Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации

Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.

Африканская чума лошадей (АЧЛ) или чума однокопытных - вирусная болезнь, протекающая остро или подостро, характеризующаяся лихорадкой, появлением отеков подкожной клетчатки, кровоизлияниями во внутренних органах.

Во время вспышки АЧЛ при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо проведение быстрых и точных экспертизных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель.

Известен способ получения антигена вируса африканской чумы лошадей для изготовления диагностикумов, включающий культивирование вируса в культуре клеток, замораживание вируссодержащей жидкости, центрифугирование, инактивацию метиленбисморфолином, после инактивации антиген концентрируют с помощью 4% ПЭГ в 35-100 раз и используют в качестве диагностического антигена [1]. Данный способ требует больших временных затрат.

Известен способ выявления вируса АЧЛ методом ПЦР, при котором в качестве мишени использован ген S10, а при проведении ПЦР использован метилгидроксид ртути [2]. Перед постановкой реакции требуется предварительное выделение форменных элементов из крови, что достаточно трудоемко. К недостаткам этого метода относится использование токсичных для здоровья человека реактивов.

Наиболее близким аналогом является способ выявления вируса АЧЛ посредством ОТ-ПЦР [3], который использует в качестве гена-мишени для праймеров фрагмент генома NS2, позволяющий амплифицировать фрагмент комплементарной ДНК размером 423 п.о. Для диагностических исследований данный размер ПЦР-продукта является недостаточным для чувствительности реакции при проведении исследований с клиническим материалом.

Целью изобретения является разработка более специфичного, чувствительного экспресс-способа и соответствующей тест-системы для выявления вируса АЧЛ с помощью ПЦР с использованием двух синтезированных пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области генома NS2, позволяющий амплифицировать фрагмент комплементарной ДНК размером 230 п.о., который повышает чувствительность реакции.

Поставленная цель достигается способом для обнаружения РНК вируса АЧЛ в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных и павших животных и/или в инфицированной культуре клеток, при котором проводят предварительную денатурацию вирусной РНК при 85°С в течение 3 мин с последующим синтезом кДНК при 42°С в течение 20 мин со специфическими праймерами, имеющими следующий нуклеотидный состав:

5'-ggt сса ctc ttg gtt atg gaa ctt tac agc-3'

5'-ggt ctg cag tca ctt tgt aag gtg tct taa agt-3'

Температурный профиль реакции, с предварительным циклом денатурации 94°С 2 мин, с последующими 30 циклами амплификации: 94°С 10 с, отжига 55°С, 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин затем проводят оценку и учет результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта с применением набора для постановки электрофореза и тест-системой, включающей 3 набора с пластиковыми флаконами и пробирками:

1. набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент и три раствора для последовательной отмывки сорбента;

2. набор для постановки ПЦР, включающий реакционную смесь для постановки ПЦР и специфических олигонуклеотидных праймеров.

3. набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.

Первый набор позволяет быстро и качественно выделить РНК вируса АЧЛ без предварительной подготовки суспензии из органов и выделения форменных элементов из крови.

При постановке ПЦР во втором наборе производится денатурация сегментированной двухцепочечной вирусной РНК при 85° и одновременная гибридизация праймеров, при этом метилгидроксид ртути не используется. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле (третий набор).

Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращения времени проведения диагностической работы в пробах органов и крови от больных животных.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление генома вируса АЧЛ проводят методом полимеразной цепной реакции, предусматривающим амплификацию кДНК вируса, электрофоретическое разделение продуктов амплификации и учет результатов реакции. При наличии в исследуемых образцах вируса африканской чумы лошадей синтезируется ДНК фрагмент длиной 230 п.о. Данный размер фрагмента способствует уменьшению времени постановки ПЦР и повышению диагностической чувствительности ПЦР.

Существенным отличием заявляемого способа является то, что:

1. Сокращение времени постановки реакции, т.к. не требуется предварительного выделения форменных элементов из стабилизированной крови.

2. Не применяется при постановке реакции метилгидроксид ртути, а заменяется денатурацией исследуемой РНК предварительным прогревом ее до 85°С и одновременной гибридизацией праймеров.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Тест-система укомплектована пластиковыми флаконами и пробирками.

Пример 1. Набор №1 для выявления нуклеиновых кислот используют для работы с пробами органов, культуральным вируссодержащим материалом и кровью.

Исследуемый материал (кровь, смывы, мазки, 10% суспензия органов) в объеме 25-100 микролитров (далее мкл) вносят в 1,5 см³ пробирку и добавляют лизирующий буфер на основе гуанидинтиоцианата и 20 мкл нуклеосорбента. В течение 5 мин пробы инкубируют при 65°С. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 200 мкл отмывочного буфера, встряхивают пробирки и центрифугируют при 5000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 500 мкл 70% спирта. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 12000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Пробирки инкубируют 5 мин при 56°С и вносят в пробирки 50 мкл бидистиллированной воды, тем самым эллюируя нуклеиновые кислоты с нуклеосорбента в воду. 5-10 мкл этого раствора используют для дальнейшего синтеза комплементарной ДНК.

