Лечение бактериальных инфекций

Лечение бактериальных инфекций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение связано с соединениями, лекарственными средствами и лечением инфекции, вызываемой Clostridium difficile, наряду с недавно выделенными антителами и их применением в тех же целях. Настоящее изобретение связано также с профилактикой и лечением инфекции, вызываемой бактериями E.faecium и E.faecalis, и предоставляет для этого лекарственные средства и способы лечения.

C.difficile представляет собой грамположительную анаэробную бактерию и считается значительным патогенным фактором для человека, вызывающим спектр заболеваний, имеющий диапазон от умеренной диареи до скоротечных псевдомембранозных колитов (PMC), в совокупности именуемых C.difficile антибиотик-ассоциированной диареей (CDAD). CDAD представляет собой ятрогенное, нозокомиальное (внутрибольничное) заболевание, ассоциированное со значительной распространенностью и летальными исходами, особенно у людей преклонного возраста. Было выделено два фактора, играющие главную роль в патогенезе CDAD - подавление резидентной кишечной флоры посредством введения антибиотиков и продуцирование бактерией двух высокомолекулярных токсинов, экзотоксина А и экзотоксина В.

Эта бактерия эндемична в госпиталях, и исследования показали, что приблизительно одна треть пациентов, получающих лечение антибиотиками в отделении экстренной помощи больницы, заражается бактерией C.difficile, еще находясь в стационаре (Kyne, L., et al., 2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), стр.346-53, PMID: 11774082). Более чем у половины из этих пациентов развивались симптомы CDAD, в то время как оставшиеся были бессимптомными носителями. CDAD является основным фактором, распространенным среди пациентов во время их пребывания в стационаре, и оценочные данные дают возможность предположить, что затраты на это заболевание в США превышают 1,1 биллион $ в год (Kyne, L., et al., выше). Пациенты, страдающие от CDAD, хорошо реагируют на лечение, которое включает в себя прекращение введения антибиотика, и на лечение одним из двух антибиотиков - метронидазолом и ванкомицином. Уровень эффективности при начальной терапии антибиотиком может быть высоким (до 95%), но у вплоть до 20% пациентов может возникнуть рецидив в течение одной или двух недель после начала лечения, с риском возникновения рецидива, осложняющегося с каждым последующим случаем рецидива. Рецидив обычно можно лечить антибиотиками, что означает, что рецидив вызван инфицированием различными штаммами C.difficile. К тому же, очевидно, что C.difficile становится резистентным к метронидазолу и частично резистентным к ванкомицину, что диктует необходимость новых альтернатив в лечении CDAD.

Экзотоксины A и B, которые продуцируются патогенными штаммами бактерии, являются цитотоксическими, энтеротоксическими и вызывающими воспаление и рассматриваются как основные болезнетворные факторы указанного неинвазивного микроорганизма. Однако не всякое инфицирование токсикогенными штаммами приводит к заболеванию, что диктует необходимость поиска дополнительных вирулентных факторов. Антигены поверхности бактерии являются предполагаемыми вирулентными факторами и тоже считаются важным фактором, поскольку такие белки, по-видимому, содействуют основным функциям, таким как прилипание к эпителиальному слою пищеварительного канала на первом этапе образования колоний или взаимодействие с медиаторами местного иммунитета. Подобно многим другим бактериям, бактерия C.difficile имеет кристаллический или паракристаллический слой поверхности (S-слой) на внешней поверхности клетки. Такие S-слои содержат белки или гликопротеины, образующие структуру регулярной решетки на внешней поверхности бактерии и, как было ранее показано, являются существенными для вирулентности патогенных бактерий, таких как Aeromanas salmonicida и Campylobacter fetus. В отличие от многих бактерий, которые содержат один S-слой, известно, что C.difficile содержит два наложенных друг на друга паракристаллических S-слоя, каждый из которых состоит из гликопротеиновых субъединиц, которые незначительно отличаются кажущимся молекулярным весом от различных штаммов C.difficile. Большинство штаммов C.difficile экспрессируют два основных S-слоя белков (SLP), один в 32-38 кДа (SLP с низким MВ) и второй в 42-48 кДа (SLP с высоким MВ). SLP с низким MВ, по-видимому, иммунодоминантен и является антигеном, обычно узнаваемым организмом пациента, переносящего заболевание CDAD, и является единственным антигеном, узнаваемым в ЭДТА-экстрактах бактерии с помощью антисыворотки, полученной у кроликов против цельных клеток C.difficile (Calabi, E. et al., 2001, Mol. Microbiol., 40(5), стр.1187-99, PMID: 11401722).

