Ассоциированная вакцина против инфекционного ринотрахеита и коронавирусной инфекции крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Ассоциированная вакцина против инфекционного ринотрахеита и коронавирусной инфекции крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается ассоциированной вакцины для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота (КРС), обусловленных возбудителями инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и коронавирусной инфекции КРС.

Указанные вирусы играют ведущую роль в этиологии респираторных и желудочно-кишечных заболеваний КРС, особенно в крупных животноводческих хозяйствах.

ИРТ - остро протекающее контагиозное заболевание КРС, наносящее значительный экономический ущерб скотоводству.

Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся пятью формами: поражением верхних дыхательных путей, вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. Кроме того, у телят возможна пневмония.

Экономический ущерб, наносимый ИРТ, слагается из снижения удоев в период болезни (до 50-60%), значительного увеличения сервис-периода и яловости коров, болевших вагинальной формой, слабого развития больного молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят. При хронической серозно-гнойной пневмонии погибает до 20% молодняка. Болезнь широко распространена во всем мире.

Коронавирусная инфекция у КРС проявляется в виде коронавирусной диареи новорожденных телят, коронавирусной зимней дизентерии взрослого КРС и коронавирусной респираторной инфекции.

Чрезвычайно широкое распространение, тенденция вызывать длительную персистенцию, относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение болезни в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания и кормления. Стационарность болезни поддерживается за счет длительной персистенции возбудителя в организме животных-реконвалесцентов.

Важными условиями успешной борьбы с этими заболеваниями являются их своевременная и правильная диагностика и проведение мер специфической профилактики.

В настоящее время основным средством борьбы с респираторными и желудочно-кишечными болезнями КРС является специфическая профилактика, для которой применяются живые и инактивированные вакцины как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (1, 2, 3).

Преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при применении не вызывает сомнений. Однако иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации: вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. По этой причине они не нашли широкого применения.

Для специфической профилактики указанных заболеваний широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток ВНК-21, из культуры клеток MDBK и из культуры клеток 3КГ, с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции диффузной преципитации (РДП) не менее 4,0 log₂, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0
Масляный адъювант	до 100,0 (4).

Известна вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток Таурус-1, из культуры клеток КСТ и из культуры клеток Vero, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА) в эффективном соотношении (5).

Недостатки моновалентных инактивированных вакцин заключаются в том, что они стимулируют образование иммунитета у животных только к одной инфекции, требуют проведения профилактических обработок против каждой инфекции в отдельности, что сказывается на затратах труда, растягивает сроки формирования иммунитета у животных, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.

Указанные недостатки частично устранены созданием ассоциированных вакцин, содержащих отдельно или в сочетании антигены возбудителей ИРТ и коронавирусной инфекции КРС различных штаммов.

В ряде случаев в состав известных вакцин, особенно предназначенных для защиты телят, включают антигены возбудителей, вызывающих вторичные инфекции.

Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-С24 V (САРМ V-293) вируса ВД-БС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4804 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli КРС. полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (6).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-PTOB-8 INRV №3760 вируса ИРТ, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (7).

Известна ассоциированная вакцина против парагриппа-3 (ПГ-3), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма PI-3/T₁/H V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4808 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (8).

Известна ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «III-1» Bovine rotavirus, из штамма «СМ-1» Bovine coronavirus, из штамма «ТКА -ВИЭВ-В-2» Bovine Herpesvirus и из штаммов бактерий Е. coli, содержащих адгезины К₉₉ и А₂₀, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (9).

Известна ассоциированная вакцина против рота- и коронавирусной инфекций, эшерихиоза и клостридиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов Cody 81-4, 10В223 типа G и В 641 ротавируса КРС, штамма Mebus (АТСС № VR-874) коронавируса КРС, штаммов В41, В43, В44 и В141 бактерий Е. coli и штамма GL 47 (АТСС РТА-3000) бактерий Clostridium perfringens, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (10).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезни телят «КОМБОВАК» сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из шести производственных штаммов вирусов - возбудителей: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезни КРС, - полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (11).

Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ КРС, из штаммов ВД-N и ВД-R вируса ВД-БС КРС, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 КРС, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса КРС и из штаммов PC-89 и PC-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (12).

Известен также способ количественной оценки вируссодержащих суспензий с помощью электронной микроскопии, возникший как результат многолетних опытов по электронно-микроскопическому контролю вирусных препаратов и сопоставлению его данных с показателями биологических тестов, например титром инфекционности вируса (13).

Авторами данного способа установлена зависимость между титром инфекционности нативных суспензий вируса ящура и количеством физических вирусных частиц, наблюдаемых под электронным микроскопом, что послужило основанием для определения общей концентрации вирусных частиц в единице объема суспензии (степень накопления вирусных частиц в определенном объеме жидкости).

