Мукозальная вакцина для иммунотерапии заболеваний, обусловленных вирусами папилломы человека, и способ лечения с ее использованием (варианты)

Мукозальная вакцина для иммунотерапии заболеваний, обусловленных вирусами папилломы человека, и способ лечения с ее использованием (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно оно относится к композиции рекомбинантных белков на основе онкобелка Е7 вируса папилломы человека, слитого с белком теплового шока микобактерий Hsp70 в сочетании с хитозаном и фармакологически приемлемыми для изготовления суппозиториев добавками. Также изобретение относится к вакцинотерапии заболеваний, обусловленных вирусами папилломы человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В середине 70-х годов впервые было высказано предположение о возможном участии вирусов папилломы человека (ВПЧ) в патогенезе рака шейки матки и начаты исследования по идентификации вируса в биопсийном материале. Было установлено, что в злокачественных опухолях шейки матки выявляются наиболее часто два типа вирусов - ВПЧ 16 и ВПЧ 18. А в доброкачественных поражениях присутствуют, в основном, вирусы 6 и 11 типов. При дальнейшем изучении роли ВПЧ в неопластических процессах все серотипы были разделены на три группы:

- низкая степень онкогенного риска: 6, 11, 42, 43, 44;

- средняя степень онкогенного риска: 31, 33, 51, 52, 58;

- высокая степень онкогенного риска: 16, 18, 45, 56.

В настоящее время в ряде исследований показано, что ДНК ВПЧ обнаруживается в среднем в 98,9% и 94,7% образцов остроконечных кондилом и цервикального рака соответственно. В популяции у здоровых женщин ВПЧ обнаруживаются в 35% случаев, причем 6, 11, 16 и 18 типы - только в 21,6%. Интересным для дальнейшего изучения оказался и тот факт, что большая часть ДНК ВПЧ 16 в клетках остроконечных кондилом находится в эписомальной форме, а в образцах цервикального рака - интегрирована в клеточный геном. В последние годы в связи с началом применения профилактических вакцин против ВПЧ проведено несколько крупномасштабных эпидемиологических исследований по географическому распределению различных типов ВПЧ в цервикальных пробах от пациентов с инвазивным раком шейки матки (РШМ). Оказалось, что в большинстве случаев во всем мире (65-77%) выявляются ВПЧ 16/18 типов, однако дальнейшее ранжирование типов ВПЧ имеет ярко выраженные географические особенности. Так, например, в Китае следующими по значимости являются ВПЧ 58 и 52 типов, в Африке - ВПЧ тип 45, в Центральной / Южной Америке - ВПЧ тип 31. (Bao Y., Li N., Smith J. and Qiao Y., Human papillomavirus type-distribution in the cervix of Chinese women: a meta-analysis. Int. Journal of STD & AIDS, 19, 2, 106-111; Nubia M., Xavier В., Xavier С.et al., Against which papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective. Int. Journal of Cancer, 2004, 11, 2, 278-285; Ihekweazu С., Worldwide distribution of HPV types in women with normal cervical cytology and in women with cervical adenocarcinoma, Eurosurveillance, 2006, 11, Issue 12.)

Распространение инфекции происходит преимущественно половым путем, достигая максимума инфицирования до 30 лет. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека, и это является «первичным» событием в патогенезе РШМ. Большинство случаев инфицирования заканчивается спонтанным выздоровлением. Однако в некоторых случаях развивается персистирующая инфекция, способная запускать механизмы клеточной трансформации эпителиальных клеток. Так, при CIN 1 наблюдается активная репликация вируса и его бессимптомное выделение. Превращение CIN 1 в инвазивный рак происходит с большой частотой и, как правило, сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина (Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. M.: Компания «Димитрейд График Групп®», 2004).

ВПЧ высокой степени онкогенного риска (преимущественно 16 и 18 типов) обнаруживают в 50-80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% инвазивного рака. Важным обстоятельством является то, что клинические проявления ВПЧ-инфекции не обнаруживаются достаточно длительное время, однако последствия персистенции вируса от этого не становятся более легкими. Развитие легкой и умеренной дисплазии в тяжелую происходит соответственно в 10 и 20% случаев. Такая статистика не является фатальной: переход одной стадии атипии эпителия в другую происходит достаточно долго, что дает большие возможности в плане диагностики и лечения. Кроме того, немаловажным является тот факт, что носительство ВПЧ не является пожизненным: по данным ВОЗ (2001 г.) при отсутствии отягощающих факторов в течение 3 лет плоскоклеточные внутриэпителиальные поражения низкой степени тяжести, содержащие ВПЧ, подвергаются регрессии