В процессе развития микробной инфекции иммунная система пускает в ход различные адаптивные механизмы. Одним и, возможно, наиболее важным из таких механизмов является продуцирование антител. Антитела, способные связывать антигены, производимые инфицирующим агентом, продуцируются и связываются с микроорганизмами посредством активации комплемента, рекрутинга макрофага и посредством прямого взаимодействия с самим микробом, создавая возможность уничтожения микробов. Терапевтическая эффективность антител, способных связываться с данным антигеном, различна, и это фактически означает, что продукция антител созревает в процессе развития инфекции и становится максимально специфичной в тех случаях, когда пациент успешно борется с инфекцией.

Антительный ответ обусловлен репертуаром B-клеток, где каждая из B-клеток продуцирует разнообразные по структуре молекул антитела. Истинные масштабы репертуара таких B-клеток/антител неизвестны, но предварительно подсчитано, что статистическая клональная частота реактивности для данного антигена высока и может составлять 1 на 100000 в культуре B-клеток (Nobrega, A., et al., Eur J Immunol. 1998 Apr; 28(4): 1204-15; PMID: 9565360). Во время инфекционного заболевания антитела, способные связываться с патогенным организмом, отбираются в процессе изменений в популяции B-клеток, что приводит к [подборке] ключевых антител, продуцируемых в больших количествах. Механизмы указанных изменений включают в себя клональный рост, переключение изотипов и соматическую мутацию вариабельных областей иммуноглобулина. B-клетки, ответственные за выработку антител, которые способны связывать патогенный организм, размножаются, вызывая таким образом сдвиг в репертуаре B-клеток и изменяя соотношение [различных популяций] B-клеток.

На мышиной модели обнаружено, что антитело, специфичное в отношении связывающегося с клеткой домена экзотоксина А бактерии C.difficile, несет защитную функцию, и у пациентов, которые колонизированы C.difficile, но при этом асимптоматичны, обнаружен повышенный титр IgG против экзотоксина А. Инфицированные пациенты, у которых в ответ на заражение обнаруживаются столь повышенные сывороточные титры IgG против экзотоксина А, в 48 раз менее подвержены тому, что им придется страдать от CDAD, чем пациенты, у которых такой повышенный титр не достигается. Поэтому вакцинация экзотоксином А C.difficile и применение антител против экзотоксина A C.difficile рекомендуются в качестве терапевтической стратегии (Giannasca PJ и Warny M., Vaccine, 2004 Feb 17; 22(7): 848-56; PMID: 15040937).

Не основанные на антибиотиках терапевтические схемы лечения/профилактики инфекции C.difficile основаны на вакцинации и пассивной иммунизации. Схема вакцинации включает в себя введение пациенту либо последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенный фрагмент белка поверхностного слоя C.difficile, либо вариант ее гомолога, либо эквивалентный полипептидный фрагмент (как раскрыто в Международной заявке на патент WO 02/062379). Пассивная иммунотерапия обычно достигается путем введения пациенту моноклонального антитела, специфичного в отношении иммуногена, продуцируемого патогенным организмом. В основном пассивная иммунотерапия представляется особенно эффективной в лечении пациентов с ослабленным иммунитетом, которые не способны ответить на вакцинацию, и пациентов, нуждающихся в экстренной терапии, которые не могут ждать, пока вакцинация даст эффект. В случае инфицирования C.difficile пассивная иммунотерапия основана на введении пациенту нейтрализующего токсин поликлонального иммуноглобулина (как раскрыто в Международной заявке WO 99/20304) или антител, полученных против цельных бактерий и токсинов (как раскрыто в Международной заявке WO 96/07430).

