном описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст четко не диктует обратное. Таким образом, например, ссылка на «способ» включает один или несколько способов и/или стадий указанного в данном описании типа и/или тех, которые станут очевидными специалистам в данной области при чтении данного описания и т.д.

Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой данное изобретение относится. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и вещества, сходные или эквивалентные веществам, указанным в данном описании, описаны предпочтительные способы и вещества. Все публикации, упоминаемые в данном описании, включены в него в виде ссылки, чтобы описать способы и/или вещества, в связи с которыми цитированы публикации.

Общее описание

Изобретение относится к ловушке VEGF, способной связывать и ингибировать активность VEGF, которая является мономером или мультимером одного или нескольких слитых полипептидов. Молекулы согласно изобретению связывают и ингибируют биологическую активность VEGF и/или физиологическую реакцию или ответ. Описание основанных на рецепторе VEGF антагонистических ловушек VEGF Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 7-8) и VEGFR1R2-FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10) смотри в PCT WO/0075319, содержание которой включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

Миниловушка согласно изобретению меньше, чем полноразмерная ловушка, примерно 50-60 кДа по сравнению с 120 кДа исходной ловушки, и включает мономерные ловушки, состоящие главным образом из доменов рецепторов VEGF (R1R2)_X, (R1R3)_Y или их комбинаций, ловушки, образованные отщеплением части исходной мультимерной ловушки, имеющей компонент, являющийся партнером в слиянии, который представляет собой мультимеризующий компонент (MC), содержащий область расщепления (C-область); или связыванием остатка цистеина или аминокислотной последовательности, содержащей один или несколько остатков цистеина, с доменами рецепторного компонента или между доменами рецепторного компонента. В конкретных вариантах миниловушка согласно изобретению имеет молекулярную массу меньше 60 кДа, как измерено посредством SDS-ПААГ-анализа; более предпочтительно примерно 50 кДа; еще более предпочтительно примерно 20-30 кДа или примерно 25 кДа и способна связывать VEGF с аффинностью, сравнимой с полноразмерной исходной ловушкой, описанной в PCT/US00/14142.

Конструкции нуклеиновой кислоты и экспрессия

Настоящее изобретение относится к конструкции молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих отдельный слитый полипептид, способный связывать VEGF, или мультимерные ловушки VEGF. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут кодировать компоненты рецепторов дикого типа R1, R2 и/или R3 или их функционально эквивалентные варианты. Варианты аминокислотной последовательности рецепторных компонентов R1, R2 и/или R3 ловушек согласно изобретению также могут быть получены в результате создания мутаций в кодирующих молекулах нуклеиновых кислот. Такие варианты включают, например, делеции, или инсерции, или замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности R1, R2 и/или R3. Может быть осуществлена любая комбинация делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает способностью связывать и ингибировать VEGF.

Указанные молекулы нуклеиновых кислот встраивают в вектор, который способен экспрессировать слитый полипептид при введении в подходящую клетку-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают, но не ограничены указанным, клетки бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Можно применять любые способы, известные специалисту в данной области, для встраивания фрагментов ДНК в вектор, чтобы сконструировать экспрессирующие векторы, кодирующие слитый полипептид согласно изобретению, под контролем сигналов регуляции транскрипции/трансляции.

Экспрессия молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению может регулироваться второй последовательностью нуклеиновой кислоты так, чтобы молекулы экспрессировалась в хозяине, трансформированном молекулой рекомбинантной ДНК. Например, экспрессия может регулироваться любым промоторным/энхансерным элементом, известным в данной области. Промоторы, которые можно использовать для регуляции экспрессии химерных полипептидных молекул, включают без ограничения длинный концевой повтор (Squinto et al. (1991) Cell 65: 1-20); область раннего промотора SV40, промотор CMV, M-MuLV, промотор тимидинкиназы, регуляторные последовательности гена металлотионина; прокариотические экспрессирующие векторы, такие как промотор b-лактамазы или промотор tac (смотри также Scientific American (1980) 242: 74-94); промоторные элементы дрожжей или других грибов, такие как промотор Gal 4, ADH, PGK, промотор щелочной фосфатазы и области регуляции тканеспецифичной транскрипции, полученные из таких генов, как эластаза I.

