Способ пролиферации кардиомиоцитов

Способ пролиферации кардиомиоцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способу пролиферации кардиомиоцитов млекопитающих.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вследствие потери зрелыми кардиомиоцитами способности к пролиферации путем деления клеток, повреждения сердца, вызванные различными стрессами, такие как ишемия и воспаление, ведут к некрозу или потере кардиомиоцитов без последующего восстановления. Впоследствии оставшиеся кардиомиоциты компенсаторно гипертрофируются для поддержания функций сердца. Однако когда количество кардиомиоцитов снижается ниже допустимого уровня, они подвергаются дальнейшему повреждению и погибают. В конечном итоге такое состояние приводит к нарушению функций сердечной мышцы, а именно к сердечной недостаточности.

Заболевания сердца, в основном связанные с сердечной недостаточностью, занимают второе место по количеству смертности в Японии. Кроме того, прогноз больных с заболеваниями сердца настолько неблагоприятен, что пятилетняя выживаемость наблюдается примерно у 50% больных. Таким образом, очевидно, что разработка эффективных способов лечения сердечной недостаточности является в настоящее время очень важной с точки зрения медицинской помощи и экономики здравоохранения. Используемые в настоящее время лекарственные средства для лечения сердечной недостаточности включают препараты дигиталиса, которые увеличивают силу сокращения миокарда, препараты ксантина и другие сердечные стимуляторы, однако известно, что длительное применение этих лекарств ведет к ухудшению состояния. В последние годы основным направлением лечения с применением фармацевтических средств является назначение β-блокаторов и ингибиторов АПФ для уменьшения повреждений сердца посредством активации симпатической нервной системы и ренин-ангиотензиновой системы. Однако эти способы лечения являются лишь симптоматическими и не могут восстановить поврежденные сердечные ткани. С другой стороны, оптимальным способом лечения серьезных форм сердечной недостаточности является пересадка сердца. В связи с проблемами, вызванными небольшим количеством доноров органов, проблемами медицинской этики, травматичностью для организма, а также высокой стоимостью лечения для пациента, пересадка сердца не может применяться как основной способ лечения.

Недавно был описан способ поддерживающего введения кардиомиоцитов в поврежденную ткань сердца. Известно, что в ряде экспериментов на животных, когда кардиомиоциты зародыша вводили в зрелую сердечную ткань, введенные клетки могли эффективно функционировать как кардиомиоциты (например, см. непатентную ссылку 1). Продолжаются исследования получения кардиомиоцитов из полипотентных клеток, способных дифференцироваться в различные клетки, включая кардиомиоциты, так называемых зародышевых стволовых клеток (ES-клетки), для использования в качестве вводимых клеток. Однако эти способы связаны со значительными трудностями применения в клинической медицине в связи с этическими трудностями. Недавно были предприняты новые попытки введения стволовых клеток костного мозга в ткани сердца и обеспечения их дифференциации в кардиомиоциты. Однако степень дифференциации была очень низкой. Таким образом, этот способ не имеет практического значения для регенерации и восстановления кардиомиоцитов (см., например, непатентные ссылки 2, 3 и 4, в качестве обзора).

Авторы данного изобретения исследовали регуляторный механизм клеточного цикла кардиомиоцитов, в частности роль системы циклин-циклин-зависимой киназы (CDK). В то же время авторы обнаружили, что хотя экспрессию циклина типа 4 и CDK4 индуцирует стимуляция, например, сывороточных или ростовых факторов в кардиомиоцитах, эти белковые молекулы локализованы в цитоплазме и не переносятся в ядро, поэтому не происходит фосфорилирования RB-протеина, то есть ядерной молекулярной мишени циклина D-CDK4, или активации циклина E-CDK2. После этого авторами изобретения был получен аденовирусный вектор способности, в который интегрировали ген циклина D1, меченного сигналом локализации в ядре (NLS) (называемым здесь D1NLS) и ген, кодирующий CDK4, и им инфицировали культуры кардиомиоцитов, в ядрах экспрессировались белки циклин D1 и CDK4, вызывая деление и размножение кардиомиоцитов путем RB-фосфорилирования. Затем авторы успешно стимулировали пролиферацию кардиомиоцитов, практически неспособных к делению в обычных условиях культивирования. Кроме того, авторы вводили гены D1NLS и CDK4 в ткань сердечной мышцы взрослых животных для их экспрессии, таким образом успешно продлевая клеточный цикл кардиомиоцитов взрослых животных (см., например, патентную ссылку 1 и непатентную ссылку 5). Способ пролиферации кардиомиоцитов по изобретению обозначен как способ DNLS/CDK. Содержание патента 1, непатентной ссылки 5 и других ссылок, приведенных здесь, полностью включено в описание настоящего изобретения.