Следовательно, эффективная терапия инфекции, вызванной бактерией C.difficile, очень важна, и на предшествующем уровне в данной области считалось, что терапия должна быть связана с вакцинацией или пассивной иммунотерапией, направленной против экзотоксина А бактерии C.difficile, против белка наружного слоя, или же она должна быть связана с поликлональной антисывороткой, специфичной в отношении неидентифицированных бактериальных токсинов.

Однако в настоящем изобретении установлена специфическая мишень для терапевтического воздействия. Эксперименты, описанные ниже, показывают, что у пациентов, инфицированных C.difficile, продуцируется повышенный титр антител, специфичных в отношении ацетил-СоА-ацетилтрансферазы (тиолазы), и что антитело против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолазы), по-существу, пригодно и эффективно в лечении инфекции, вызванной C.difficile. Более того, антитело против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы, особенно искусственное антитело, сконструированное из наиболее доминантных CDR-последовательностей из организма пациентов, инфицированных C.difficile, при совместном использовании с антибиотиками ванкомицином или гентамицином дает в результате синергическое лечение инфекции, вызванной C.difficile.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной Clostridium difficile.

Используемый в данном документе термин "лечение", если не указано иначе, имеет широкое значение. Таким образом, термины "лечение" или "терапия" означают любую терапию, которая предназначена для излечения, облегчения, устранения или уменьшения симптомов или предотвращения или снижения вероятности заболевания или дисфункции в организме человека или животного. Следовательно, термин "лечение" относится к обоим значениям - и к лечению заболевания, и к его профилактике.

В частности, ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может происходить из бактерии Clostridium difficile, и она может иметь последовательность SEQ ID NO: 43.

Возможно применение широкого ряда ингибиторов, специфичных в отношении ацетил-CoA-ацетилтрансферазы. В частности, ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может образовывать специфические связанные пары (sbp) с ингибитором, при этом ацетил-CoA-ацетилтрансфераза является первым элементом пары, а ингибитор является вторым элементом пары.

В настоящем документе "Элемент специфически связывающейся пары" представляет собой одну из двух отличающихся молекул, имеющих на своей поверхности или в полости область, которая специфически связывается с другой молекулой и в силу этого считается комплементарной особой пространственной и полярной организации другой молекулы. Элементы специфически связывающихся пар называют лигандом и рецептором (антилигандом), sbp-элементом, sbp-партнером, sbp-членом и пр. Существуют традиционные элементы иммунологической пары, такие как антиген-антитело, хотя этот термин имеет более широкое значение, включающее и другие специфически связывающиеся пары, такие как РНК-белок, ДНК-белок и пр.

Следовательно, ингибитором может быть антитело или его антиген-связывающий фрагмент, и он может быть специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом с последовательностью SEQ ID NO:47.

Как подробно описано ниже в разделе "Эксперименты", эпитоп, представленный пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:47, идентифицирован как консервативный участок, присутствующий в разных антигенах, и, следовательно, идентифицирован как пептид, представленный консервативным эпитопом, общим среди таких антигенов.

Термин "антитело" в его различных грамматических формах используется в данном документе для обозначения молекул иммуноглобулина и иммунологически активных сегментов молекул иммуноглобулина, то есть молекул, которые содержат объединяющий антитела комбинированный участок или паратоп. Такие молекулы также именуют "антигенсвязывающими фрагментами" молекул иммуноглобулина.

Иллюстративными молекулами антител являются молекулы иммуноглобулина, по существу, интактные молекулы иммуноглобулина и те сегменты молекулы иммуноглобулина, которые содержат паратоп, включая сегменты, известные в данной области, такие как Fab, Fab', F(ab')2, scFv и F(v). Антитела, их продуцирование и применение хорошо известны в данной области (например, Harlow, E. и Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998).

Как подробно описано ниже в экспериментах, вариабельные тяжелые (VH) и вариабельные легкие (VL) цепи антител, продуцируемых пациентами, инфицированными C.difficile, были клонированы, секвенированы, и были идентифицированы их определяющие комплементарность области (CDR). В результате показано, что существуют высокоиммунодоминантные области CDR 1-3 VH-цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) и высокоиммунодоминантные области CDR 1-3 VL-цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3).

Таким образом, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 2-4 соответственно. В частности, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь VH-цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1.

Сходным образом, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 17-19. В частности, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь VL-цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 16.