в 50-62% наблюдений. По сведениям ученых Калифорнийского университета у 70% молодых ВПЧ-инфицированных женщин ДНК ВПЧ перестает определяться на протяжении 24 месяцев. Скорость элиминации значительно снижается при инфицировании несколькими видами ВПЧ, а также - при наличии в анамнезе кондилом вульвы. В то же время среди женщин, у которых по меньшей степени 3 раза были получены положительные результаты определения ВПЧ, риск тяжелых онкологических поражений эпителия возрастал в 14 раз. Ежегодно в мире регистрируется около 500000 случаев РШМ, из которых около 50% заканчиваются летальным исходом. В Российской федерации по данным Министерства здравоохранения в 2002 было зарегистрировано 11320 случаев рака шейки матки (Молочков В.А., Киселев В.И., Рудых И.В., Щербо С.Н. Папиллома-вирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение, пособие для врачей. М.: Издательский дом «Русский врач», 2004).

Следует отметить, что в последние годы значительно увеличилось количество диагнозов рака прямой кишки, также обусловленного вирусами папилломы человека. Особенное распространение этот вид патологии получил среди мужчин с нетрадиционной сексуальной ориентацией. Отмечены случаи развития рака ротовой полости при занятии оральным сексом с партнером, инфицированным ВПЧ (News.com // в мире // 18 ноября 2004. Оральный секс приводит к заболеванию раком). В большинстве случаев онкологической патологии предшествует образование кондилом слизистой прямой кишки, которое сопровождается кровотечениями при акте дефекации, воспалительными процессами и трещинами анального отверстия.

Современные представления о механизме канцерогенеза, обусловленного ВПЧ

ВПЧ инфицирует и реплицируется в эпителии, что подтверждается обнаружением эписомального вирусного генома в клетках базального слоя эпителия. Жизненный цикл вируса тесно связан с дифференцировкой клетки-хозяина. Репликация вирусной ДНК и синтез капсидных белков вируса происходит в наиболее дифференцированных слоях эпителия, и вирус обладает целым набором механизмов, подчиняющих своим интересам жизнедеятельность инфицированной клетки. ДНК вируса кодирует синтез двух белков - Е6 и Е7, которые индуцируют переход дифференцированных клеток в S-фазу клеточного цикла. На стадии активной репродукции вируса экспрессия генов Е6 и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно поэтому, пока вирус находится в эписомальном состоянии, наблюдаются доброкачественные процессы разрастания инфицированных тканей. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном клеток, которая сопровождается делецией гена Е2. Это событие имеет два важных последствия:

1) в эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ регистрируется сверхэкспрессия генов Е6 и Е7, так как в процессе интеграции утрачивается ген Е2, кодирующий репрессор транскрипции этих генов,

2) любые противовирусные препараты бессильны остановить процесс опухолевой трансформации, так как инфицированные клетки не содержат вирус в традиционном понимании, и все лечебные мероприятия должны быть направлены на элиминацию клеток с интегрированной формой генома ВПЧ.

Контроль клеточного цикла и дифференцировка клеток осуществляется белками Е6 и Е7 посредством их взаимодействия и инактивации таких "ключевых" белков-регуляторов пролиферативной активности и апоптоза клеток, как р53 и белок ретинобластомы (pRB). Бесконтрольная пролиферация инфицированных клеток приводит к накоплению генетических повреждений и, в конечном счете, к малигнизации. Онкобелок Е7 использует несколько путей для регуляции клеточного цикла. Установлено, что Е7 способен образовывать стабильный комплекс с белком pRB, вызывая его деградацию, что приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который стимулирует транскрипцию генов, необходимых для репликации ДНК и S-фазы клеточного цикла. Е7 также влияет на активность целого ряда белков клеточного цикла, как А и Е циклины, cdk2 киназу и ингибиторы циклин-зависимой киназы р21 и р27 (Киселев В.И., Киселев О.И. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы. Цитокины и воспаления. 2003, 2, 4, 31-38; Phelps W.C., Bames J.A. and Loba D.C., Human papillomavirus: molecular targets and prospects for antiviral therapy. International Antiviral News, 1999, 7, 4-8).