С целью индукции деления клеток было предпринято большое количество других попыток продления клеточного цикла кардиомиоцитов (см., например, непатентную ссылку 6, в качестве обзора о продлении клеточного цикла кардиомиоцитов). Например, сообщалось, что когда в культуре кардиомиоцитов, выделенных из новорожденных крыс, экспрессируются аденовирусный ген Е1А/Е1В (см. непатентную ссылку 7) или ген Е2F (см. непатентную ссылку 8), то происходит индукция синтеза ДНК в кардиомиоцитах. У трансгенных мышей, избыточно экспрессирующих интактный ген циклина D1, без каких-либо сигналов локализации в ядре, в кардиомиоцитах наблюдалось повышение экспрессии гена CDK4 наряду с усилением синтеза ДНК (см., например, непатентную ссылку 9). Совсем недавно было показано, что у мышей, дефицитных по гену jumonji, ингибирующего экспрессию гена циклина D1, наблюдается увеличение длительности клеточной пролиферации зародышевых кардиомиоцитов (см., например, непатентную ссылку 10). Как описано выше, было показано, что усиление синтеза ДНК и удлинение клеточного цикла возможно даже в кардиомиоцитах. В экспериментальных примерах, однако, в кардиомиоцитах часто наблюдается усиление апоптоза и появление патологических многоядерных клеток. Никакой другой способ, кроме DNLS/CDK, не вызывает в послезародышевом периоде деление кардиомиоцитов с реальным увеличением количества клеток.

Как описано выше, способ DNLS/CDK является инновационным способом, увеличивающим количество кардиомиоцитов, которые «практически не делятся» в обычных условиях. Таким образом, данный способ имеет широкое промышленное применение.

Известно, что множество стимулирующих и ингибирующих факторов регулируют продолжительность клеточного цикла эукариотических клеток. Стимулирующие факторы включают отдельные типы циклина и CDK, тогда как ингибирующие факторы включают ряд белковых групп, называемых CDK-ингибиторами. Идентифицированы два семейства CDK-ингибиторов, различающихся по механизму действия (см., например, непатентную ссылку 11, в качестве обзора). Первая группа названа белками семейства Ink4 и включает р6 (также называемый Ink4A, Mts1, Cdkn2 и Cdkn4i), p15 (также называемый Ink4B и Mts2), p18 (также называемый Ink4C и Ink6A), и p19 (также называемый p20, Ink4D и Ink6B). Первая группа избирательно связывается с CDK4 или CDK6 и ингибирует действие комплекса циклин D-CDK4 (или CDK6) (см., например, непатентные ссылки 12, 13 и 14). Вторая группа CDK-ингибирующих белков называется белками семейства Cip/Kip и включает р21 (также называемый Cip1, Pic1, Sdi1, mda6 и Waf1; здесь называемый - p21^Cip1 ), p27 (также называемый Ick, Kip1 и Pic2, здесь называемый - p27^Kip1), и р57 (также называемый Kip2, здесь называемый - p57^Kip2). Показано, что, в отличие от семейства Ink4, второе семейство ингибирует продолжительность клеточного цикла путем ингибирования функций различных циклин-CDK-комплексов (см., например, непатентные ссылки 15, 16, 17 и 18).

Что касается того, каким образом CDK-ингибирующие белки участвуют в ингибировании пролиферации кардиомиоцитов, то было сделано несколько сообщений о роли молекул семейства Cip/Kip. В частности, известно, что уровень экспрессии белков p21^Cip1 и p27^Kip1 повышается вслед за снижением способности кардиомиоцитов к пролиферации в течение периода от поздней зародышевой до послеродовой стадии, при этом активность CDK2 и CDK4, в качестве молекул-мишеней, снижается (см., например, непатентную ссылку 19). При добавлении IGF-1 (инсулин-подобный фактор роста-1) к кардиомиоцитам с повышенной экспрессией гена E2F-1 тереина, уровень экспрессии белков p21^Cip1 и

p27^Kip1 снижается, при этом повышается доля кардиомиоцитов в фазе синтеза ДНК (S-фаза) (см., например, непатентную ссылку 20). Также сообщалось, что у мышей, дефицитных по гену p27^Kip1, время пролиферации кардиомиоцитов короче, чем у нормальных мышей, и количество кардиомиоцитов у ген-дефицитных мышей повышено (см., например, непатентную ссылку 21). Как описано выше, было сделано предположение, что белки семейства Cip/Kip, в частности белок p27^Kip1, может участвовать в ингибировании пролиферации кардиомиоцитов. Кроме делеции гена, не известно других примеров, при которых наблюдается ингибирование экспрессии и функции белков семейства Cip/Kip, и, таким образом, усиления деления и пролиферации кардиомиоцитов.