Экспрессирующие векторы, способные реплицироваться в бактериальном или эукариотическом хозяине, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, используют для трансфекции хозяина и таким образом для управления экспрессией таких нуклеиновых кислот, чтобы получить слитый полипептид согласно изобретению, который образует ловушки, способные связываться с VEGF. Трансфицированные клетки могут временно или предпочтительно конститутивно и постоянно экспрессировать ловушки VEGF согласно изобретению.

Ловушки согласно изобретению могут быть очищены любым способом, который обеспечивает последующее образование стабильной биологически активной ловушки. Например, но не с целью ограничения, факторы могут быть извлечены из клеток либо в виде растворимых белков, либо в виде тел включения, из которых их можно экстрагировать количественно 8М гидрохлоридом гуанидиния и диализом (смотри, например, патент США No. 5663304). Чтобы дополнительно очистить факторы, можно использовать обычную ионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, хроматографию с обращенной фазой или гель-фильтрацию.

Компоненты рецептора VEGF

Компоненты рецептора VEGF в миниловушках VEGF состоят из Ig-домена 2 Flt-1 (Flt1D2) (R1), Ig-домена 3 Flk-1 (Flk1D3) (R2) (вместе, R1R2), и/или R1 и Ig-домена 3 Flt-4 (Flt1D3) (R3) (вместе R1R3). Подразумевается, что термин «Ig-домен» Flt-1, Flt-4 или Flk-1 охватывает не только полный домен дикого типа, но также его варианты с инсерциями, делециями и/или заменами, которые по существу сохраняют функциональные свойства интактного домена. Специалисту в данной области без труда будет понятно, что могут быть получены многочисленные варианты указанных выше Ig-доменов, которые будут сохранять по существу такие же функциональные свойства, как и домен дикого типа.

Подразумевается, что термин «функциональные эквиваленты» при использовании со ссылкой на R1, R2 или R3, охватывает домен R1, R2 или R3 по меньшей мере с одним изменением, например делецией, присоединением и/или заменой, который сохраняет по существу такие же функциональные свойства, как и домен R1, R2 или R3 дикого типа, то есть по существу эквивалентное связывание с VEGF. Будет понятно, что могут быть сделаны различные аминокислотные замены в R1, R2 или R3, не отходя от сути изобретения в отношении способности указанных рецепторных компонентов связывать и инактивировать VEGF. Функциональные свойства ловушек согласно изобретению можно определить любым подходящим скрининговым анализом, известным в данной области для измерения требуемой характеристики. Примеры таких анализов описаны в экспериментальном разделе ниже, которые позволяют определять связывающие свойства ловушек для VEGF (Kd), а также время их полужизни в случае диссоциации комплекса ловушка-лиганд (T_1/2). Другие анализы, например изменение способности специфично связываться с VEGF, можно измерить в анализе связывания VEGF конкурентного типа. Модификации свойств белка, таких как термостабильность, гидрофобность, чувствительность к протеолитической деградации или тенденция к агрегации, могут быть измерены способами, известными специалистам в данной области.

Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством спейсеров. В общем, термин «спейсер» (или линкер) означает одну или несколько молекул, например нуклеиновых кислот, или аминокислот, или непептидных остатков, таких как полиэтиленгликоль, которые могут быть встроены между одним или несколькими составляющими доменами. Например, спейсерные последовательности могут быть использованы для обеспечения требуемого представляющего интерес сайта между компонентами для облегчения обработки. Спейсер также может быть введен, чтобы усилить экспрессию слитого полипептида клеткой-хозяином, чтобы уменьшить стерические помехи, так чтобы компонент мог принимать свою оптимальную третичную структуру и/или соответствующим образом взаимодействовать со своей молекулой-мишенью. Спейсеры и способы идентификации требуемых спейсеров смотри, например, в работе George et al. (2003) Protein Engineering 15: 871-879, включенной в данное описание в виде ссылки. Последовательность спейсера может содержать одну или несколько аминокислот, связанных в природе с рецепторным компонентом, или может представлять собой добавленную последовательность, используемую для усиления экспрессии слитого полипептида, обеспечения специальных требуемых представляющих интерес сайтов, обеспечения возможности для образования составляющими доменами оптимальных третичных структур и/или для усиления взаимодействия компонента с его молекулой-мишенью. В одном варианте спейсер содержит одну или несколько пептидных последовательностей между одним или несколькими компонентами, которые содержат 1-100 аминокислот, предпочтительно 1-25.