Исследования на животных показывают, что гуморальный иммунитет играет определенную роль в защите от ВИЧ-инфекции. Модель вирусоподобных частиц (virus-like particles - VLP), самособирающихся из основного капсидного белка ВПЧ-L1, широко используется для изучения протективной роли вируснейтрализующих антител. Иммунизация животных VLP защищает их от экспериментальной инфекции гомологичными вирусами. Пассивный перенос сыворотки от мышей, иммунизированных VLP, другим экспериментальным животным также оказывает защитный эффект, что подтверждает протективную роль вируснейтрализующих антител (Tindle R.W., Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical cancer. Nature Reviews, 2002, Cancer, 2, 1-7; Zhou J., Liu W.J., Peng S.W. et al. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability, J. Virol., 1999, 73, 4972-4982; Schwarts S. Regulation of human papillomavirus late gene expression, Ups. J. Med. Ski, 2000, 105, 171-192). В случае инфицирования экспериментальных иммунизированных мышей ВПЧ другого типа защитный эффект не регистрировали, что свидетельствует о специфичности наблюдаемого явления и отсутствии перекрестных реакций между различными типами ВПЧ. Более того, денатурация VLP приводила к утрате протективных эффектов, что указывает на роль интактных протективных эпитопов в индукции антителогенеза. Другой поздний ген, кодирующий минорный капсидный белок L2, также исследовался как потенциальный кандидат для профилактической вакцинации. Было установлено, что иммунизация животных гибридным рекомбинантным белком L2 индуцирует высокий титр нейтрализующих антител и защищает от экспериментальной папиллома-вирусной инфекции. Таким образом, накопившиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что капсидные белки ВПЧ являются перспективными кандидатами для создания профилактической вакцины (Nees M. et al. Papillomavirus type 16 oncogenes down-regulate expression of interferon-responsive genes and up-regulate proliferation-associated and NF-kB- responsive genes in cervical keratinocytes. J. Vir., 2001, 75, 4283-4296; Barnard P., Payne E. & McMillan N.A. The human papillomavirus E7 protein is able to inhibit the antiviral and anti-growth functions of interferon-a. Virology, 2000, 277,

411-419). Однако при использовании данных белков для терапевтической иммунизации при устоявшейся, хронической папиллома-вирусной инфекции не удалось получить сколько-нибудь значительного эффекта. Видимо, для лечебной иммунизации необходима другая стратегия, а именно - индукция антиген-специфического Т-клеточного иммунного ответа. Имеющиеся данные позволяют надеяться, что стимуляция клеточной составляющей иммунитета по отношению к неструктурным вирусным белкам может привести к регрессии развивающейся опухоли.

Наблюдения, подтверждающие обоснованность данного предположения, можно разделить на четыре группы:

1. Встречаемость ВПЧ - ассоциированных заболеваний существенно выше среди больных трансплантационных клиник (Park J.S. et al. Inactivation of interferon regulatory factor-1 tumor suppressor protein by HPV E7 oncoprotein. Implication for

the E7-medated immune evasion mechanism in cervical carcinogenesis. J. Biol. Chem 2000, 275, 6764-6769) и ВИЧ-инфицированных, т.е. в случаях с глубокими нарушениями клеточного иммунитета (Frazer I., et al. Systemic administration of bacterial products induces host protective specific immunity to an epithelial tumour antigen. J Immunol., 2000, 167, 6180-6187, Doan Т. et al. Human Papillomavirus Type 16 E7 Oncoprotein Expressed in Peripheral Epithelium Tolerizes E7-Directed Cytotoxic T-Lymphocyte Precursors Restricted through Human (and Mouse) Major Histocompatibility Complex Class I Alleles. J. Virol., 1999, 73, 6166-6170).

2. Экспериментальные животные, иммунизированные неструктурными белками ВПЧ, эффективно защищены от ВПЧ инфекции и развития неопластических процессов (Gtannini S. et al. Cytokine expression in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix: implications for the generation of local immunosuppression. din. Exp. Immunol., 1998, 113, 183-189).

3. При спонтанной регрессии генитальных бородавок наблюдается интенсивная инфильтрация окружающих тканей CD₄₊ (Т-хелперы) и CD₈₊ (цитотоксическими) Т-клетками (Ressing M.E. et al. Human CTL epitopes encoded by human papillomavims type 16 E6 and E7 identifed through in vitro and in vivo immunogenicity studies of

HLA-A'0201-binding peptides. J. Immunol., 1995, 154, 5934-5943).

4. Кожные повреждения, ассоциированные с ВПЧ у больных, получающих иммуносупрессивную терапию, часто исчезают при отмене курса лечения (Lee. S.J. et at. Both E6 and E7 oncoproteins of human papillomavims 16 inhibit IL-18-induced IFN-y production in human peripheral blood mononuclear and NK cells. J Immunol.,

2001, 167, 497-504).

Представленные данные свидетельствуют в пользу того, что специфическая стимуляция Т-клеточного иммунитета может приводить к полной ремиссии ВПЧ-ассоциированных заболеваний. В связи с этим практическая задача при создании лечебной вакцины сводится к стимуляции Т-клеточного иммунитета по отношению к неструктурным белкам ВПЧ, таким как белки E6 и E7.