Известно, что уровень внутриклеточной экспрессии белков семейства Cip/Kip в основном регулируется системой разрушения через убиквитиновый путь (см., например, непатентные ссылки 22, 23 и 24). Убиквитин является полипептидом, состоящим из 76 высококонсервативных аминокислот и встречающимся во всех зрелых эукариотических клетках. Убиквитиновый путь заключается в том, что полиубиквитиновая цепь ковалентно связывается с субстратом-мишенью и затем разрушается многофункциональным протеасомным комплексом. Белковые молекулы, разрушающиеся такой убиквитин-протеасомной системой, включают, кроме белков семейства Cip/Kip, широкий спектр молекул, таких как циклин, р53, р300, Е2F, STAT-1, c-Myc, c-Jun, EGF-рецептор, IkBα, NFkB и β-катенин. В настоящее время ведутся интенсивные исследования по изучению механизма убиквитинилирования белковых молекул. В целом, белковые молекулы убиквитинилируются несколькими группами ферментов, а именно убиквитинактивирующим ферментом (Е1), убиквитинкомплексообразующим ферментом (Е2) и убиквитинлигазой (Е3), и, в конечном итоге, разрушаются 26S-протеасомами (см., например, непатентные ссылки 25, 26, 27 и 28, в качестве обзоров).

Вероятно убиквитинлигаза (Е3) отвечает за специфичность убиквитинилирования специфичных белков-мишеней. Известно большое количество примеров, таких как комплекс, способствующий анафазе/циклосома (АРС/С), VHL (комплекс белка von Hipple-Lindau - элонгин В/С (VBC)), Nedd4, Ufd4, Rad4, Rad18 и Parkin. Недавно в ходе исследований с использованием низших биологических организмов, таких как дрожжи, был идентифицирован новый тип убиквитинлигазного комплекса, названный SCF. Убиквитинлигаза комплекса типа SCF (иногда называемая здесь убиквитинлигазным SCF-комплексом) является белковым модулем, состоящим из трех субъединиц, называемых Skp1, Cul1 (другое название Cdc53) и белка F-бокса. Название лигазы SCF является аббревиатурой названий отдельных субъединиц (см., например, непатентные ссылки 29 и 30, в качестве обзоров).

Белок F-бокса, как один из компонентов комплекса SCF, содержит мотив F-бокса, впервые идентифицированный в циклине F. Область мотива необходима для взаимодействия с Skp1. Кроме того, белок F-бокса содержит область повтора мотива примерно из 40 аминокислот, называемую повтором WD-40, или область мотива, обогащенную лейцином, называемую лейцин-богатым повтором. В комплексе SCF субъединицы Skp1 и Cull/Cdc53 никогда не изменяются в зависимости от субстрата-мишени, тогда как молекулярная специфичность белка F-бокса меняется в зависимости от субстрата-мишени убиквитинилирования. Распознавая и связывая субстратную мишень повтором WD-40 или повтором, богатым лейцином, белок F-бокса определяет субстратную специфичность комплекса SCF (см., например, непатентные ссылки 31, 32 и 33, в качестве обзоров). Как описано выше, комплекс SCF включает различные типы SCF^βTrCP, SCF^Cdc4, SCF^Met30 и SCF^Crr1, в зависимости от различий белка F-бокса, содержащегося как компонент (см., например, непатентные ссылки 29 и 30).

В случае белкового семейства Cip/Kip в убиквитин-протеасомную деградацию вовлечен комплекс SCF, содержащий в качестве белка F-бокса Skp2 (SCF^Skp2). Skp2 был идентифицирован как фактор, связанный с циклиновым A-CDK2 комплексом. Поскольку накопление Skp2 происходит в течение периода, начиная с поздней G1 фазы клеточного цикла, и уровень эспрессии достигает максимума в период от S фазы до G2 фазы, Skp2 называют киназа-связанным белком S-фазы (см., например, непатентную ссылку 38). Имеются данные, что, помимо белков семейства Cip/Kip, Skp2 распознает такие белковые молекулы, как E2F-1 (см. непатентную ссылку 39), циклин Е (см. непатентную ссылку 40), CDK9 (см. непатентную ссылку 41) и c-Myc (см. непатентную ссылки 42 и 43) в качестве субстратных мишеней, и Skp2 вовлечен в их деградацию.

Как описано выше, известно, что ингибиторы CDK, включая белок семейства Cip/Kip, участвуют в ингибировании пролиферации основных пролиферирующих клеток, таким образом, убиквитин-протеасомная система посредством комплекса SCF^Skp2 отвечает за регуляцию уровня внутриклеточной экспрессии. Однако почти ничего не известно о том, каким образом убиквитин-протеасомная система участвует в механизмах регуляции пролиферации кардиомиоцитов.

Метод DNLS/CDK является единственным известным в настоящее время методом пролиферации кардиомиоцитов. Метод очень эффективен и имеет огромное промышленное применение. Для внедрения лечебного метода регенерации сердечной мышцы в практику и его промышленного применения желательно повысить эффективность пролиферирующих кардиомиоцитов и их активность.

Патентная ссылка 1: Pamphlet of International Publication WO 02/095026

Непатентная ссылка 1: Soonpaa, et al., Science 264:98, (1994).

