Применение тетрапептида pro-gly-pro-leu в качестве средства профилактики и лечения диабета, способ профилактики и лечения диабета и фармацевтическая композиция для профилактики и лечения диабета

Применение тетрапептида pro-gly-pro-leu в качестве средства профилактики и лечения диабета, способ профилактики и лечения диабета и фармацевтическая композиция для профилактики и лечения диабета

Реферат

Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы для лечения сахарного диабета.

Известно, что ряд регуляторных пролинсодержащих пептидов (Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro) тормозят свертывание крови и тромбообразование (Ашмарин и др., 1998; 2002). Такие пептиды постоянно образуются в организме при деградации и синтезе коллагена и других белков (Ульянов и др., 2005), что позволяет рассматривать их как эндогенные соединения. При хроническом введении животным (крысам) в течение 7 суток пептидов Pro-Gly-Pro, Pro-Gly, Phe-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg и Gly-Pro-Arg обеспечивалось сохранение нормального статуса инсулярной системы и соответственно уровня нормогликемии в крови. Пролинсодержащие пептиды защищают организм животных от спровоцированного аллоксаном экспериментального диабета вследствие проявления антитоксического эффекта против вводимого аллоксана.

Показано, что аминокислота лейцин играет важную роль в мутациях митохондриального гена как причины диабета (Балаболкин и др., 2000). Лейцин способствует гипогликемическому эффекту, так как по данным J.V.Cohen, D.C.De Vivo, D.G.Cogan, J.F.Crigler (1967), A.Duttaroy et al. (2005) он стимулирует выработку инсулина, что дает возможность больному диабетом поддерживать нормогликемию крови. Наряду с этим имеются сообщения, указывающие, что фруктоза усиливает биологическую гипогликемическую активность лейцина (Биохимия питания).

Известен природный трипептид Pro-Gly-Pro, обладающий протекторной антидиабетогенной и антитромботической активностью (Патент РФ №2252778). Данный известный пептид может использоваться в качестве профилактики и лечения диабета, и он является прототипом предлагаемого изобретения.

Недостатком известного прототипа является его недостаточная стабильность в организме под действием N- и С-концевых монопептидаз, а также пероральная форма введения, что требует повышенных доз.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является повышение эффективности профилактики и лечения диабета. Эта задача решается тем, что в способе профилактики и лечения диабета предлагается тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu, содержащий лейцин в эффективном количестве.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение. Исследования проведены на экспериментальных животных.

Пример 1. Эксперименты были проведены на 80 экспериментальных животных, содержащихся на естественном лабораторном рационе. Выявление профилактического антидиабетогенного действия тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu проводили следующим образом. Крысам-самцам с массой тела 220-280 г вводили интраназально в течение 7 суток через каждые 24 часа тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu в дозе 1 мг/кг массы тела (опытная группа) в объеме 0,05 мл физиологического раствора или 0,85%-ный раствор NaCl (контрольная группа). Через 1 час после последнего введения тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu у животных брали кровь на анализы и вводили токсичный диабетогенный метаболит аллоксан в дозе 37,5 мг/кг. Далее проводили анализ крови животных через 7, 14 и 21 сутки после введения аллоксана. Полученные данные анализов показателей крови приведены в таблице 1.

Таблица 1Динамика изменений показателей крови при интраназальном введении тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu (7 суток) с последующим введением аллоксана и развитием инсулинзависимого сахарного диабета.
Показатели гемостаза	Сроки (сутки)
Опыт	Контроль
Через 7 сут введения тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu до введения аллоксана	Через 7 сут	Через 14 сут	Через 21 сут	Через 7 сут после введения NaCl	Через 7 сут	Через 14 сут	Через 21 сут
после отмены применения тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu и введения аллоксана
после введения аллоксана
СФА, мм2	43,0±1,2**	36,3±1,0**	35,5±0,8**	-	35,2±0,9	25,0±0,9	23±0,4	-
НФ, мм2	30,8±1,1**	25,2±0,7**	23,8±0,9**	-	23,7±1,0	18,0±1,0	17,3±0,7	-
Агрегация тромбоцитов, %	98%	113%	94,5%	81%*	100%	100%	100%	100%
АЧТВ, сек	34,5±0,7**	34,4±0,82**	26,1±0,85*	30,1±1,5*	30,7±0,95	27,1±1,85	24,1±2,24	25,7±3,6
Хагеман-зависимый фибринолиз	4,25±0,8	3,6±0,4**	2,9±0,3**	-	4,5±0,9	4,25±0,3	7,45±0,85	-
Уровень сахара, мг %	80,0	110,5**	118**	112,0**	84,3	332,5	198,5	235,7
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0,85%-ным раствором NaCl.*р<0.05, **р<0.01. Где: Суммарная (СФА) и неферментная (НФ) фибринолитическая активность, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).