Было сконструировано и использовано искусственное антитело, имеющее указанные выше последовательности, и, следовательно, антитело может иметь последовательность SEQ ID NO: 41. Антитело, подробно описанное ниже, имеющее последовательность SEQ ID NO: 41, также содержит N-концевую S-метку и C-концевую His-метку. Метки используются для экспериментальных целей, но не являются необходимыми для терапевтического применения антитела, хотя они (или другие метки) и могут считаться полезными. Таким образом, антитело может, например, дополнительно содержать His-метку, к примеру C-концевую His-метку.

Эксперименты, описанные ниже, показали, что не только ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы эффективен сам по себе в успешном лечении инфекции, вызванной Clostridium difficile, но он также пригоден и при использовании в сочетании с существующими антибиотиками, в частности с гентамицином и ванкомицином, и что такое применение может обеспечить синергические результаты. Предварительные экспериментальные результаты также показали, что синергизм достигается и в случае метронидазола.

Следовательно, лекарственное средство может дополнительно содержать, по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Разумеется, медицинские композиции согласно изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или инертный наполнитель (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA; United States Pharmacopoeia, ISBN: 1889788031).

Как подробно описано выше, ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы как таковой эффективен в успешном лечении инфекции, вызываемой Clostridium difficile. Таким образом, согласно настоящему изобретению, также предоставляется выделенное и/или очищенное антитело, содержащее, по меньшей мере, одну из групп, состоящую из

(i) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 2-4 соответственно; и

(ii) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 17-19.

Как указано выше, VH-цепь может иметь последовательность SEQ ID NO: 1. VL-цепь может иметь последовательность SEQ ID NO: 16. Антитело может иметь последовательность SEQ ID NO: 41.

Предоставляется также молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей такое антитело. Молекула нуклеиновой кислоты может быть выделена и/или очищена. В частности, молекула нуклеиновой кислоты может иметь последовательность SEQ ID NO: 46.

Определяется также согласно изобретению применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы и ванкомицина в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, в частности, вызванной ванкомицин-резистентной бактерией Enterococcus faecium.

Эксперименты, описанные ниже, показывают, что не только применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы и ванкомицина приводит к синергической терапии инфекции, вызванной C.difficile, но также и к синергической терапии инфекции, вызванной E.faecium, особенно к инфекции, вызванной ванкомицин-резистентной бактерией E.faecium. Предварительные эксперименты показали также, что синергичность также наблюдается при лечении инфекции, вызванной E.faecalis.

Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может происходить и из Clostridium difficile.

Ингибитором может быть антитело или его антиген-связывающий фрагмент, и он может быть специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 47.

Что касается других аспектов настоящего изобретения, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющие последовательности соответственно SEQ ID NO: 2-4. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент VH-цепи может иметь последовательность SEQ ID NO: 1.

Антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющие последовательности соответственно SEQ ID NO: 17-19. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент VL-цепи может иметь последовательность SEQ ID NO: 16.

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь последовательность SEQ ID NO: 41.

Когда настоящее изобретение связано с лекарственными средствами, содержащими два или более активных ингредиентов (например, антитело и антибиотик), настоящее изобретение предоставляет также комбинированные препараты, содержащие такие активные ингредиенты. Например, могут быть предоставлены препараты в составе двух наборов.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предоставляется также комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, содержащий

(i) ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Предоставляется также комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, содержащий

(i) ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) ванкомицин.

Бактерии Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis могут быть ванкомицин-резистентными.

Настоящее изобретение также расширяет способы лечения пациентов. Таким образом, согласно настоящему изобретению предоставляется также способ лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы нуждающемуся в этом пациенту. Дополнительно способ может включать в себя введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного антибиотика из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Согласно настоящему изобретению предоставляется также способ лечения инфекции, вызванной бактериями Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества:

(i) ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) ванкомицина

нуждающемуся в этом пациенту.

Enterococcus faecium может быть резистентным к ванкомицину.

Настоящее изобретение станет далее очевидным при последующем описании, в котором только лишь в качестве примера продемонстрированы формы лечения инфекции, вызванной бактериями C.difficile и E.faecium.