Непатентная ссылка 2: Murry, et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 67:519, (2002).

Непатентная ссылка 3: Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75:S20, (2003).

Непатентная ссылка 4: Nir, et al., Cardiovasc. Res. 58:313, (2003).

Непатентная ссылка 5: Tamamori-Adachi, et al., Circ. Res. 92:e12, (2003).

Непатентная ссылка 6: Kishore, et al., Circ. Res. 90:1044, (2002).

Непатентная ссылка 7: Kirshenbaum, et al., J. Biol. Chem. 270: 7791, (1995).

Непатентная ссылка 8: Kirshenbaum, et al., Dev. Biol. 179:402, (1996).

Непатентная ссылка 9: Soonpaa, et al., Clin. Invest. 99: 2644, (1997).

Непатентная ссылка 10: Toyoda, et al., Dev. Cell 5: 85, (2003).

Непатентная ссылка 11: Sherr & Roberts, Genes Dev. 9:1149, (1995).

Непатентная ссылка 12: Hannon& Beach, Nature 371: 257, (1993).

Непатентная ссылка 13: Serrano, et al., Nature 366: 704, (1993).

Непатентная ссылка 14: Hirai, et al., Mol. Cell. Biol. 15:2672, (1995).

Непатентная ссылка 15: Harper, et al., Cell 75:805, (1993).

Непатентная ссылка 16: Polyyak, et al., Cell 78:59, (1994).

Непатентная ссылка 17: Toyoshima & Hunter Cell 78:67, (1994).

Непатентная ссылка 18: Matsuoka, et al., Genes Dev. 9:650, (1995).

Непатентная ссылка 19: Flink, et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 30:563, (1998).

Непатентная ссылка 20: von Harsdorf, et al., Circ. Res. 85:128, (1999).

Непатентная ссылка 21: Poolman, et al., Circ. Res. 85:117, (1999).

Непатентная ссылка 22: Pagano, et al., Science 269: 682 (1995).

Непатентная ссылка 23: Maki& Howley, Mol. Cell Biol. 17:355, (1997).

Непатентная ссылка 24: Urano, et al., J. Biol. Chem. 274:12197, (1999).

Непатентная ссылка 25: Coux, et al., Annu. Rev. Biochem. 65:801, (1996).

Непатентная ссылка 26: Hochstrasser, Annu. Rev. Genet. 30:405, (1996).

Непатентная ссылка 27: Pagano, FASEV J. 11:1067, (1997).

Непатентная ссылка 28: Hershko, et al., Annu. Rev. Biochem. 67:425, (1998).

Непатентная ссылка 29: Patton, et al., Trends Genet. 14:236, (1998).

Непатентная ссылка 30: Jackson & Eldridge, Mol. Cell 9:923,(2002).

Непатентная ссылка 31: Bai, et al., Cell 86:263, (1996).

Непатентная ссылка 32: Slowrya, et al., Cell 91:209, (1997).

Непатентная ссылка 33: Kobe, et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 11725, (2001).

Непатентная ссылка 34: Carrano, et al., Nature Cell Biol. 1:193, (1999).

Непатентная ссылка 35: Tsverkov, et al., Curr. Biol. 9:661, (1999).

Непатентная ссылка 36: Bornstein, et al., J. Biol. Chem. 278:26752, (2003).

Непатентная ссылка 37: Kamura, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10231, (2003).

Непатентная ссылка 38: Zhang, et al., Cell 82:915, (1995).

Непатентная ссылка 39: Marti, et al., Nat. Cell Biol. 1:14, (1999).

Непатентная ссылка 40: Nakayama, et al., EMBO J. 19:2069, (2000).

Непатентная ссылка 41: Kiernan, et al., Mol. Cell. Biol. 21:7956, (2001).

Непатентная ссылка 42: Kim, et al., Mol. Cell 11:1177, (2003).

Непатентная ссылка 43: von der Lehr, et al., Mol. Cell 11:1189, (2003).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В отношении способа пролиферации кардиомиоцитов объектом настоящего изобретения является создание способа усиления пролиферативной активности кардиомиоцитов и создание рекомбинатного вектора и тому подобного для применения в этом способе.

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ УКАЗАННЫХ ЗАДАЧ

Для решения этих задач авторы изобретения проанализировали механизм регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов. Конкретно, авторы изучили этот механизм, обращая особое внимание на роль отдельных факторов регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов, повышенной экспрессией генов циклина и CDK, в частности ингибиторов CDK. Кроме того, авторы обнаружили, что белок, называемый р27^Kip1, относящийся к семейству белков Cip/Kip и являющийся ингибитором CDK, неожиданно избыточно накапливается в ядрах кардиомиоцитов при стимуляции циклином и CDK.