В более конкретных вариантах R1 представляет собой аминокислоты 27-126 SEQ ID NO: 8 или 1-126 SEQ ID NO: 8 (включая сигнальную последовательность 1-26); или аминокислоты 27-129 SEQ ID NO: 10 или 1-129 SEQ ID NO: 10 (включая сигнальную последовательность в положении 1-26). В более конкретных вариантах R2 представляет собой аминокислоты 127-228 SEQ ID NO: 8, или аминокислоты 130-231 SEQ ID NO: 10. В более конкретных вариантах R3 представляет собой аминокислоты 127-225 SEQ ID NO: 13 (без сигнальной последовательности). В том случае, когда, например, R2 помещают на N-конце слитого полипептида, может быть желательно, чтобы сигнальная последовательность предшествовала рецепторному компоненту. Рецепторный компонент(ы), связанный с мультимеризующим компонентом, кроме того, может содержать спейсерный компонент, например последовательность GPG из аминокислот 229-231 SEQ ID NO: 7.

Компоненты, являющиеся партнерами в слиянии, и мультимеризующие компоненты

Партнером в слиянии является любой компонент, который усиливает функции слитого полипептида. Таким образом, например, партнер в слиянии может усиливать биологическую активность слитого полипептида, помогать его продуцированию и/или извлечению или усиливать фармакологическое свойство или фармакокинетический профиль слитого полипептида, например, посредством увеличения его времени полужизни в сыворотке, проницаемости в ткани, обеспечения отсутствия иммуногенности или обеспечения стабильности. В предпочтительных вариантах партнер в слиянии выбран из группы, состоящей из мультимеризующего компонента, сывороточного белка или молекулы, способной связывать сывороточный белок.

В том случае, когда партнер в слиянии является сывороточным белком или его фрагментом, он выбран из группы, состоящей из α-1-микроглобулина, AGP-1, орозомукоида, α-1-кислого гликопротеина, связывающего витамин D белка (DBP), гемопексина, сывороточного альбумина человека (hSA), трансферрина, ферритина, афамина, гаптоглобина, α-фетопротеина тироглобулина, α-2-HS-гликопротеина, β-2-гликопротеина, гиалуронан связывающего белка, синтаксина, C1R, цепи C1q, связывающего галектин 3-Mac2 белка, фибриногена, полимерного рецептора Ig (PIGR), α-2-макроглобулина, белка, транспортирующего мочевину, гаптоглобина, IGFBP, фагоцитарных рецепторов макрофагов, фибронектина, гиантина, Fc, α-1-антихимотрипсина, α-1-антитрипсина, антитромбина III, аполипопротеина A-1, аполипопротеина B, β-2-микоглобулина, церулоплазмина, компонента комплемента C3 или C4, ингибитора эстеразы CI, C-реактивного белка, цистатина C и белка C. В более конкретном варианте партнер в слиянии выбран из группы, состоящей из α-1-микроглобулина, AGP-1, орозомукоида, α-1-кислого гликопротеина, связывающего витамин D белка (DBP), гемопексина, сывороточного альбумина человека (hSA), афамина и гаптоглобина. Включение компонента, являющегося партнером в слиянии, может при желании продлевать время полужизни слитого полипептида согласно изобретению в сыворотке. Смотри, например, патенты США No. 6423512, 5876969, 6593295 и 6548653, специально включенные в данное описание в виде ссылки в полном объеме, в отношении примеров полипептида, слитого с сывороточным альбумином. hSA широко распределен в организме, особенно в кишечнике и компонентах крови, и играет важную роль в поддержании осмолярности и объема плазмы. Он медленно выводится из печени и у людей обычно имеет время полужизни in vivo 14-20 дней (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; pp. 255-275).

В том случае, когда партнером в слиянии является молекула, способная связывать сывороточный белок, молекула может быть синтетической малой молекулой, липидом или липосомой, нуклеиновой кислотой, включая синтетическую нуклеиновую кислоту, такую как аптомер, пептидом или олигосахаридом. Кроме того, молекула может быть таким белком, как, например, FcγR1, FcγR2, FcγR3, полимерный рецептор Ig (PIGR), ScFv и другие фрагменты антител, специфичные по отношению к сывороточному белку.