Эксперименты

В экспериментах, описанных ниже, искусственное антитело конструировали с использованием предоминантных VH- и VL-последовательностей антитела из организма пациентов, инфицированных C.difficile. Используя такое искусственное антитело, антиген выделяли, и очищали, и для определения предполагаемой частичной последовательности выделенного белка использовали электрораспылительную масс-спектрометрию. Исследуя соответствие геномных последовательностей C.difficile, установили возможную кандидатуру cовпадающей последовательности. Сравнительный анализ последовательности-кандидата из C.difficile позволил выявить ряд гомологичных белков, которые были классифицированы как ферменты ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза), и была подтверждена их принадлежность к данному семейству. Наиболее совпадающую последовательность выявили у NP_349376 из Clostridium acetobutylicum, имеющей 68% гомологию более чем по 391 аминокислоте. Клонирование, экспрессия и очистка белка-кандидата привели к получению белка, который прочно связывается с искусственным антителом. Последующие эксперименты показали, что антитело, специфичное в отношении ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза) C.difficile, проявляет синергический эффект при его использовании с ванкомицином и гентамицином в лечении инфекций, вызванных C.difficile. Предварительные эксперименты показали также, что синергический эффект может быть достигнут также и с метронидазолом.

Эксперименты показали также наличие синергического эффекта искусственного антитела и ванкомицина в лечении ванкомицин-резистентной бактерии E.faecium. Предварительные эксперименты (не показаны) также указывают на синергичный эффект искусственного антитела и ванкомицина в лечении инфекции E.faecalis.

Если не указано иначе, все процедуры проводили, используя стандартные режимы, и, где применимо, следовали инструкциям изготовителя. Стандартные режимы для различных технических приемов, включая ПЦР, молекулярное клонирование, обработку и секвенирование, изготовление антител, картирование эпитопа и компоновку мимеотопа, культивирование клетки и фаговый дисплей, описаны в текстах, таких как McPherson, M.J. et al. (1991, ПЦР: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), Huynh и Davies (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, E. и Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), Jung, G. и Beck-Sickinger, A.G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367-486), Harris, M.A. и Rae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B.K., Winter, J. и McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).

Применяемые в способах, описанных в данном документе, реагенты и оборудование, помимо прочего, доступны у таких производителей, как Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) и Stratagene (www.stratagene.com).

Содержание каждой из обсуждаемых здесь ссылок, включая цитируемые тут источники, в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылки.

Здесь "PMID" - это ссылочные номера, предоставленные для публикаций, они являются идентификационными номерами PubMed, присвоенными Национальной Библиотекой Медицины США, у которой на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov доступна вся библиографическая информация и резюме для каждой публикации. Это также предоставляет возможность прямого доступа к электронным копиям полных публикаций, особенно в случае, например, публикаций PNAS, JBC и MBC.

Гомологичность последовательности определяли, используя программу BLAST2 (Tatusova T.A et al., FEMS Microbiol Lett. 1999 May 15; 174(2):247-50; PMID: 10339815) при Национальном Центре Биотехнологической Информации, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov), со стандартными параметрами.

Идентификация доминантных VH- и VL-последовательностей антител из организма пациентов, инфицированных C.difficile

Чтобы установить последовательности антител из организма пациентов, инфицированных C.difficile, и определить последовательности доминантного антитела, в частности последовательности CDR, использовали способы, описанные в Международной заявке WO 03/052416. Продуцируемые В-клетками антитела идентифицировали, секвенировали и анализировали, используя следующие основные стадии (см. WO 03/052416):

(1) Выделение человеческих VH- и/или VL-кодирующих областей из циркулирующих B-клеток пациентов.

(2) Определение нуклеотидной последовательности репертуара VH и/или VL.

(3) Определение первичных аминокислотных последовательностей VH и/или VL.

(4) Экстракцию областей CDR in silico и внесение их в базу данных.

(5) Определение доминантных CDR и каркасных областей в репертуаре VH и/или VL.

(6) Конструирование и продуцирование терапевтических рекомбинантных антител из последовательностей доминантного антитела.

Секвинировали фрагменты антител из организмов четырех инфицированных пациентов (D01, D02, D03 и D04).