Как видно из данных таблицы 1, через 7 суток после отмены применения тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu и отмены введения аллоксана установлено увеличение СФА в 1,45 раза, НФ - в 1,4 раза, Хагеман-зависимого фибринолиза - в 1,2 раза, АЧТВ - в 1,4 раза, агрегация тромбоцитов практически не изменилась по сравнению с контролем. У контрольных животных в этот период времени уровень сахара был повышен в 3,3 раза по сравнению с тем же показателями в опытной группе крыс.

Через 14 суток после введения аллоксана на фоне введенного тетрапептида отмечалась та же картина, т.е. СФА была повышена в 1,6 раза, НФ - в 1,38 раза, Хагеман-зависимый фибринолиз - в 2,5 раза, АЧТВ - в 1,1 раза по сравнению с теми же параметрами в контрольной группе крыс в этот промежуток времени. При этом отмечалось некоторое снижение агрегации тромбоцитов в крови опытных крыс.

Уровень сахара при этом в контроле превышал тот же показатель опытной группы крыс в 1,65 раза. Через 21 день после введения аллоксана уровень сахара в контрольной группе оставался повышенным в 2 раза по сравнению с опытом. Обращает на себя внимание факт снижения агрегации тромбоцитов в крови опытных крыс только в отдаленные сроки после отмены введения тетрапептида (через 21 день) (таблица 1).

Через 28 дней после введения аллоксана в опытной группе крыс уровень сахара составлял 157 мг %. К этому времени выживаемость крыс в опыте составляла 60%, в контрольной группе все крысы погибли (выживаемость 0%).

Таким образом, тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu при его многократном в течение 7 суток интраназальном введении в ежедневной дозе 1 мг/кг предупреждает развитие экспериментального инсулинзависимого диабета при провокации его аллоксаном и оказывает защитное антитромботическое действие, повышая антикоагулянтную и все виды фибринолитической активности (суммарной, неферментативной, Хагеман-зависимой). Интраназальное применение 0,85%-ного раствора NaCl вместо тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu в данных условиях эксперимента приводило к развитию инсулинзависимого диабета.

Пример 2. Установление лечебного антидиабетогенного и противосвертывающего действия тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu проводили следующим образом. Сахарный диабет у беспородных белых крыс-самцов в возрасте 8-9 месяцев с массой тела 220-280 г вызывали однократной инъекцией в v.jugularis раствора аллоксана фирмы "Spofa" (Чехия) в дозе 37,5 мг/кг после 18-24 часов голодания животных. Эксперименты были проведены на 40 животных, содержащихся на естественном лабораторном рационе.

Сначала животным вводили внутривенно аллоксан, через 4 суток брали кровь на анализы, затем интраназально опытной группе крыс вводили тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu в ежедневной дозе 1 мг/кг, а контрольной группе подобным же образом - 0,85%-ный раствор NaCl в течение 6 суток через каждые 24 часа. Взятие крови осуществляли из v.jugularis в количестве 2 мл с использованием в качестве консерванта 3,8%-ный раствор натрия лимоннокислого в соотношении кровь: консервант как 9:1.

Далее брали кровь на анализы через 1 час после последнего введения пептидов и спустя 10, 17 и 24 суток после введения аллоксана.

Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, при слабом развитии сахарного диабета (в контроле уровень сахара повышался с 98,3 до 118,2 мг % - на 10 сутки после введения аллоксана; до 140,0 мг % - на 17 сутки и до 153,8 мг % - на 24 сутки после введения аллоксана) у контрольных животных снижались параметры антикоагулянтной и фибринолитической активности и повышалась агрегация тромбоцитов. В то же время у опытных животных, получавших тетрапептид Рrо-Gly-Pro-Leu, уровень сахара оставался в норме на протяжении 24 суток наблюдения, а показатели гемостаза - антикоагулянтная, фибринолитическая активность и агрегация тромбоцитов соответствовали уровню, наблюдаемому у здоровых крыс.