В том случае, когда партнером в слиянии является мультимеризующий компонент (MC), он представляет собой любую природную или синтетическую последовательность, способную взаимодействовать с другим MC с образованием структуры более высокого порядка, например димера, тримера и т.д. Подходящие MC могут включать лейциновую молнию, включая домены лейциновой молнии, полученные из c-jun или c-fos; последовательности, полученные из константных областей легких цепей каппа или лямбда; синтетические последовательности, такие как мотивы спираль-петля-спираль (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432: 45-49), coil-coil мотивы и т.д., или другие общепринятые мультимеризующие домены, известные в данной области. В некоторых вариантах слитый компонент содержит домен, полученный из иммуноглобулина, например из IgG, IgM или IgA человека. В конкретных вариантах полученный из иммуноглобулина домен может быть выбран из группы, состоящей из Fc-домена IgG, тяжелой цепи IgG и легкой цепи IgG. Fc-домен IgG может быть выбран из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также любого аллотипа в каждой группе изотипов. В одном примере ловушки VEGF согласно изобретению мультимеризующим компонентом является Fc-домен IgG4 (SEQ ID NO: 29).

Создание укороченных миниловушек VEGF

В одном варианте ловушки согласно изобретению укороченную миниловушку VEGF, содержащую два или более слитых полипептида согласно изобретению, создают, подвергая исходную ловушку, имеющую MC, содержащие C-область, воздействию условий, при которых отщепляются один или несколько MC, содержащих C-область. Полученная в результате укороченная миниловушка может быть продуктом полного и частичного расщепления исходной ловушки.

MC, содержащий C-область, может представлять собой любой MC, способный взаимодействовать с другим MC с образованием структуры более высокого порядка, например димера или тримера. C-область может быть создана в MC в любом требуемом положении. В свете инструкций, представленных в примерах ниже, специалист в данной области сможет выбрать требуемый сайт для создания C-области на основе требуемых свойств получаемых в результате укороченных ловушек, например молекулярной массы, мономерной или димерной структуры и т.д.

В конкретном варианте C-область представляет собой сайт расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 6), встроенный в домен FcΔC1 после N-концевой последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1). В данном варианте конструкция полноразмерной исходной ловушки VEGF экспрессируется в клетке в виде Fc-меченого белка, обеспечивая таким образом улавливание и очистку, например, с использованием колонки с белком A. После образования димера и ковалентного связывания по одному или обоими остатками цистеина последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1) димер подвергают воздействию тромбином в условиях, при которых отщепляются один или оба домена FcΔC1, так что образуются укороченные димерные миниловушки, имеющие молекулярную массу примерно 50-90 кДа и обладающие аффинностью по отношению к VEGF, сравнимой с аффинностью исходной ловушки. Специалист в данном области может регулировать условия расщепления, чтобы предпочтительно образовывать продукт частичного расщепления или продукт полного расщепления, при этом вариант условий расщепления выбирают на основе потребности в конкретном продукте, обладающем конкретными свойствами, такими как молекулярная масса.

В конкретном варианте C-область является сайтом расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 6), встроенным в домен FcΔC1 на N-конце по отношению к последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1). После образования димера и ковалентного связывания по одному или обоим остаткам цистеина последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1) димер подвергают воздействию тромбина в условиях, при которых возникают один или оба домена FcΔC1 и образуются укороченные мономерные миниловушки. Мономерная укороченная миниловушка, образованная таким образом, содержит рецепторный компонент, небольшой фрагмент Fc и имеет размер примерно 25 кДа и проявляет пониженную аффинность по отношению к VEGF по сравнению с укороченной димерной ловушкой и полноразмерной исходной ловушкой. Показано, что подобная мономерная ловушка, полученная в виде рекомбинантного белка, имеет K_D примерно 1 нМ.

