Слитые белки карциноэмбрионального антигена

Слитые белки карциноэмбрионального антигена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к терапии рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим слитые белки, причем слитые белки содержат по меньшей мере часть опухолеспецифического полипептидного карциноэмбрионального антигена. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам и хозяевам, содержащим указанные полинуклеотиды, очищенные слитые белки и способы усиления иммунного ответа против СЕА с использованием этих композиций и молекул, описанных здесь.

Уровень техники

Суперсемейство иммуноглобулинов (IgSF) состоит из многочиленных генов, которые кодируют белки с разнообразными функциями, одной из которых является межклеточная адгезия. Белки IgSF содержат по меньшей мере один Ig-связанный домен, который является важным для сохранения правильных взаимодействий межмолекулярного связывания. Поскольку такие взаимодействия являются необходимыми для разнообразных биологических функций членов IgSF, нарушенная или аберрантная экспрессия многих молекул адгезии IgSF коррелировала со многими заболеваниями человека.

Карциноэмбриональный антиген (СЕА) принадлежит к подсемейству суперсемейства Ig, состоящему из гликопротеинов, известных как СЕА-связанные молекулы клеточной адгезии (СЕАСАМ). Было показано, что СЕАСАМ действуют в качестве молекул как гомотипической, так и гетеротипической межклеточной адгезии (Benchimol et al., Cell 57: 327-334 (1989)). Кроме клеточной адгезии, СЕА (также известный как СЕАСАМ5) ингибирует смерть клеток, происходящую при отделении клеток от внеклеточного матрикса, и может способствовать клеточной трансформации (перерождению клеток), связанной с определенными протоонкогенами, такими как Bcl2 и C-Myc (см. Bernstein, J. Clin. Oncol. 20(8): 2197-2207 (2002)). Последовательности, кодирующие СЕА человека, были клонированы и охарактеризованы (патент США № 5274087; патент США № 5571710 и патент США № 6843761. См. также Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol. 7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:920-924 (1987); Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(9):2965-69 (1987)).

Нормальная экспрессия СЕА была обнаружена во время эмбрионального развития и в слизистой оболочке ободочной кишки взрослых. Сверхэкспрессия СЕА была впервые обнаружена в опухолях ободочной кишки человека более тридцати лет тому назад (Gold and Freedman, J. Exp. Med. 121:439-462 (1965)) и с тех пор была обнаружена почти во всех колоректальных опухолях. Кроме того, сверхэкспрессия СЕА обнаруживается в большом проценте аденокарцином поджелудочной железы, печени, молочной железы, яичника, шейки матки и легкого. Вследствие его преобладания в этих типах опухолей и ограниченной экспрессии в нормальных тканях СЕА считают опухолеспецифическим аутоантигеном и мишенью для активной и пассивной иммунотерапии. Недавние клинические данные установили, что различные подходы вакцинации могут образовывать В- и Т-клетки человека, специфические в отношении СЕА, обеспечивая дополнительное доказательство того, что СЕА является мишенью для молекулярного и иммунологического вмешательства для лечения этих типов рака.

Терапевтические подходы нацеливания на СЕА включают в себя использование анти-СЕА-антител (см. Chester et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46 (Suppl): S8-S12 (2000)), а также вакцин на основе СЕА (для обзора см. Berinstein, supra). Развитие и промышленное внедрение многих вакцин тормозились трудностями, связанными с получением высоких уровней экспрессии экзогенных генов. Успех вакцин на основе ДНК также тормозился неспособностью получать иммунный ответ достаточного размера у индивидуумов. Хотя были разработаны ДНК-вакцины, нацеленные на различные белки, полученные иммунные ответы были относительно слабыми по сравнению с общепринятыми вакцинами.

Легкость манипуляции ДНК является благоприятной возможностью разработки вакцин, в том числе стратегий слитой конструкции генов, в которых антигены связаны с различными иммуноусиливающими элементами. Усиление иммунного ответа на антигены-мишени было продемонстрировано на моделях животных с использованием векторов, кодирующих антигены, слитые с белком теплового шока (HSP) 70 (Liu et al., J. Virol. 74: 2888-94 (2000); Cheng et al., J. Immunol. 166: 6218-26 (2001); Chen et al., Cancer Res. 60: 1035-42 (2000)) с Fc-частью IgG1 (You et al., J. Immunol. 165: 4581-92 (2000)), со связанным с лизосомой мембранным белком (LAMP) (Su et al., Cancer Res. 62: 5041-48 (2002)) и универсальным Тh-эпитопом из столбнячного токсина (Renard et al., J. Immunol. 171:1588-95 (2003); King et al., Nature Med. 4: 1281-86 (1998); Lund et al., Cancer Gene Ther. 10: 365-76 (2003); Padua et al., Nature Med. 9(11): 1413-17 (2003); Savelyeva et al., Nature Biotechnol. 19: 760-64 (2001); Wahren et al., WO 2004/092216). Усиление иммунных ответов на антигены-мишени является особенно важным для противораковых вакцин ввиду ограниченной иммуногенности опухолевых антигенов и необходимости преодоления толерантности к проявлению эффективных противоопухолевых эффектов.