Таким образом, продемонстрировано, что многократное в течение 6-ти суток интраназальное применение тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu через 4 суток после введения животным диабетогенного аллоксана защищало организм от развития сахарного диабета и способствовало нормализации основных параметров гемостаза. В контроле (интраназальное введение 0,85%-ного физиологического раствора на фоне введенного аллоксана) наблюдалось развитие инсулинзависимого диабета, о чем свидетельствовало повышение уровня сахара в крови, снижение антикоагулянтного и фибринолитического звеньев противосвертывающей системы и повышение агрегации тромбоцитов.

Пример 3. Сравнение лечебного антидиабетогенного действия трипептида Pro-Gly-Pro при интраназальном введении с тетрапептидом Pro-Gly-Pro-Leu проводили следующим образом. Предварительно у всех крыс (опытных, получавших раствор трипептида, и контрольных, получавших 0,85%-ный раствор NaCl) вызывали сахарный диабет однократной инъекцией в v.jugularis раствора аллоксана фирмы "Spofa" (Чехия) в дозе 37,5 мг/кг после 18-24-часового голодания животных. Через 4 суток после развития диабета и установления повышения уровня сахара в крови животных опытным группам крыс вводили интраназально в течение 5-ти суток через каждые 24 часа по 0,05 мл трипептида Pro-Gly-Pro в дозе 1 мг/кг массы тела. Контрольным группам крыс в течение этого срока вводили 0,85%-ный раствор NaCl в объеме 0,05 мл на 200 г массы тела: либо интраназально, либо внутрибрюшинно. Анализ крови на уровень сахара и на показатели гемостаза производили через 8 и 20 суток после отмены введения пептида. Кровь на анализы брали через 1 час после последнего пятого введения пептидов и через 8 и 20 суток после отмены введения препаратов. Уровень сахара в крови животных определяли по методу Л.С.Канторовича (Бюллетень Изобретений и товарных знаков, 1963). В таблице 3 приведены экспериментальные данные по уровню сахара в крови экспериментальных животных в проведенных экспериментах.

Таблица 3Уровень сахара (мг %) в крови крыс в разные сроки после ежесуточного в течение 5 суток введения пептида Pro-Gly-Pro в дозе 1 мг/кг на фоне развития аллоксанового диабета
Группы крыс	Условия опыта	Статистические показатели	Уровень сахара (мг %)
Исходное значение	Через 4 суток после введения аллоксана	Через 1 ч после 5-кратного введения пептида	После отмены введения препаратов
через 8 сут	через 20 сут
1	Pro-Gly-Pro и/н	М±m	118,0±6,9	372,3±31,6	142,0±12,8	110,4±9,2	232±17,2
n	8	8	8	5	5
p	>0,5	>0,5	<0,01	<0,01	<0,01
p1		<0,01	<0,05	>0,5	<0,01
2	NaCl и/н	М±m	123,0±4,8	331,8±24,2	318,3±29,0	340,0±38,8	400±13,3
n	8	8	6	4	3
Примечание: р - достоверность различий между опытом и контрольными значениями; p1 - достоверность различий между опытом и исходным уровнем. Где и/н (интраназальное введение).

Данные, приведенные в таблице 3, сравнивали с данными, приведенными в таблице 2. Как видно из этого сравнения, интраназальное введение трипептида Pro-Gly-Pro в указанных дозах снижало уровень сахара в крови на фоне развития аллоксанового диабета по сравнению с контролем. Однако этот уровень значительно выше, чем значение уровня сахара в крови, приведенные в таблице 2 при применении тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu.

Таким образом, применение тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu в качестве средства профилактики и лечения диабета и способ профилактики и лечения диабета при интраназальном использовании тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu эффективно и превосходит прототип.

1. Применение тетрапептида Рrо-Gly-Pro-Leu в качестве средства профилактики и лечения инсулинзависимого диабета.

2. Способ профилактики и лечения диабета, включающий назначение лекарственного средства, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu в эффективном количестве при интраназальном применении.

3. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения диабета за счет интраназального введения, содержащая лекарственное средство, отличающаяся тем, что в качестве лекарственного средства она содержит тетрапептид Pro-Gly-Pro-Leu в эффективном количестве.