Создание миниловушек VEGF

В одном варианте изобретение относится к миниловушкам VEGF, имеющим один или несколько доменов рецепторных компонентов (R1R2)_X и/или (R1R3)_Y, где X≥1, Y≥1 и R1, R2 и R3 имеют значения, определенные выше, и необязательно партнер в слиянии, который предпочтительно является доменом MC, который представляет собой аминокислотную последовательность длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина, где по меньшей мере один остаток цистеина способен образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в MС другого слитого полипептида (cMC). cMC может находиться на N-конце или C-конце слитого полипептида или между двумя доменами рецепторных компонентов. В одном конкретном варианте цистеин добавляют к C-концу компонента рецептора VEGF, например R1R2_C, который позволяет слитому полипептиду образовывать ковалентные димеры посредством образования ковалентной дисульфидной связи между остатком цистеина на C-конце одного слитого полипептида и остатком цистеина на C-конце другого слитого полипептида. В данном иллюстративном примере миниловушка является димером слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 2, где каждый слитый полипептид (R1R2-cMC или R1R2_C) имеет молекулярную массу примерно 23,0 кДа.

В другом варианте cMC является последовательностью 4 аминокислот (XXXX) (SEQ ID NO: 11), где X означает любую аминокислоту и последовательность содержит, по меньшей мере, один остаток цистеина. В конкретном варианте cMC добавляют к C-концу домена рецепторного компонента. В более конкретном варианте последовательность из 4 аминокислот представляет собой ACGC (SEQ ID NO: 4) и cMC образует две дисульфидные связи с остатками цистеина, присутствующими во втором слитом полипептиде. Как показано ниже (таблица 2), обе приведенные в качестве примера миниловушки проявляют аффинность по отношению к VEGF, сравнимую с аффинностью исходной ловушки.

Терапевтические применения

Миниловушки VEGF согласно изобретению терапевтически применимы для лечения любого заболевания или состояния, которое улучшается, ослабляется, подавляется или предотвращается при удалении, ингибировании или уменьшении количества VEGF. Неограничивающий список конкретных состояний, улучшаемых ингибированием или уменьшением количества VEGF, включает клинические состояния, которые характеризуются избыточной пролиферацией эндотелиальных клеток сосудов, проницаемостью сосудов, отеком или воспалением, такие как отек головного мозга, связанный с повреждением, инсультом или опухолью; отек, связанный с воспалительными заболеваниями, такими как псориаз или артрит, включая ревматоидный артрит; астму; генерализованный отек, связанный с ожогами; асцит и плевральный выпот, связанный с опухолями, воспалением или травмой; хроническое воспаление дыхательных путей; синдром капиллярной утечки; сепсис; болезнь почек, связанную с повышенным просачиванием белка; и глазные заболевания, такие как связанная с возрастом дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия.

Композиции согласно изобретению терапевтически применимы для лечения широкого множества заболеваний, связанных с повышенными уровнями VEGF. Например, воспаление с аномальным повышением Th2 и ремоделирование дыхательных путей характерны для патогенеза астмы (смотри, например, Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 1001-6). Повышенные уровни VEGF обнаружены в тканях и биологических образцах пациентов с астмой, которые прямо коррелируют с активностью заболевания (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107: 1106-1108) и обратно коррелируют с диаметром дыхательных путей и чувствительностью дыхательных путей. Кроме того, предполагалось, что VEGF вносит вклад в отек ткани при астме.

Другим заболеванием, связанным с повышенным уровнем VEGF, является аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC). Указанная злокачественная опухоль часто имеет очаг усиленной пролиферации эндотелиальных клеток и часто сверхэкспрессирует VEGF (Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543). PDAC является причиной более 20% смертельных исходов вследствие злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта, что делает данное заболевание четвертым из наиболее распространенных причин связанной со злокачественными опухолями смертности в США и других промышленно развитых стран. Экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли VEGF в развитии злокачественной опухоли поджелудочной железы, таким образом, ингибитор VEGF является многообещающим в качестве терапевтического средства для ослабления роста опухоли внутри поджелудочной железы и региональных и дистальных метастазов.

Меньшая по размеру негликозилированная миниловушка, экспрессированная в E. coli (пример 4), гликозилированная миниловушка, экспрессированная в клетках CHO (пример 5), или основанная на рецепторе мономерная ловушка (пример 6) имеет оптимизированные характеристики для локальной/интравитреальной доставки, т.е. более короткое время полужизни в сыворотке для более быстрого клиренса и минимизации нежелательного системного воздействия. Кроме того, вследствие