Основное требование к терапевтическим вакцинам состоит в том, что они должны стимулировать клеточную составляющую специфического иммунитета и блокировать развитие неопластических процессов. Теоретически клеточная реакция должна быть направлена на вирусные и клеточные белки, участвующие в малигнизации эпителия. Однако несмотря на интенсивные исследования довольно мало известно о клеточных мишенях при опухолевой трансформации, поэтому большинство экспериментальных вакцин направлено на продукты генов Е6 и E7 ВПЧ, роль которых в онкогенезе доказана однозначно.

Поскольку белки Е6 и E7 конститутивно экспрессируются в большинстве клеток РШМ и отсутствуют в нормальной ткани, эти вирусные онкобелки рассматриваются как наиболее перспективные мишени при разработке вакцин для терапии ВПЧ-ассоциированных опухолей (Straght S.W., Herman В. & McCance D.J. The E5 oncoprotein of human papillomavirus type 16 inhibits the acidification of endosomes in human keratinocytes. J Virol, 1995, 69, 3185-3192).

Мишенью для иммунотерапии опухолей, как правило, являются нормальные или мутантные клеточные белки, тогда как белки Е6 и E7 являются абсолютно чужеродными для иммунной системы хозяина и в силу этого должны быть весьма иммуногенными (Przepiorka D. and Srivastava P., Heat Shock Proteins - Peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Molecular medicine today, 1998, 11, 478-484).

Следующая причина, по которой белки Е7 и Е6 рассматриваются как перспективные кандидаты для вакцинации, состоит в том, что многие опухоли в процессе иммунотерапии могут утрачивать белки-мишени, ускользая, таким образом, от иммунной атаки и сохраняя при этом свой трансформированный статус, тогда развитие РШМ однозначно обусловлено экспрессией белков Е6 и Е7 и их нейтрализация приведет к регрессии опухоли.

Разработка пептидных вакцин сдерживается тем обстоятельством, что до настоящего времени еще точно не определены эпитопы в белках Е6 и Е7, способные индуцировать цитотоксический иммунитет. Поэтому основные усилия сосредоточены на конструировании белковых вакцин с использованием рекомбинантных белков Е7 и Е6.

Последние исследования показывают, что более предпочтительной мишенью для создания вакцин является белок Е7 ВПЧ 16 и 18 типа для рака шейки матки и Е7 ВПЧ 6 типа для анальных кондилом, так как он обладает наименьшей структурной вариабельностью в различных географических изолятах ВПЧ и не имеет сплайсинг-вариантов (Swan D.C., Rajeevan M., Tortolero-Luna G., et al. Human papillomavirus type 16 E2 and E6/E7 variants, Gynecol. Oncol. 2005, 96, (3) 695-700).

Показано, что рекомбинантный белок Е7 ВПЧ 16 типа способен индуцировать цитотоксический иммунитет, и инъекция этого белка в сочетании с различными адъювантами усиливает цитотоксическую реакцию.

В последние годы особенно популярна новая стратегия повышения иммуногенности Е7, состоящая в конструировании гибридных белков. В частности, были изучены иммунологические свойства гибридного белка, содержащего полную последовательность белка теплового шока Hsp70 и белка Е7 ВПЧ. Иммуногенность и протективность такой конструкции была существенно выше, вероятно за счет того, что Hsp 70 M. tuberculosis обеспечивает эффективную презентацию антигенов (Becker Т., Harti F., and Wieland F., CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70 - peptide complexes, J.Cell Biology, 2002, 158, 1277-1285).

Известно, что Е7 синтезируется в малых количествах на репродуктивной фазе жизненного цикла ВПЧ. Однако его синтез значительно возрастает после интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, так как этот процесс, как правило, сопровождается утратой гена E2, кодирующего репрессор гена Е7. Несмотря на это в организме не наблюдается индукция специфического клеточного иммунитета в отношении белка Е7. Некоторые экспериментальные модели позволяют пролить свет на удивительную способность онкобелка Е7 индуцировать толерантность.

Если кожный трансплантат от трансгенной мыши, синтезирующий Е7 в эпителиальных клетках, пересадить генетически родственной мыши, то ожидаемое отторжение трансплантата не происходит. Если же мыши ввести стимулирующие образования противовоспалительных цитокинов (убитые бактерии или эндотоксины), то наступает быстрое отторжение трансплантата. Однако отторжение трансплантата на фоне введения индукторов цитокинов происходит только в период приживления трансплантата, а повторная пересадка трансплантата той же мыши приводит к отторжению без дополнительной индукции цитокинов. Высказываются разные предположения о механизмах этого явления, однако все они сходятся в одном - антигенпрезентирующие клетки, поглощающие Е7 в зоне цервикального канала, по каким-то причинам не могут пройти все необходимые этапы созревания, мигрировать в лимфатические узлы и индуцировать Т-клеточный иммунный ответ в отношении этого белка без дополнительной стимуляции цитокинового каскада (Gross G., Joblonska S., Pfister H. Genital papillomavirus infections, 1989; Frazer I. et al. Systemic administration of bacterial products induces host protective specific immunity to an epithelial tumour antigen, JImmunol., 2001, 167, 6180-6187).