Таким образом, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого типа, кодирующих белки СЕА, описанные выше, была бы крайне желательна разработка вакцины, которая способна индуцировать усиленный СЕА-специфический иммунный ответ в отношении полноразмерной кДНК СЕА дикого типа при введении млекопитающему. Была бы также желательна разработка способов лечения или профилактики СЕА-обусловленных раков, использующих молекулы нуклеиновых кислот или белки, которые безопасно и эффективно усиливают СЕА-специфический иммунный ответ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим слитые белки, причем эти слитые белки содержат по меньшей мере часть опухолеспецифического полипептидного карциноэмбрионального антигена, слитую с существенной частью иммуноусиливающего элемента, такого как бактериальный токсин. В предпочтительных вариантах осуществления СЕА-часть кодируемого слитого белка СЕА делетирована на С-конце якорного домена. В предпочтительных вариантах осуществления иммуноусиливающим элементом является А- или В-субъединица термолабильного энтеротоксина E. coli или его существенная часть. В других предпочтительных вариантах осуществления иммуноусиливающим элементом является минимизированный домен фрагмента С столбнячного токсина (DOM) или его существенная часть. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, в том числе, но не только, аденовирусам и плазмидным векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, и клеткам-хозяевам, содержащим указанные рекомбинантные векторы. Представлены также очищенные слитые белки, кодируемые полинуклеотидами настоящего изобретения.

Дополнительно настоящее изобретение относится к способам ингибирования или профилактики развития рака у млекопитающего путем индукции иммунного ответа на белок СЕА введением вакцины или фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь слитые конструкции СЕА или слитые белки. В предпочтительных вариантах описанных здесь способов такой иммунный ответ усилен по сравнению с ответом, индуцированным вакциной СЕА дикого типа.

В контексте всего описания изобретения и прилагаемой формулы изобретения используются следующие определения и аббревиатуры:

Термин «промотор» относится к сайту распознавания на цепи ДНК, с которой связывается РНК-полимераза. Промотор образует инициирующий комплекс с РНК-полимеразой для инициации и запуска транскрипционной активности. Этот комплекс может быть модифицирован активирующими последовательностями, называемыми «энхансерами», или ингибирующими последовательностями, называемыми «сайленсерами».

Термин «кассета» обозначает нуклеотидную или генную последовательность, которая экспрессируется из вектора, например, нуклеотидная или генная последовательность, кодирующая слитую конструкцию hCEA-LTB. Обычно кассета содержит последовательность гена, которая может быть встроена в вектор, который в некоторых вариантах осуществления имеет регуляторные последовательности для экспрессии нуклеотидной или генной последовательности. В других вариантах осуществления эта нуклеотидная или генная последовательность имеет некоторые регуляторные последовательности для их экспрессии. В дополнительных вариантах осуществления, вектор имеет некоторые регуляторные последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность имеет другие регуляторные последовательности. Например, вектор может иметь промотор для транскрибирования нуклеотидной или генной последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность имеет последовательность терминации транскрипции. Регуляторные последовательности, которые могут находиться в векторе, включают в себя, но ими не ограничиваются, энхансеры, последовательности терминации транскрипции, акцепторные и донорные последовательности сплайсинга, интроны, последовательности связывания рибосом и последовательности поли(А)-добавления.

Термин «вектор» относится к одному из средств, при помощи которого ДНК-фрагменты могут быть введены в организм-хозяин или в ткань-хозяин. Имеются различные типы векторов, в том числе плазмида, вирус (в том числе аденовирус), бактериофаги и космиды.

Термин «первая генерация», в применении к аденовирусным векторам, описывает аденовирусные векторы, которые являются дефектными по репликации. Аденовирусные векторы первой генерации обычно имеют делетированный или инактивированный район гена Е1 и, предпочтительно, имеют делетированный или инактивированный район гена Е3.

Аббревиатура «DOM» обычно обозначает N-концевой домен фрагмента С столбнячного токсоида.