Тяжелая цепь (CDH1)

CDH1 - наиболее часто встречающаяся VH-цепь у пациентов, инфицированных C.difficile. Это было установлено при анализе CDR3-последовательностей VH-цепей антител пациента. 226/1011 (22,4%) клонированных антител пациентов, инфицированных C.difficile, имели одинаковую CDR3-последовательность (CDR-H3, ниже). Обнаружено, что CDH1 присутствует у трех четвертей пациентов. Эта CDR3-последовательность проявлялась у 184/318 (57,9%) клонов от пациента D01; у пациента D03 она проявлялась в 40/291 (13,7%) клонов; и у пациента D04 она проявлялась в 2/252 (0,8%) клонов. Наиболее часто полная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 1.

В пределах данной последовательности VH-цепи, последовательности CDR (области, определяющей комплементарность) представляют собой следующее:

CDR-H1	SEQ ID NO: 2
CDR-H2	SEQ ID NO: 3
CDR-H3	SEQ ID NO: 4.

Исследования гомологии позволили установить несколько других CDR3-последовательностей с более чем 70% гомологией относительно CDR-H3-последовательности (SEQ ID NO: 4), все из которых получены у пациентов, инфицированных C.difficile. Последовательности CDR3 представляют собой SEQ ID NO: 5-15.

Легкая цепь (CDL1)

Легкая цепь для H1L1 была получена из клона с наиболее распространенной CDR3-последовательностью у пациентов, инфицированных C.difficile. CDL1 присутствовала у пациента D01 с частотой 84/251 (33,5%). Наиболее часто последовательность VL, содержащая данную CDR3-последовательность, представляла собой SEQ ID NO: 16.

В пределах данной последовательности VL-цепи, последовательности CDR (области, определяющие комплементарность) представляют собой следующее:

CDR-L1	SEQ ID NO: 17
CDR-L2	SEQ ID NO: 18
CDR-L3	SEQ ID NO: 19.

Исследования гомологии позволили установить несколько других CDR3-последовательностей с более чем 70% гомологией относительно CDR-L3-последовательности, все из которых получены у пациентов, инфицированных C.difficile. Последовательности CDR3 представляют собой SEQ ID NO: 20-40.

Конструирование и клонирование антитела H1L1

Искусственное антитело H1L1 было сконструировано следующим образом: CDH1 и CDL1 были по отдельности ПЦР-амплифицированы из секвенирующего вектора и клонированы в клонирующий вектор pGEM-T easy (Promega Corporation) для облегчения секвенирования ДНК. Для этого 3 мкг ПЦР-продукта готовили для рестрикции, используя очистительные спин-колонки ПЦР QIAquick (Qiagen, UK), согласно инструкциям производителя. ДНК элюировали со спин-колонки 40 мкл буфера EB. Очищенный продукт ПЦР (2 мкл) смешивали с 1 мкл вектора pGEM-T easy, 6 мкл воды и 1 мкл ДНК-лигазы и смесь лигировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Лигаты затем трансформировали в электроустойчивые клетки E. coli TG1 (Stratagene) посредством электроимпульса и высевали на чашки с агаром, содержащим ампициллин 100 мкг/мл^-1 IPTG (100 мкМ) и X-гал (0,006% вес./об.). Колониям предоставляли возможность расти в течение ночи при 37°C и затем хранили при 4°C. Рекомбинантные колонии идентифицировали как белые колонии в данной среде.

В результате получали антитело, имеющее следующую общую структуру:

S-метка - CDH1 - Линкер - CDL1 - His-метка

с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, с N-концевой S-меткой и C-концевой His-меткой.

Идентификация мишени для антитела H1L1 - ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза)

Материалы и способы

Приготовление препарата:

Клетки Clostridium difficile (NCTC 11204), выросшие на чашках с кровяным агаром, суспендировали в 10 мM PBS (солевой раствор фосфатного буфера) и разрушали ультразвуком 5×1 минут на льду. Клеточный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 минут и 300 мкл супернатанта осаждали в 20 мл 10% трихлоруксусной кислоты и 20 мМ DTT (дитиотрейтол) в холодном ацетоне в течение 45 минут. Белки собирали путем центрифугирования и осадок трижды промывали холодным ацетоном, содержащим 20 мM DTT.