Постоянный синтез онкобелков необходим для поддержания опухолевого фенотипа клеток. Очевидно, что появление в организме клеток, несущих чужеродные антигены (Е6 или Е7), должно индуцировать соответствующие иммунные реакции. Однако больные с цервикальными карциномами имеют очень низкий уровень Т-клеточного иммунитета в отношении Е6 и Е7.

При вакцинации этими белками также не наблюдается выраженной реакции несмотря на хорошие характеристики иммунного статуса. Эти наблюдения, а также эксперименты на животных показывают, что онкобелок Е7, синтезирующийся в эпителиальных клетках, способен «ускользать» или даже супрессировать иммунные реакции в отношении себя.

При создании любой противоопухолевой вакцины необходимо решить несколько принципиальных задач. Во-первых, определить мишень, против которой необходимо индуцировать иммунные реакции организма. В случае ВПЧ инфекции по общему мнению такой мишенью является белок Е7 (Киселев В.И., Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М.: Компания «Димитрейд График Групп®», 2004).

Не менее важной задачей является выбор адъюванта для индукции устойчивого протективного иммунитета и способа введения вакцинного препарата. Последнему обстоятельству уделяется большое внимание, так как оказалось, что от способа введения вакцины существенно зависит ее эффективность. Как уже упоминалось, ВПЧ-инфекции поражают слизистые как в случае рака шейки матки, так и при РРП и раке прямой кишки. Однако разработанные к настоящему времени вакцинные препараты предназначены для подкожного введения, то есть нацелены на специфическую стимуляцию системного иммунитета и игнорируют мукозальные иммунные реакции (Патент US 6338952 B1, 2002. Stress proteins and uses therefore; Патент РФ №2229307, Пальцев М.А., Северин Е.С., Киселев О.И., Киселев В.И., Свешников П.Г. Композиция рекомбинантных белков, способ получения такой композиции, фармацевтический набор реагентов для иммунотерапии и профилактической вакцинации опухолевых заболеваний аногенитальной сферы, способ иммунотерапии и профилактической вакцинации на его основе). На основе американского патента компания "Nventa" разрабатывает инъекционную форму вакцинного препарата, содержащего белок Е7, «слитый» с белком теплового шока М tuberculosis с молекулярной массой 65 kDa. С нашей точки зрения существенным недостатком данной конструкции является выбор белка 65 kDa, так как имеются убедительные данные о возможности индукции аутоиммунных реакций у человека при введении этого белка. Кроме того, данный белок теплового шока уступает по своим адъювантным свойствам белку Hsp70 М tuberculosis (Zugel U. and Kaufmann S., Role of heat shock protein in protection from and pathogenesis of infectious deseases, Clinical microbiology reviews, 1999, 12, 1, 19-39).

В патенте РФ №2229307 описана разработка вакцины на основе гибридных белков Е7 и Hsp70 М tuberculosis. Авторы описывают инъекционную лекарственную форму, с помощью которой удается добиться регрессии опухолей, индуцированных вирусом, на экспериментальных моделях с перевиваемыми опухолями. Продемонстрированная эффективность вакцинации на этих моделях подтверждает правильность выбора белка Е7 как молекулярной мишени, против которой индуцируются иммунные реакции. Однако при цервикальных дисплазиях, развивающихся у женщин вследствие хронической папиллома-вирусной инфекции шейки матки, индукция системного иммунитета не может гарантировать регрессию процессов малигнизации, так как шейка матки обладает определенной обособленностью от системного иммунитета в регуляции местных иммунологических реакции. В развитии анальных кондилом белок Е7 также играет основную роль в процессах малигнизации и подавлении местных иммунологических реакций. Поэтому мукозальная аппликация вакцины должна приводить к нейтрализации белка Е7 и индуцировать регрессию патологических процессов. Кроме того, в настоящее время становится очевидным, что добиться устойчивого протективного иммунитета с помощью рекомбинантных вакцин можно только при многократной иммунизации. Это создает значительные организационные трудности, так как пациенту необходимо многократно посещать клинику для проведения вакцинации. В случае вагинальной вакцинации пациент может делать это самостоятельно. Другая проблема, связанная с инъекционной формой вакцинации, состоит в том, что при повторном внутримышечном введении чужеродного белка высока вероятность анафилактического шока, что исключается при вагинальном или ректальном способе введения препарата.