Известно, что белок семейства Cip/Kip, в основном р27^Kip1, убиквитинилируется с помощью убиквитинлигазы в большинстве пролиферирующих клеток, и, таким образом, белок семейства Cip/Kip разрушается протеасомами. Следовательно, одновременно с генами циклина и CDK, в кардиомиоцитах экспрессировался ген, кодирующий компонент убиквитинлигазы. Затем было обнаружено, что уровень белка р27^Kip1 значительно снижается в ядрах кардиомиоцитов. Кроме того, было обнаружено значительное повышение способности кардиомиоцитов к пролиферации, и на основании этих обнаружений было сделано настоящее изобретение.

В частности, данное изобретение относится к способу повышения пролиферативной активности кардиомиоцитов путем ингибирования продукции, функционирования и активности (эффективности) белка семейства Cip/Kip, экспрессируемого в кардиомиоцитах при стимуляции циклином и CDK. Белки семейства Cip/Kip, активность которых подлежит ингибированию, не ограничены, но белок р27^Kip1 является предпочтительным.

В рамках данного изобретения термин «кардиомиоциты» означает любые клетки сердечной мышцы, экспрессирующие многочисленные специфичные для кардиомиоцитов маркеры, которые распознаются как морфологические, физиологические и/или иммунологические особенности интактных кардиомиоцитов. Термин включает не только кардиомиоциты, полученные непосредственно из тканей сердца млекопитающих и их первичной клеточной культуры, но также кардиомиоциты, происходящие и дифференцирующиеся из стволовых клеток, таких как зародышевые стволовые клетки, стволовые клетки костного мозга и CMG клетки.

Любой способ ингибирования ингибирования, функционирования и активности белка семейства Cip/Kip может считаться приемлемым и не имеет особых ограничений. Способ направлен на ингибирование экспрессии гена, кодирующего белок, ингибирование продукции белка, ингибирование активности белка или увеличение разрушения белка.

В частности, способом активации разрушения белка, предпочтительно, является способ активации убиквитинилирования белка. Убиквитинилирование может быть достигнуто введением в клетку-мишень, например, лекарственных средств, белков, пептидов, низкомолекулярных соединений и генов.

Кроме того, геном, активирующим убиквитинилирование белка семейства Cip/Kip, предпочтительно, является ген, кодирующий компонент убиквитинлигазы, еще более предпочтительно, ген, кодирующий фактор F-бокса, способный связываться с белком семейства Cip/Kip, включая, например, ген Skp2.

При осуществлении изобретения, кроме того, может быть использован способ ингибирования экспрессии гена (транскрипции мРНК) гена, кодирующего белок семейства Cip/Kip или ингибирования трансляции и продукции гена. Например, может применяться siРНК, специфичная гену, кодирующему белок семейства Cip/Kip.

При осуществлении изобретения, кроме того, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал ядерной локализации, присоединяют, предпочтительно, по меньшей мере к одному из генов циклина или CDK, для введения полученного в результате гена в клетки-мишени. Циклин способен активировать CDK4 или CDK6 и, предпочтительно, включает, например, циклин D1, D2 и D3 млекопитающих. Кроме того, CDK активируется циклином типа D и, предпочтительно, включает, например, CDK4 и CDK6 млекопитающих.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к вектору, несущему ген циклина, ген CDK и ген фактора ингибирования активности белка семейства Cip/Kip. В случае, когда предполагают введение гена в кардиомиоциты, предпочтительно, введение производят с использованием вирусного вектора, или липосом, или тому подобное. В качестве вирусного вектора, например, может применяться аденовирус.

В дополнительном варианте осуществления изобретения изобретение относится к фармакологической композиции, содержащей вектор, несущий ген циклина, ген CDK и ген фактора ингибирования активности белка семейства Cip/Kip.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения изобретение относится к кардиомиоцитам, полученным способом пролиферации кардиомиоцитов.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение относится к способу скрининга с использованием клеток, полученных способом пролиферации кардиомиоцитов, для выявления новых факторов, поддерживающих и стимулирующих жизнеспособность и функционирование кардиомиоцитов и тому подобное, или для выявления химиотерапевтических средств и их возможностей.

В дополнительном варианте осуществления изобретения изобретение относится к способу лечения заболеваний сердца, предусматривающему введение (трансплантацию) больным фармакологической композиции или кардиомиоцитов в область с ослабленными кардиомиоцитами, у которых ослаблена функция или они уничтожены, для восстановления и пролиферации клеток.

Соответственно, настоящее изобретение в целом относится к следующим объектам.

(1) Способ пролиферации кардиомиоцитов, предусматривающий стадию введения (a) циклина, (b) циклин-зависимой киназы, и (c) одного или нескольких агентов, выбранных из группы, включающей ген, кодирующий фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip, и нуклеиновую кислоту, ингибирующую продукцию белка семейства Cip/Kip, в кардиомиоциты, и стадию последующего культивирования или поддержания указанных клеток.