2D-гель-электрофорез:

Осадок белка растворяли в препарате регидратационного раствора (7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 3% (вес./об.) CHAPS, 0,002% бромфеноловый синий в воде) и разбавляли тем же раствором для изоэлектрического фокусирования. Изоэлектрическое фокусирование проводили, используя систему Zoom IPGRunner (RTM) (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA) выше нелинейной pH области 3-10 (7 см) до полных 1700 Vh, нанося приблизительно по 15 мкг белка на каждую дорожку. Перед разделением во втором измерении дорожки уравновешивали в течение 15 минут уравновешивающим буфером (50 мM Трис-HCl, pH 8,8, 6 M мочевина, 30% глицерин, 2% (вес./об.) SDS, 0,002% бромфеноловый синий в воде), содержащим 65 мM DTT, а затем тем же буфером, содержащим 125 мM йод-ацетамид, в течение следующих 15 минут.

Разделение во втором измерении проводили, используя гели NuPage 4-12% Bis-TrisZoom и MOPS-буфер (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA). Белки переносили на блот-мембрану в Invitrolon PVDF (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA) и блокировали в 5% обезжиренном молоке в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS в течение 1 часа.

Иммуноблоттинг:

Для идентификации мишени антитела H1L1 мембрану инкубировали в течение 1 часа с очищенным антителом H1L1 в 5% обезжиренном молоке в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS. После промывания анти-His-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (использовали Santa Cruz Biotechnologies), разводили в соотношении 1:500 0,1% Tween20 в 10 мM PBS для выявления связанного H1L1. После промывания 0,1% Tween20 в 10 мM PBS блот проявляли, используя ECL (Amersham biosciences, Little Chalfont, UK).

Для визуализации мишеней для IgG-антител у пациентов, инфицированных Clostridium difficile, мембраны инкубировали в течение 1 часа с иммунной сывороткой, разведенной в соотношениях 1:20-1:50 0,1% Tween20 в 10 мM PBS. Использовали анти-IgG-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (для ECL) или щелочной фосфатазой (Sigma), где мембрану проявляли, используя SigmaFast (RTM) 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат/нитро голубой и таблетки тетразолия (Sigma).

Электрораспылительная масс-спектрометрия:

Окрашенные полосы или пятна белка, вырезанные из геля, промывали в 25 мM бикарбонате аммония в течение 10 минут и дегидрировали, используя 25 мM бикарбонат аммония: ацетонитрил 1:2 в течение 15 минут. После повторной промывки бикарбонатом аммония и стадии дегидрирования кусочки геля сушили в SpeedVac (RTM). Малые объемы трипсина (10 мкг/мл в 25 мM бикарбонате аммония) добавляли до тех пор, пока кусочки геля не принимали их первоначальный размер, и добавляли малое количество 25 мM бикарбоната аммония, чтобы кусочки геля оставались влажными в процессе расщепления. Образцы расщепляли в течение 4,5 часов при 37°C и белки экстрагировали в течение 15 минут посредством добавления 80 мкл ацетонитрила. Супернатант просушивали в SpeedVac до тех пор, пока весь ацетонитрил не испарялся. Образец обессоливали с применением C-18 Zip-Tips (Millipore) и анализировали, используя нанораспылительный времяпролетный масс-спектрометр (Q-TOF, Micromass, Manchester, UK).

Результаты:

Выделение мишени для антитела с использованием 2D-гелей и иммуноблоттинга

Чтобы точно определить положение антигена на 2D-геле, использовали 2D-гели в совокупности с иммуноблоттингом. Проводили сличение двух блотов, в одном из которых использовали иммунную сыворотку, взятую из организма пациента, у которого имелось наибольшее количество антител - его использовали как шаблон для H1L1, и в другом использовали экспрессированный и очищенный H1L1. Оба взаимодействовали с тем же белковым пятном. Один и тот же белок оказался антигенным для четырех пациентов, которые выздоравливали от диареи, вызванной C.difficile.