Наконец, еще одно достоинство мукозальных вакцин состоит в преимущественной индукции местного мукозального иммунитета, что и требуется при патологиях, поражающих слизистые, как в случае с папиллома-вирусной инфекцией.

В качестве лекарственной формы для мукозальной аппликации вакцин можно рассматривать суппозитории или "спреи", которые позволяют наносить на слизистую вакцинный препарат в виде лиофилизированного порошка.

Раскрытие настоящего изобретения

Авторы предложенного изобретения на основе многолетних исследований папилломатоза пришли к выводу, что оптимальная вакцина для терапии заболеваний, ассоциированных с вирусами папилломы человека, должна отвечать следующим требованиям:

1. Способ введения должен предусматривать стимуляцию местного адаптивного и врожденного иммунитета, а именно: в случае РШМ - способ введения вагинальный; в случае рака прямой кишки - способ введения ректальный.

2. С учетом низкой иммуногенности белка Е7 в составе рекомбинантного белка, являющегося действующим веществом вакцинного препарата, должны присутствовать аминокислотные последовательности белков, обладающих иммуномодуляторным действием, на образование цитокинов и улучшающих презентацию антигена Е7.

3. Лекарственная форма вакцинного препарата должна содержать ингредиенты, повышающие адгезию на слизистых и сродство белковых компонентов вакцины к антиген-презентирующим клеткам.

С целью решения поставленной задачи в настоящей работе были разработаны две лекарственные формы вакцины для иммунотерапии ВПЧ-ассоциированных патологий. Так, для терапии заболеваний аногенитальной сферы разработаны мукозальные вакцины в виде суппозиториев.

Для терапии рака шейки матки были разработаны суппозитории, содержащие в качестве основных антигенов гибридные белки Е7 тип 16 или тип 18, слитые с Hsp70 М tuberculosis. Гибридный белок представляет собой единую полипептидную цепь, состоящую из первого белка - Е7 ВПЧ типа 16 или 18. Как уже установлено в настоящее время, онкобелок Е7 является основным индуктором процессов малигнизации эпителиальных клеток, инфицированных вирусами папилломы человека (Yin E.K. and Park J.S., The role of HPV E6 and Е7 oncoproteins in HPV-associated cervical carcinogenesis, Cancer Res. Treat., 2005, 37, 6, 319-324). Кроме онкогенного потенциала белок Е7 обладает выраженными иммуносупрессивными свойствами. Именно благодаря белку Е7 трансформированным клеткам удается "ускользать" от иммунных реакций организма (Kanoda S., Fahey L.M. and Kast W.M., Mechanism used by papillomaviruses to escape the host immune response. Current Cancer Drug Targets, 2007, 7,

79-89). Именно по этим причинам белок Е7 является оптимальной мишенью для иммунотерапии. Другая часть этого белка представлена белком теплового шока из М tuberculosis, обладающим высоким сродством к антиген-презентирующим клеткам и являющимся мощным индуктором синтеза цитокинов (Przepiorka D. and Srivastava P., Heat Shock Proteins - peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Molecular medicine today, 1998, 478-484; Becker Т., Hard F.LL, and Wieland F., CD40, an extractllular receptor for binding and uptake of Hsp70 - peptide complexes. The Journal of cell biology, 2002, 158, 7, 1277-1285; Srivastava P., Interaction of Heat Shock Proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses, Annu. Rev. Immunology, 2002, 20, 395-425; Lachmann H.J., Strangeways L., Vyakarmam A and Evans G. Raising antibodies by coupling peptides PPD and immunizing BCG-sensitized animals. Ciba Found. Symp., 1986, 119, 25-27; Del Giudici G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity, Experimentia, 1994, 50, 1061-1066).

В случае рака прямой кишки целесообразно использовать в качестве антигена белок Е7 тип 6, который чаще других типов ВПЧ встречается при поражении слизистой прямой кишки.

Проведенные нами экспериментальные исследования иммуногенности гибридных белков при их аппликации на слизистые показало, что в изолированном виде эти белки не способны индуцировать выраженный протективный иммунитет в отношении белков Е7. Нами было сделано предположение, что причина низкой иммуногенности полипептидов состоит в их неспособности сорбироваться на эпителии слизистых, вследствие чего они могут подвергаться быстрой протеолитической деградации. Для решения этой проблемы было решено использовать комплексы белков с хитозаном. При экспериментальной проверке этого предположения оказалось, что комплекс гибридных белков с хитозаном, обладающим выраженным мукоадгезивным свойством и способствующим активной сорбции антигенов на клеточной поверхности, эффективно индуцирует как гуморальную, так и клеточную составляющую иммунитета в отношении белков Е7.