Аббревиатура «LT» обычно обозначает термолабильный энтеротоксин E. coli. «LT» может обозначать полный энтеротоксин, содержащий субъединицы А и В или существенную часть субъединицы А, или существенную часть субъединицы В. Аббревиатура “LTA” обозначает субъединицу А термолабильного энтеротоксина E. coli или ее существенную часть, в том числе субъединицы, которые укорочены на С-конце или N-конце, но сохраняют биологическую активность, а также субъединицы, которые содержат внутренние аминокислотные инсерции, делеции или замены, но сохраняют биологическую активность. Аббревиатура «LTB» обозначает В-субъединицу термолабильного энтеротоксина E. coli или ее существенную часть, в том числе субъединицы, которые укорочены на С-конце или N-конце, но сохраняют биологическую активность, а также субъединицы, которые содержат внутренние аминокислотные инсерции, делеции или замены, но сохраняют биологическую активность.

Под обозначением «pV1J/hCEAopt» понимают плазмидную конструкцию, описанную здесь, содержащую предранний (IE) промотор CMV с интроном А, полноразмерный оптимизированный в отношении кодонов ген СЕА человека, полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции и минимальный каркас pUC (см. пример 2). Под обозначением «pV1J/hCEA» понимают конструкцию, по существу такую же, что и описанная выше, за исключением того, что эта конструкция содержит ген СЕА дикого типа человека вместо оптимизированного в отношении кодонов гена СЕА человека.

Под обозначением «pV1J/hCEA-LTB» понимают плазмидную конструкцию, описанную здесь, содержащую предранний (IE) промотор CMV с интроном А, ген СЕА человека, лишенный его кодирующей якорь GPI последовательности, слитый на его С-конце с субъединицей В термолабильного энтеротоксина E. coli, полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции и минимальный каркас pUC.

Под обозначением «pV1J/hCEAopt-LTB» понимают конструкцию, по существу такую же, как описано непосредственно выше, за исключением того, что эта конструкция содержит оптимизированный в отношении кодонов ген СЕА человека, лишенный его кодирующей якорь GPI последовательности, вместо соответствующей части гена СЕА дикого типа человека.

Под обозначением «pV1J/hCEAopt-LTBopt» понимают конструкцию, по существу такую же, как описано непосредственно выше, за исключением того, что как последовательности СЕА, так и последовательности LTB являются оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии высокого уровня в клетках человека.

Под обозначением «pV1J/rhCEAopt-LTBopt» понимают конструкцию, по существу такую же, как описано выше, за исключением того, что оптимизированный в отношении кодонов ген СЕА человека заменен геном СЕА макака-резуса, оптимизированным в отношении кодонов, для экспрессии высокого уровня в клетках человека.

Под обозначением «pV1J/hCEA-LTА» понимают плазмидную конструкцию, описанную здесь, содержащую предранний (IE) промотор CMV с интроном А, ген СЕА человека, лишенный его кодирующей якорь GPI последовательности, слитый на его С-конце с субъединицей А термолабильного энтеротоксина E. coli, полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции и минимальный каркас pUC. Конструирование плазмидных векторов, содержащих различные слитые конструкции СЕА-LT, описано в примере 2.

Под обозначением «pV1J/hCEA-DOM» понимают плазмидную конструкцию, описанную здесь, содержащую предранний (IE) промотор CMV с интроном А, ген СЕА человека, лишенный его кодирующей якорь GPI последовательности, слитый на его С-конце с N-концевым доменом фрагмента С столбнячного токсоида (DOM), полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции, и минимальный каркас pUC (пример 2).

Под обозначением «pV1J/rhCEAopt-DOMopt» понимают конструкцию, по существу такую же, как описано выше, за исключением того, что оптимизированный в отношении кодонов ген СЕА человека заменен геном СЕА макака-резуса, оптимизированным в отношении кодонов, для экспрессии высокого уровня в клетках человека.

Под обозначением «pV1J/hCEA-FcIgG» понимают плазмидную конструкцию, описанную здесь, содержащую предранний (IE) промотор CMV с интроном А, ген СЕА человека, лишенный кодирующей якорь GPI последовательности, слитый на его С-конце c тяжелым фрагментом константной цепи иммуноглобулина G1, полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции, и минимальный каркас pUC (пример 2). pV1J/hCEAopt-FcIgGopt обозначает конструкцию, по существу такую же, как описано, за исключением того, что нуклеотидные последовательности, кодирующие СЕА и FcIgG, были оптимизированы в отношении кодонов для экспрессии высокого уровня в клетках человека.