Пример 2. Амплификация участка кДНК вируса АЧЛ с применением набора №2 для проведения ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами.

Тест-система апробирована на различных серотипах вируса АЧЛ. В качестве отрицательных контролей использованы штаммы родственных орбивирусов: вирусов блютанга, ЭГБО и Ибараки.

Подготавливают и подписывают пробирки объемом 0,5 см³ для N-количества образцов, в число которых входят анализируемые пробы и отрицательный контроль выделения. В каждую пробирку добавляют 3,0 мкл праймеров.

В пробирки вносят 5,0 мкл исследуемой РНК. Проводят предварительный отжиг праймеров, прогревая смесь на амплификаторе с температурным режимом:

85°С	3 мин	1 цикл
95°С	1 мин

Затем пробирки немедленно помещают в ледяную баню на 2 мин.

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N-количество образцов, состоящую из буфер для ревертазы, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 2 ед. ревертазы и пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом:

42°С	20 мин	1 цикл
70°С	3 мин

Инкубационная смесь для ПЦР с конечным объемом 25 мкл содержит: буфер для tag-полимеразы с 15 mM MgCl₂, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 5 ед. taq-полимеразы. Поверх смеси наслаиваем 25 мкл минерального масла.

Температурный режим проведения ПЦР:

94°С	1 мин	1 цикл
94°С	15 с	30 циклов
55°С	20 с
72°С	15 с
72°С	1 мин	1 цикл

Пример 3. Определение размера продуктов ПЦР с применением набора для проведения электрофореза.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле в стандартном трис-борном буфере.

10 мкл продукта ПЦ смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 15 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 230 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦ соответствует размеру фрагмента 230 пар оснований.

С применением тест-системы и рассчитанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса АЧЛ. Отрицательные контроли не амплифицировались.

Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических олигонуклеотидных праймеров, на 2-й сегмент (NS2).

Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену NS2 вируса

А ЧЛ.

Таблица
№	Наименование препаратов	Титр вируса ТЦД50/мл	Шифр	Ожидаемый результат	Фактический результат
1	вирус АЧЛ серотип 2, 10.04.2001	2,5	1	+	+
2	вирус АЧЛ серотип 3, 10.04.2001	5,0	11	+	+
3	вирус АЧЛ серотип 4, 16.11.2000	4,75	3	+	+
4	вирус АЧЛ серотип 6, 16.11.2000	5,25	10	+	+
5	вирус АЧЛ серотип 7, 18.04.2001	4,75	5	+	+
6	вирус КЛО штамм 874 (тип 2), 01.03.2002	6,5	6	-	-
7	вирус КЛО штамм 617 (тип 4),	6,5	7	-	-
8	вирус КЛО штамм 636 (тип 9),	6,0	8	-	-
9	вирус ЭГБО штамм «Нью-Джерси», 22.02.1987	6,0	9	-	-
	вирус Ибараки штамм Са саки	6,0	4	-	-
	Проба головного мозга интактной	-	2	-	-

Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует кДНК других бактерий и вирусов.

Пример 5. Выявление РНК вируса АЧЛ с применением предлагаемой тест-системы и синтетических олигонуклеотидных праймеров в пробах биологического материала, полученного от больных животных.

В гель вносят маркер молекулярного веса, а оценку проведения реакции осуществляют по размеру продукта ПЦР, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру 230 пар оснований.

Таким образом, предлагаемые тест-система и способ позволяют достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух праймеров, соответствующих размеру 230 п.о.,сократить время проведения реакции.

Источники информации

1. Патент RU №2055594, Шажко Ж.А., Егорова А.И., Исафатов A.M., Бондаренко Т.В., Костяновский Р.Г., 1996 г.

2. Zientara S., Sailleau С., Moulay S., et al. Application of the polymerase chain reaction to the detection of African horse sickness viruses. // Journal of Virological Methods. - 1995. - №53. - p.47-54.

3. Stone-Marschat M. Detection of African horse sickness virus by reverse transcription-PCR, J Clin Microbiol. 1994 March; 32(3): 697-700.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома NS2 вируса африканской чумы лошадей, используемые для выявления ДНК вируса африканской чумы лошадей, имеющие следующий нуклеотидный состав:5'-ggt сса etc ttg gtt atg gaa ctt tac agc-3';5'-ggt ctg cag tea ctt tgt aag gtg tct taa agt-3'.

2. Способ выявления вируса африканской чумы лошадей, включающий выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем что проводят предварительную денатурацию вирусной РНК при 85°С в течение 4 мин с быстрым последующим ее охлаждением, синтез кДНК проводят при 42°С в течение 30 мин, а для постановки ПЦР выбраны и синтезированы два праймера по п.1, комплементарные консервативной области генома NS2 вируса АЧЛ с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°C 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят учет результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру 230 пар оснований.

3. Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы лошадей, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: 1. набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата; 2. набор для постановки ПЦР, содержащий реакционную смесь для постановки ПЦР и синтетические олигонуклеотидные праймеры по п.1; 3. набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.