Исходя из этого в состав вакцин в качестве адгезивного средства, способствующего проникновению антигенов через слизистые, и сильного стимулятора неспецифических иммунных реакций включен хитозан в соотношении белок:

хитозан 1-1 до 1-10. Оптимальное соотношение белка и хитозана в составе лекарственной формы было исследовано экспериментально. Установлено, что максимальный эффект в индукции иммунологических реакций в отношении антигенных детерминант белков наблюдался при использовании соотношения в диапазоне 1-1 до 1-10. При уменьшении или увеличении концентрации хитозана по отношению к фиксированной дозировке белка наблюдалось снижение эффективности индукции иммунологических реакций.

Для изготовления суппозиториев использовались следующие фармакологически приемлемые добавки: Витепсол, масло какао или твердый жир типа А - в качестве липофильной основы, полиэтиленгликоли различной молекулярной массы - в качестве гидрофильной основы, Нипагин, нипазол или аминогликозиды - в качестве антимикробного средств, янтарная кислота и бензоат натрия - в качестве стабилизаторов или консервантов, мертиолят и тиомерсал в качестве стабилизаторов и антимикробных средств (патент RU 2224542 С2, А61К 39/116, 9/02, А61Р 13/00; постановление правительства РФ №885 от 02.08.1999 г.; патент RU 2150268, А61К 9/02, А61К 35/74, А61Р 15/02; «Мертиолят и вакцинация против гепатита В», журнал «Медицина для всех», №1, 2001; Patrizi A., Rizzoli L., Vincenzi С. et al. Sensirization to thimerosal in atopic children. Contact Dermatitis, 1999, 40(2), 974-979).

Настоящее изобретение относится также к способам лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, предусматривающим местное применение мукозальной вакцины. Как вариант для лечения дисплазии шейки матки, вызванной вирусом папилломы человека, используется гибридный белок Е7

тип 16-Hsp70 или Е7 тип 18-Hsp70 в сочетании с хитозаном в соотношении 1:0,1-10 и фармакологически приемлемыми добавками. Изготовленный суппозиторий вводят интравагинально. В зависимости от стадий заболевания суппозитории назначают 2-4 раза с интервалом в неделю при легкой дисплазии шейки матки и 4-8 раз с интервалом в одну неделю с дисплазиями 2-й и 3-й степени. Для лечения анальной кондиломы используется гибридный белок Е7 тип 16-Hsp70 или Е7 тип 6-Hsp70 в сочетании с хитозаном в соотношении 1:0,1-10 и фармакологически приемлемыми добавками. Изготовленный суппозиторий вводят ректально. Суппозитории назначают на ночь с периодичностью раз неделю. Максимальный клинический эффект достигается при назначении 4-8 суппозиториев.

Региональные варианты вагинальных суппозиториев для лечения РШМ

С учетом особенностей географического распределения и для достижения максимальной эффективности региональные варианты для лечения РШМ должны содержать следующие комбинации рекомбинантных гибридных белков Е7 Hsp70 в составе вагинального суппозитория:

1. Глобальная пентавалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е758, Е731, Е745, слитых с Hsp70.

2. Китайская тетравалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е758, Е752, слитых с Hsp70.

3. Латиноамериканская тривалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е731, слитых с Hsp70.

4. Африканская тривалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е745, слитых с Hsp70.

5. Для остального мира (Европа, Северная Америка, Австралия) бивалентный вариант на основе Е716, Е718, слитых с Hsp70.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет многократно повысить эффективность лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека. Полученный эффект достигается за счет преимущественной индукции местных иммунологических реакций вследствии мукозальной аппликации рекомбинантных белков в комплексе с хитозаном. Именно это сочетание активных компонентов вакцины обеспечивает их высокое сродство к эпителиальным клеткам слизистых, инфицированных ВПЧ, активное распознавание антигенов иммунной системой и, как следствие, индукцию местного иммунитета в отношении белков Е7, играющих ключевую роль в развитии патологических процессов. Использование предложенной мукозальной вакцины позволяет значительно снизить стоимость лечения по сравнению с известными методиками лечения РШМ и РПК. Предложенная вакцина предназначена для местного применения, что позволяет устранить нежелательные и крайне опасные для жизни пациента побочные эффекты инъекционных препаратов, например анафилактический шок. Предложенный метод терапии значительно упрощает лечебный процесс - пациент может проходить курс лечения вне клиники, самостоятельно вводя препарат.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами:

Фигура 1. Динамика сывороточного IgG иммунного ответа при разных способах иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70.

Фигура 2. Величины мукозального нормированного IgA антительного ответа при интраназальной и подкожной иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70.

Фигура 3. Уровень секреции IFN-gamma(1) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов (А) и селезенки (Б), стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е718.