(2) Способ пролиферации кардиомиоцитов, предусматривающий стадию введения (a) циклина, (b) циклин-зависимой киназы, и (с) одного или нескольких агентов, выбранных из группы, включающей ген, кодирующий фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip, и нуклеиновую кислоту, которая ингибирует продукцию белка семейства Cip/Kip, в кардиомиоциты in vitro, и стадию последующего культивирования указанных клеток.

(3) Способ пролиферации кардиомиоцитов, предусматривающий стадию введения (a) циклина, (b) циклин-зависимой киназы, и (с) одного или нескольких агентов, выбранных из группы, включающей ген, кодирующий фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip, и нуклеиновую кислоту, которая ингибирует продукцию белка семейства Cip/Kip, в кардиомиоциты in vivo, и стадию последующего поддержания клеток.

(4) Способ, описанный выше в (1)-(3), в котором указанный циклин представляет собой циклин, способный активировать CDK4 или CDK6 млекопитающих.

(5) Способ, описанный выше в (4), в котором указанный циклин представляет собой циклин D млекопитающих.

(6) Способ, описанный выше в (1)-(5), в котором указанная циклин-зависимая киназа представляет собой циклин-зависимую киназу, активируемую циклином D.

(7) Способ, описанный выше в (6), в котором указанная циклин-зависимая киназа представляет собой CDK4 или CDK6.

(8) Способ, описанный выше в (1)-(7), в котором белок семейства Cip/Kip представляет собой p27^Kip1.

(9) Способ, описанный выше в (1)-(8), в котором фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip, представляет собой фактор с активностью, стимулирующей деградацию белка семейства Cip/Kip.

(10) Способ, описанный выше в (9), в котором фактор с активностью, стимулирующей деградацию белка семейства Cip/Kip, представляет собой компонент убиквитинлигазы.

(11) Способ, описанный выше в (10), в котором компонент убиквитинлигазы представляет собой фактор F-бокса, способный связываться с белком семейства Cip/Kip.

(12) Способ, описанный выше в (11), в котором фактор F-бокса, способный связываться с белком семейства Cip/Kip представляет собой Skp2.

(13) Способ, описанный выше в (1)-(12), в котором нуклеиновая кислота, которая ингибирует продукцию белка семейства Cip/Kip, представляет собой siРНК, специфичную в отношении гена, кодирующего белок семейства Cip/Kip.

(14) Способ, описанный выше в (13), в котором нуклеиновая кислота, ингибирующая продукцию белка семейства Cip/Kip, представляет собой siРНК, специфичную в отношении гена p27^Kip1.

(15) Способ, описанный выше в (1)-(14), включающий в себя введение генов в кардиомиоциты с использованием вирусного вектора или липосомы.

(16) Способ, описанный выше в (1)-(15), в котором по меньшей мере один из генов циклина и циклин-зависимой киназы метят нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнал ядерной локализации.

(17) Вектор, содержащий (a) ген циклина, (b) ген циклин-зависимой киназы, и (с) одного или нескольких агентов, выбранных из группы, включающей ген, кодирующий фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip, и последовательность нуклеиновой кислоты, ингибирующей продукцию белка семейства Cip/Kip.

(18) Вектор, описанный выше в (17), в котором циклин представляет собой циклин, способный активировать CDK4 или CDK6 млекопитающих.

(19) Вектор, описанный выше в (18), в котором циклин представляет собой циклин D млекопитающих.

(20) Вектор, описанный выше в (17)-(19), в котором циклин-зависимая киназа представляет собой циклин-зависимую киназу, активируемую циклином D.

(21) Вектор, описанный выше в (20), в котором циклин-зависимая киназа представляет собой CDK4 или CDK6.

(22) Вектор, описанный выше в (17)-(21), в котором фактор, ингибирующий продукцию, функцию или активность белка семейства Cip/Kip представляет собой фактор с активностью, стимулирующей деградацию белка семейства Cip/Kip.

(23) Вектор, описанный выше в (22), в котором фактор с активностью, стимулирующей деградацию белка семейства Cip/Kip, представляет собой компонент убиквитинлигазы.

(24) Вектор, описанный выше в (23), в котором компонент убиквитинлигазы представляет собой фактор F-бокса, способный связываться с белком семейства Cip/Kip.

(25) Вектор, описанный выше в (24), в котором фактор F-бокса, способный связываться с белком семейства Cip/Kip, представляет собой Skp2.

(26) Вектор, описанный выше в любом из вышеперечисленных (17)-(25), в котором нуклеиновая кислота, ингибирующая продукцию белка семейства Cip/Kip представляет собой siРНК, специфичную в отношении гена, кодирующего белок семейства Cip/Kip.

(27) Вектор, описанный выше в (26), в котором нуклеиновая кислота, ингибирующая продукцию белка семейства Cip/Kip, представляет собой siРНК, специфичную в отношении гена р27^Kip1.