Выделение белка-мишени с использованием способа хроматографии на колонке

Клинический изолят бактерии C.difficile (упоминаемый здесь как штамм CD 14000287, выделенный из организма пациента, инфицированного C.difficile) анаэробно культивировали в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, дополненным тиогликолевой кислотой и L-цистеин-HCl в течение 48 часов при 37°C. Клеточную суспензию центрифугировали в центрифуге Sorval RC-3B при 5000 об/мин в течение 20 минут до осаждения клеток и клеточный осадок промывали один раз PBS и снова центрифугировали, как указано выше. Промытый клеточный осадок ресуспендировали в PBS и хранили при -20°C до последующего использования. Аликвоту в 2 мл замороженной клеточной суспензии размораживали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут на настольной микроцентрифуге для осаждения клеток, и осажденные клетки ресуспендировали в 4 мл 6 M гуанидин-HCl, pH 8,0. Гуанидиновый экстракт белка осветляли путем центрифугирования при 45000 об/мин на ультрацентрифуге Beckman L8-70M в течение 1 часа при 20°C. Супернатант трижды диализовали при комнатной температуре против 2 литров 20 мM натрийкарбонатного буфера, pH 9,5, для замены буфера экстрагированного белка на сходный для хроматографической колонки AminoLink (поставляемой Perbio). 2 мл раствора антитела H1L1 (~2 мг/мл) в 20 мM карбоната натрия, pH 9,5, ковалентно сшивали со смолой AminoLink, уравновешенной 20 мM карбонатом натрия, pH 9,5, в предварительно набитой 2 мл колонке, следуя инструкциям производителя (Perbio). Экстракт C.difficile, содержащий антиген (1,5 мл), затем наносили на ковалентно сшитую H1L1 колонку и инкубировали со смолой в течение 1 часа при комнатной температуре. Несвязанный материал вымывали с колонки 12 мл 20 мM буфера карбоната натрия, pH 9,5, а связанный антиген элюировали, нанося 8 мл 0,1 M глицинового буфера, pH 2,5-3,0. Элюированный белок нейтрализовали 1 M Tris, pH 9,0, перед концентрированием от 15 мл до ~200 мкл на адаптор-концентраторе производства Amicon. Этот материал концентрированного белка затем анализировали с помощью 10% (вес./об.) ДСН-ПААГ и визуализировали путем окрашивания Кумасси голубым. Окрашенную полосу интерактивного белка H1L1 затем идентифицировали с помощью масс-спектрометра.

Идентификация выделенного белка при помощи масс-спектрометра

Белковую полосу или пятно вырезали из геля и расщепляли трипсином при 37°C. Образцы анализировали, используя наноэлектрораспылительный времяпролетный масс-спектрометр, который давал последовательность SEQ ID NO: 42.

Тот же самый пептид был обнаружен в эксперименте в образцах из 2D-геля, как и из белка, выделенного при использовании хроматографии на колонке.

Исследования генома Clostridium difficile при Sanger Institute с использованием BLAST-анализа дают последовательность SEQ ID NO: 43 в качестве эквивалентной последовательности.

Теоретически - pI 5,74, молекулярный вес 43430,30 Да, что хорошо коррелирует с расположением белка на 2D-геле, где молекулярный вес приблизительно составляет 44 кД, а pI 5,5-6.

Используя белковую последовательность SEQ ID NO: 43 в белок-белковом NCBI BLAST-исследовании и используя обычные установки, обнаружили высокую степень подобия образцу ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза), номер NP_349376, с 68% идентичностью свыше 391 аминокислоты.

Клонирование ацетил-CoA-ацетилтрансферазы

Для клонирования и экспрессии в E.coli последовательность, кодирующую ацетил-CoA-ацетилтрансферазу, ПЦР амплифицировали напрямую из геномной ДНК C.difficile и готовили, используя спин-колонку DNeasy (Qiagen), согласно инструкции по применению.

Используемые ПЦР-праймеры, идентифицированные и предназначенные для прямого сравнения с геномной последовательностью ДНК бактерии C.difficile, кодирующей эквивалентную ацетил-CoA-ацетилтрансферазе последовательность-кандидат, представляют собой SEQ ID NO: 44 и 45, синтезированные с помощью SIGMA Genosys. Амплификацию проводили, используя Taq-ДНК-полимеразу (Invitrogen), допуская прямое независимое от лигирования клонирование в вектор экспрессии pBAD-TA (Invitrogen), доба