Для определения общей концентрации (N) вирусных частиц в единице объема анализируемой суспензии на экране электронного микроскопа площадью S₂ подсчитывают число одновременно наблюдаемых частиц n. По известному инструментальному увеличению электронного микроскопа (М) определяют размер участка пленки-подложки S₁, соответствующего полезной площади экрана:

При нанесении вирусных препаратов на пленки-подложки концентрация вирусных частиц (n) на данном участке S₁ соответствует суммарному количеству адсорбированных частиц и частиц, осажденных на подложку при испарении остаточной жидкости. Следовательно, наблюдаемое одновременно на экране число частиц распределяется в микрообъеме, равном:

v=S₁·I,

где I - толщина остаточного слоя жидкости на подложке (мм).

В определяемом объеме вируссодержащей суспензии число частиц равно:

а после замены значений v и S₁:

где V - объем анализируемой суспензии (1 см³);

N - среднее арифметическое ряда значений числа частиц, просчитанных с экрана электронного микроскопа или экспонированных фотопластинок.

Толщину остаточного слоя I на подложке измеряют предварительно охлажденным микрометром после замораживания жидкости на подложке в парах жидкого азота. Она составляет 0,03-0,04 мм и ее принимают как постоянную величину.

Электронно-микроскопическое определение концентрации физических вирусных частиц позволяет не только определять количественную характеристику вируса в анализируемых суспензиях, но и одновременно оценивать морфологическое состояние исследуемых вирусных частиц.

Указанный способ оказался универсальным и пригодным для определения количественной характеристики различных вирусов в исследуемых жидкостях.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является ассоциированная вакцина против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-PTOB-8 INRV №3760 вируса ИРТ КРС и из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (7).

Общим существенным недостатком известных ассоциированных вакцин, в том числе вакцины-прототипа, предназначенных для профилактики массовых инфекционных респираторных и желудочно-кишечных заболеваний КРС различных половозрастных групп, является их недостаточно высокая эффективность вследствие:

1) неполноценности (неполноты) антигенного состава входящих в них ингредиентов и сложных взаимодействий антигенов, из которых они изготовлены;

2) узости антигенного спектра действия используемых штаммов;

3) низкой иммуногенной активности препаратов. Причиной этого явления может быть использование для инактивации вирусов формалина, вызывающего деструктивные изменения вирусных белков.

Поэтому проблема создания ассоциированной вакцины против основных возбудителей инфекционных респираторных и желудочно-кишечных заболеваний КРС и телят продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по их совершенствованию.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп против возбудителей ИРТ и коронавирусной инфекции КРС, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионных инактивированных, способных защитить поголовье КРС различных половозрастных групп от возбудителей ИРТ и коронавирусной инфекции КРС, циркулирующих на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вакцины против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ИРТ КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного после введения ему целевого продукта, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Ассоциированная вакцина против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. В качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного после введения ему целевого продукта.

4. Целевая добавка

5. В качестве целевой добавки масляный адъювант.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Ассоциированная вакцина против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионная инактивированная,

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного после введения ему целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный очищенный антитенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток ВНК-21, из культуры клеток MDBK и из культуры клеток 3КГ в эффективном количестве.

2. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью не менее 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) не менее 4,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

3. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в РДП не менее 4,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

4. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток 3КГ с инфекционной активностью не менее 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и активностью в РДП не менее 4,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

5. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток животного происхождения, взятой из группы, состоящей из культуры клеток MDBK, из культуры клеток Таурус-1, из культуры клеток КСТ и из культуры клеток Vero, в эффективном количестве.

6. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 7,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

7. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток почек теленка Таурус-1 со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

8. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток коронарных сосудов теленка КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

9. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток почек обезьяны Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

10. Масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%

11. Смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Авирулентный очищенный антигенный материал
из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного
в культуре клеток животного происхождения,
взятой из группы, состоящей из культуры
клеток ВНК-21, из культуры клеток MDBK
и из культуры клеток 3КГ, с инфекционной
активностью не менее 6,0 lg ТЦД50/см3
и активностью в РДП не менее 4,0 log2	15,0
Авирулентный очищенный антигенный материал
из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного
в культуре клеток животного происхождения,
взятой из группы, состоящей из культуры
клеток MDBK, из культуры клеток Таурус-1, из
культуры клеток КСТ и из культуры клеток Vero,
в концентрации вирусных частиц,
обеспечивающей протективную иммунную
активность антигена в организме животного
после введения ему целевого продукта	15,0
Масляный адъювант	до 100,0.

Входящие в предлагаемую вакцину штаммы вирусов известны и являются производственными при изготовлении моновакцин (14, 15).

В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вируссодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого препарата достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, выделен из патологического материала телят, павших с явлениями ИРТ во время вспышки заболевания в СПК «Миневское» Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС адаптирован к культурам клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ.

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (14).

Морфологические свойства

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм «ВНИИЗЖ» включает линейную 2-цепочечную ДНК с молекулярной массой 92-102 кД. Вирионы округлой формы, состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеоида, капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки. Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCI составляет 1,27-1,29 г/см³. Нуклеоид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 200 кД.