(28) Вектор, описанный выше в любом из вышеперечисленных (17)-(27), в котором по меньшей мере один из генов циклина или циклин-зависимой киназы помечен нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнал ядерной локализации.

(29) Фармацевтическая композиция, которую используют при лечении сердечного заболевания, содержащая вектор, описанный в любом из вышеуказанных (17)-(28).

(30) Фармацевтическая композиция, описанная выше в (29), где сердечным заболеванием является инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, дилатационная кардиомиопатия, миокардит или хроническая сердечная недостаточность.

(31) Кардиомиоциты, полученные способом, описанным в любом из указанных выше (1)-(16).

(32) Способ лечения сердечного заболевания, представляющий инъекцию фармацевтической композиции, как описано выше в (29), или пересадку кардиомиоцитов, как описано в (31), в область с нарушением пациенту, страдающему сердечным заболеванием, и поддержание и пролиферацию кардиомиоцитов в этой области.

(33) Способ, описанный выше в (32), в котором сердечным заболеванием является инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, дилатационная кардиомиопатия, миокардит или хроническая сердечная недостаточность.

Преимущества изобретения

Применение способа по изобретению позволяет ингибировать активность белка семейства Cip/Kip в ядрах кардиомиоцитов и стимулировать, таким образом, пролиферацию кардиомиоцитов. Кроме того, преимущества и характерные особенности изобретения достаточно подробно описаны ниже в разделе «подробное описание предпочтительных способов осуществления изобретения».

Краткое описание рисунков

Фиг. 1

Экспрессия белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах, трансфицированных генами D1NLS и CDK4. При выделении ядерного белка экспрессию белка р27^Kip1 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. CM: кардиомиоциты крысы; REF: клеточная линия фибробластов крысы (клетки REF52).

Фиг. 2

Локализация белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах, трансфицированных генами D1NLS и CDK4. При инфицировании кардиомиоцитов рекомбинантным аденовирусом, несущим ген LacZ (верхняя колонка, контроль), или ген D1NLS и ген CDK4 (нижняя колонка), внутриклеточную экспрессию белка р27^Kip1 оценивали способом иммунофлюоресцентного окрашивания. На рисунке зеленым цветом показан р27^Kip1, красным цветом показан саркомерный актин. Кроме того, клеточные ядра окрашивали DAPI.

Фиг.3

Регуляция экспрессии белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах. Кардиомиоциты, стимулированные FBS или стимулированные D1NLS+CDK4 были обработаны протеасомным ингибитором лактостатином (LC) для сравнения посредством экспрессии белка р27^Kip1.

Фиг.4

Убиквитинилирование белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах. Клетки, выделенные из кардиомиоцитов (СМ) или фибробластов (REF) при стимуляции FBS или стимуляции D1NLS+CDK4, использовали для убиквитинилирования in vitro для последующего определения белка р27^Kip1 с помощью вестерн-блоттинга. На фиг.IB обозначает антитела, которые использовали в анализе вестерн-блоттинг. Полоса, наблюдаемая в положении с более высокой молекулярной массой, является убиквитинилированным белком р27^Kip1 (p27-GST-Ub).

Фиг. 5

Экспрессия белка Skp2 в кардиомиоцитах. Кардиомиоциты, стимулированные FBS или стимулированные D1NLS+CDK4, были обработаны протеасомным ингибитором лактостатином (LC) для сравнения посредством экспрессии белка Skp2.

Фиг.6

Снижение белка р27^Kip1 за счет совместной экспрессии гена Skp2. Изучали экспрессию белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах, трансфицированных генами D1NLS, CDK4 и Skp2.

Фиг. 7

Локализация белка р27^Kip1 в кардиомиоцитах с коэкспрессированными в них генами D1NLS, CDK4 и Skp2. При инфицировании кардиомиоцитов рекомбинантным аденовирусом, несущим гены D1NLS+CDK4 (верхняя колонка, контроль), или несущим гены D1NLS+CDK+Skp2 (средняя и нижняя колонки), и при обработке части кардиомиоцитов протеасомным ингибитором лактостатином (LC) (нижняя колонка), внутриклеточную экспрессию белка р27^Kip1 оценивали способом иммунофлюоресцентного окрашивания. На рисунке зеленым цветом показан р27^Kip1, красным цветом показан саркомерный актин. Кроме того, клеточные ядра были окрашены DAPI.

Фиг. 8

Эффект усиленной экспрессии гена Skp2 на стимуляцию пролиферации кардиомиоцитов. При инфицировании кардиомиоцитов рекомбинантным вирусом, несущим ген LacZ (контроль), гены D1NLS+CDK4, гены D1NLS+CDK4+Skp2 или только ген Skp2, в указанные дни подсчитывали число кардиомиоцитов.