Фигура 4. Уровень секреции IFN-gamma(1) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов, стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е76.

Осуществление настоящего изобретения

Пример 1

Приготовление вакцинных препаратов на основе рекомбинантных белков для мукозального применения с хитозаном

Рекомбинантные гибридные белки E716-Hsp70 (SEQ ID NO:2), E718-Hsp70 (SEQ ID NO:4), E76-Hsp70 (SEQ ID NO:6) очищали из телец включения путем солюбилизации в 8М мочевине с последующей металлохелатной и ионообменной хроматографией до гомогенного состояния. Степень чистоты белка контролировали при помощи электрофореза в 10% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, концентрацию белка определяли по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Перед приготовлением вакцинного препарата рекомбинантный гибридный белок (РГБ) подвергали диализу для удаления консервантов и стабилизаторов против фосфатно-солевого буферного раствора (PBS, рН 7.2), разбавляли или концентрировали до необходимой концентрации и проводили стерилизующую фильтрацию. После этих процедур растворы рекомбинантных белков смешивали с раствором хитозана в различных пропорциях и использовали для изготовления суппозиториев.

Пример 2

Иммунизация мышей и взятие проб

Использовали взрослых самок мышей (возраст 6-8 недель) линии Balb/c (Питомник РАМН «Столбовая») в количестве 5 штук на группу. Иммунизацию производили трижды с интервалами в 4 недели (0-28-56 день). При проведении интраназальной иммунизации мышам вводили 20 мкл препарата РГБ с хитозаном (по 10 мкл в каждую ноздрю) при помощи микропипетки под галотановым наркозом. Для вагинальной и ректальной иммунизации с помощью микропипетки вводили 10 мкг белка в комплексе с хитозаном в объеме 20 мкл. Подкожную иммунизацию проводили в холку мышей путем инъекции 200 мкл суспензии РГБ с Alhydrogel. (Для подкожной (s.c) вакцинации препараты РГБ адсорбировали на 0.5% (вес/вес) геле алюминия гидроксида (Alhydrogel, Brenntag Biosector, Дания) в течение ночи.) В обоих случаях доза РГБ на каждую иммунизацию составляла 10 мкг белка на одну мышь. Контрольные группы мышей были иммунизированы аналогичным образом с использованием 0.5% (вес/объем) раствора хитозана и 0.5% (вес/вес) раствора Alhydrogel для интраназального и подкожного способа введения соответственно.

Пробы крови для определения специфических IgG брали из ретроорбитальной вены каждой мыши при помощи пастеровской пипетки в объеме 0.1 мл через 10 дней после первой, второй и третьей иммунизации. После ретракции сгустка сыворотку отделяли низкоскоростным центрифугированием и хранили при температуре -20°С до исследования в ИФА.

Носоглоточные смывы для определения специфичных IgA получали через 14 дней после третьей иммунизации. С этой целью мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации, декапитировали и промывали носоглотку со стороны трахеи при помощи 0.5 мл PBS. Носоглоточные смывы хранили при температуре -20°С до исследования в ИФА. Для изучения Т-клеточного иммунного ответа на рекомбинантные белки и пептидные эпитопы мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 14 дней после третьей иммунизации и асептически извлекали легкие, селезенку и лимфатические узлы средостения. Культуры лимфоцитов получали путем аккуратного механического измельчения тканей, лизиса эритроцитов и трехкратной отмывки клеток низкоскоростным центрифугированием в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки. 20 мМ L-глутамина и антибиотиков.

Пример 3

Сравнение специфического IgG и IgA антительного иммунного ответа при интраназальной и подкожной иммунизации РГБ E76-Hsp70

Мышей иммунизировали РГБ E76-Hsp70 интраназально и подкожно в соответствии с протоколом и дозировкой, описанными в примере №3. Среднегеометрические титры (СГТ) IgG и IgA антител, специфичных к рекомбинантному белку Е76, в сыворотках и носоглоточных смывах, полученных согласно процедуре из примера №2, определяли при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения сывороточных IgG на 96-луночном планшете иммобилизовали рекомбинантный белок Е76 из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в PBS в течение ночи, проводили титрование мышиных сывороток путем трехкратных последовательных разбавлений и вносили пероксидазный конъюгат козьих антител против IgG (Н) мыши. В качестве субстрата использовали ТМБ, оптическую плотность (OD) регистрировали через 15 мин при длине волны 450 нм. Титр специфических IgG антител для каждой сыворотки определяли по конечной точке, которая соответствовала разведению сыворотки с OD>0.2. Результаты приведены на фигуре 1.

Фигура 1 отображает динамику сывороточного IgG иммунного ответа при разных сп