Вирионы имеют сложную четырехуровневую (от центра к периферии) организацию: нуклеоид, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. При прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум вирионы покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к группе 1 герпесвирусов КРС.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РНГА в разведении 1:16-1:256.

Биотехнологические характеристики

Вирус ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48-96 часов инкубирования накапливается в титрах от 6,5 до 8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Результаты адаптации вируса ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» к указанным культурам клеток представлены в таблицах 1, 2 и 3. Штамм «ВНИИЗЖ» является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ»: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP 74, VP 64, VP 54, VP 50, VP 47, VP 40 и VP 31. Гликопротеины g I, g III, g IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении является g IV. По данным реакции нейтрализации наибольшей иммуногенностью обладают VP 90 и VP 74. Белок, маркированный как VP 8 с мол. м. 96 кД, является одним из главных белков герпесвируса-1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А, стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител у телят как после заражения, так и после иммунизации животных очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител к герпесвирусу-1 КРС ответственны 4-х оболочечные гликопротеины, главными из которых являются g 70 и g 97, расположенные в шипиках вириона. В структуре g IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена. Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 - один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС устойчив к воздействию низких температур: при минус 60-70°С вирус выживает 7-9 месяцев, при 56°С вирус инактивируется через 20 минут, при 37°С - через 4-10 суток, при 22°С - через 50 суток, при 4°С активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1,0 Ig. Раствор формалина 1:500 инактивирует вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 месяцев) сохраняется при рН 6-9 и в условиях 4°С. Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и гемагглютинирующими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток MDBK и ВНК-21, выращенные в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС можно использовать культуру клеток 3КГ.

Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием и производят контроль вирусного сырья. Производственная серия вируса ИРТ КРС должна иметь инфекционную активность не менее 6,0 1g ТЦД₅₀/см³ и активностью в РДП не менее 4,0 log₂.

Для инактивации вируса ИРТ штамма «ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6-7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5-6 часов по 3-5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2-8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в чувствительной биологической системе с инфекционной активностью не менее 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и активностью в РНГА не менее 4,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС адаптирован к культурам клеток MDBK, Таурус-1, КСТ и Vero.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (15).

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 18-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозе составляет 1,15-1,18 г/см³.

В составе вирионов обнаружены три структурных белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД), нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).

Антигенные свойства

Антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В сыворотках крови вакцинированных кроликов уровень антител колеблется от 5,4±0,25 до 7,25±0,47 log₂ (в среднем 6,32±0,39 1092), а в сыворотках крови иммунизированных морских свинок - от 5,4±0,38 до 8,2±0,8 log₂ (в среднем 6,1±0,49 log₂).

В сыворотках крови проб, отобранных за 10-15 дней до отела, дважды вакцинированных коров выявляются антитела в РТГА в титрах от 7,9±0,35 до 8,9±0,47 log₂. Своевременное скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (до 8,0 log₂) в организме новорожденных телят.

Биотехнологические характеристики

Коронавирус КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток почек теленка (MDBK, Таурус-1), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток почек обезьяны (Vero). При 37°°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10⁸ частиц/см³ (данные электронно-микроскопического исследования). Результаты исследований по адаптации коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток MDBK, Таурус-1, Vero и КСТ представлены в таблице 4.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС обладает способностью в культуре клеток MDBK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре увеличивается почти на сутки, однако позволяет получать двойной урожай вируса путем смены поддерживающей среды. «Слив» обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС проявляет максимальную устойчивость в диапазоне рН 6,0-7,2. Кислая (рН 3,0) и щелочная (рН 11,0) среды оказывает на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом и трипсином Х-100. Инактивированный антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуру клеток MDBK.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС можно использовать культуру клеток Таурус-1, КСТ и Vero.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена 1М раствора тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ,

Для изготовления предлагаемой вакцины используют в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного преимущественно в культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 7,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток Таурус-1 со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая ассоциированная вакцина может содержать в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/см³ и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве не менее 15,0 мас.%.

Полученный таким образом антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС используют для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины.

Для получения вакцины антигенные материалы смешивают в соотношении 1:1 и смесь тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в гомогенизаторе в соотношении, мас.%, 30,0:70,0 соответственно.

Из масляных адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

Содержание антигенов в предлагаемой вакцине в указанном выше соотношении является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Использование предлагаемого изобретения расширяет арсенал высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионных инактивированных, способных защитить поголовье КРС различных половозрастных групп от возбудителей ИРТ и коронавирусной инфекции КРС, циркулирующих на территории России.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его реализации и использования.

Пример 1

Для получения ассоциированной вакцины против ИРТ и коронавирусной инфекции КРС эмульсионной инактивированной используют производственные штаммы вирусов: штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и штамм «ВНИИЗЖ» коронавирусной инф