Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности фактора D альтернативного пути комплемента человека[1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин А, иммуноглобулин G, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Единственным недостатком этого способа является относительно трудная доступность и плохая длительная сохраняемость активирующей способности индивидуальных, высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, сорбируемых на микропанели, а в случае липополисахаридов, кроме того, трудности в их сорбции на полистироловых планшетах, обычно используемых в иммуноферментном анализе.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность фактора D альтернативного пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора альтернативного пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропланшета аптечного препарата лизоцима, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (например, сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования труднодоступных высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, плохо сохраняющих свою активирующую способность, какими являются иммуноглобулина G и А, компонент С3 и липополисахарид.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата фактора D. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоцима в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl₂ (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RD (RD - сыворотка человека, лишенная фактора D, с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, хроматографической сорбцией фактора D на колонке с СМ-сефадексом С-50 из сыворотки крови человека [2]) и анализируемую пробу, содержащую фактор D с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента СЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата фактора D рассчитывают по стандартной кривой (чертеж).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности фактора D. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора D с коэффициентом корреляции R=0,996, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора D описанным способом с использованием описанного набора.

Литература.

1. Козлов Л.В., Романов СВ., Дьяков В.Л., Лахтин В.М. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека. Патент РФ №223991, 20.07.2004.

2. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №3. С.342-348.

1. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора альтернативного пути комплемента, внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент RD, и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, инкубирование в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствии ионов Са²⁺, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора альтернативного пути комплемента используют лизоцим.

2. Набор для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD, конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.