Фиг. 9

Снижение белка р27^Kip1 за счет совместной экспрессии siРНК, специфичной гену

р27^Kip1. В кардиомиоцитах, трансфицированных генами D1NLS, CDK4 и siРНК, специфичной гену р27^Kip1, оценивали экспрессию белка р27^Kip1.

Фиг. 10

Эффект усиленной экспрессии siРНК, специфичной гену р27^Kip1, на стимуляцию пролиферации кардиомиоцитов. При инфицировании кардиомиоцитов рекомбинантным вирусом, несущим ген LacZ (контроль), гены D1NLS+CDK4, гены D1NLS+CDK4+siРНК, специфичную гену р27^Kip1 (р27 siРНК), или несущим только siРНК, специфичную гену р27^Kip1, в указанные дни подсчитывали число кардиомиоцитов.

Фиг. 11

Изучение эффекта усиленной экспрессии гена Skp2 на снижение массы легких. Измеряли массу легких у крыс через 6 недель после ишемии сердца и реперфузии для подсчета отношения к массе тела. *: р<0,05 по сравнению с опытной группой. #: р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Фиг. 12

Изменение кривой пассивного объема левого желудочка при усиленной экспрессии гена Skp2. Оценивали кривую пассивного объема левого желудочка, используя сердце крыс через 6 недель после ишемии сердца и реперфузии. *: р<0,05 по сравнению с опытной группой. #: р<0,05 по сравнению с контрольной группой. †: р<0,05 по сравнению с группой D1NLS.

Фиг. 13

Изучение эффекта усиленной экспрессии гена Skp2 на уменьшение области инфаркта миокарда. Измеряли область инфаркта миокарда у крыс через 6 недель после ишемии сердца и реперфузии для подсчета отношения к площади левого желудочка. #: р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

+: Обозначает добавление FBS и фармацевтических агентов или инфицирование различными типами аденовирусов.

-: Обозначает отсутствие добавления FBS и фармацевтических агентов или инфицирования различными типами аденовирусов.

р27: Обозначает белок р27.

Лучший способ осуществления изобретения

При осуществлении изобретения и с целью внедрения изобретения в практику, специалисты могут обратиться к обычным ссылочным руководствам в области молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и основным методам, таким как технология рекомбинантной ДНК и подобным технологиям, если не указано иного. Эти источники включают, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the 3^rd edition (Sambrook & Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology (edited by Ausubel, et al., John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology in series (Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology (edited by Barlett & Striling, Humana Press, 2003); Animal Cell Culture: A Practical Approach, the 3^rd edition (edited by Masters, Oxford University Press, 2000); Antibodies: A Laboratory Manual (edited by Harlow, et al. & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987). Реактивы и наборы для культуры клеток и экспериментов в области клеточной биологии, которые упоминаются в настоящем описании, могут быть коммерчески доступны у производителей, таких как Sigma, Aldrich, Invitrogen/GIBCO, Clontech и Stratagene.

Получение кардиомиоцитов

Кардиомиоциты как мишень для пролиферации с использованием способа по изобретению включают все клетки на стадии развития, такие как кардиомиоциты зародышевого типа, послеродового типа и зрелого типа, и определяются как клетки с по меньшей мере одним, предпочтительно, несколькими, маркерами или стандартами, подтвержденными по меньшей мере одним, предпочтительно, несколькими, методами, описанными ниже.

Экспрессия различных маркеров, специфичных для кардиомиоцитов, может быть определена общепринятыми биохимическими или иммунохимическими способами. Эти способы не ограничены. Предпочтительно, используются иммунохимические способы, такие как иммуноцитохимическое окрашивание и иммуноэлектрофорез. При этом могут быть использованы маркер-специфичные поликлональные антитела или моноклональные антитела, реагирующие с клетками-предшественниками кардиомиоцитов или с кардиомиоцитами. Антитела против индивидуальных специфичных маркеров, коммерчески доступны и могут легко использоваться. Маркеры, специфичные для клеток-предшественников кардиомиоцитов или для кардиомиоцитов, включают, например, тяжелую цепь/легкую цепь миозина, α-актинин, тропонин I, ANP, GATA-4, Nkx2,5 и MEF-2с.

С другой стороны, экспрессия маркеров, специфичных для клеток-предшественников кардиомиоцитов или для кардиомиоцитов, может быть подтверждена способами молекулярной биологии, широко используемыми в соответствующих областях для амплификации, определения и анализа мРНК, кодирующей соответствующие белковые маркеры, включая, например, полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (RT-PCR) и анализа гибридизации. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белковые маркеры (например, тяжелая цепь/легкая цепь миозина, α-актинин, тропонин I, ANP, GATA-4, Nkx2,5 и MEF-2с), специфичные для клеток-предшественников кардиомиоцитов или для кардиомиоцитов, известны и могут быть получены из общедоступных баз данных, таких как GenBank в National Center for Biotechnology. Маркер-специфичные последовательности, необходимые для использования в качестве праймеров или зондов, могут быть легко определены.

Кроме того, могут быть