Под обозначением «Ad5/hCEAopt» и «Ad5/hCEA» понимают две конструкции, описанные здесь, которые содержат аденовирусный геном Ad5, в котором делетированы районы Е1 и Е3. В конструкции «Ad5/hCEAopt» район Е1 заменен оптимизированным в отношении кодонов геном СЕА человека в параллельной Е1 ориентации под контролем промотора CMV человека без интрона А, за которым следует сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. Конструкция «Ad5/hCEA» является по существу такой же, как описано выше, за исключением того, что район Е1 генома Ad5 заменен последовательностью СЕА дикого типа человека. Под обозначением «Ad5/hCEAopt-LTB» понимают конструкцию Ad5, по существу такую же, как описано выше, за исключением того, что оптимизированная в отношении кодонов последовательность СЕА человека лишена кодирующей якорь GPI последовательности и слита на ее С-конце с субъединицей В термолабильного энтеротоксина E. coli. Конструирование аденовирусных векторов, содержащих различные слитые конструкции СЕА-LT, описано в примере 3.

«Иммуноусиливающий элемент» обозначает часть слитых белков СЕА настоящего изобретения, которая способна стимулировать или усиливать иммунный ответ на связанный белок СЕА, родственный полноразмерному СЕА дикого типа. Иммуноусиливающие элементы настоящего изобретения выбраны из группы, состоящей из белка теплового шока (HSP) 70, связанного с лизосомой мембранного белка (LAMP), фрагмента С столбнячного токсоида (FrC), N-концевого домена FrC (DOM), тяжелого фрагмента константной цепи иммуноглобулина G1 (FcIgG), гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSV-G), холерного токсина (СТ) из Vibrio cholerae и термолабильного энтеротоксина E. coli (LT). Термин «иммуноусиливающий элемент» используется взаимозаменяемо с термином «адъювант».

Как используется здесь, «слитый белок» обозначает белок, имеющий по меньшей мере два ковалентно связанных полипептида, где один полипептид происходит из одной последовательности белка или домена, а другой полипептид происходит из второй последовательности белка или домена. Слитые белки по изобретению содержат полипептид СЕА или его фрагмент или вариант и второй полипептид, который содержит существенную часть иммуноусиливающего элемента, который, в некоторых случаях, является бактериальным токсином. Полипептид СЕА, его фрагмент или вариант может быть СЕА человека или СЕА-гомологом другого вида. Полипептиды, которые составляют слитый белок, предпочтительно, связаны по типу N-конец - С-конец. Полипептид СЕА и субъединица токсина могут быть слиты в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, С-конец полипептида СЕА слит с N-концом субъединицы токсина, как представлено, например, на фигуре 1А. Однако также рассматриваются слитые белки, в которых иммуноусиливающий элемент слит с N-концом полипептида СЕА. Предполагается, что термин «слитый белок СЕА» является общим термином, который относится к слитой конструкции, описанной выше, которая содержит полипептид СЕА или его фрагмент или вариант, слитый с полипептидом, содержащим иммуноусиливающий элемент.

Термин «слитая конструкция СЕА-LT» обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, в которой по меньшей мере часть гена СЕА слита с существенной частью либо субъединицы LTA, либо субъединицы LTB термолабильного энтеротоксина E. coli. Термин «слитый белок СЕА-LT» обозначает полипептид, кодируемый слитой конструкцией СЕА-LT. Предполагается, что термины «слитая конструкция СЕА-LT» и «слитый белок СЕА-LT» также обозначают их фрагменты, их гомологи и их функциональные эквиваленты (вместе называемые «вариантами») такие как фрагменты, гомологи и эквиваленты, в которых одна или несколько аминокислот инсертированы, делетированы или заменены другой аминокислотой (другими аминокислотами). Слитые конструкции СЕА-LT по изобретению при введении млекопитающему, например, человеку, могут стимулировать иммунный ответ посредством хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток или могут стимулировать продуцию антител по меньшей мере так же хорошо, как и последовательность СЕА «дикого типа». В предпочтительных вариантах осуществления изобретения слитая конструкция СЕА-LT может усиливать иммунный ответ по сравнению с СЕА дикого типа.

Термин «слитая конструкция СЕА-DOM» обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, в которой по меньшей мере часть гена СЕА слита с существенной частью минимизированного домена фрагмента С столбнячного токсина, если контекст ясно указывает на то, что указанный термин относится к этой белковой последовательности. Термин «слитый белок СЕА-DOM» обозначает полипептид, кодируемый описанной слитой конструкцией СЕА-DOM. Предполагается, что термины «слитая конструкция СЕА-DOM» и «слитый белок СЕА-DOM» также обозначают их фрагменты, их гомологи и их функциональные эквиваленты (вместе называемые «вариантами»), такие как фрагменты, гомологи и эквиваленты, в которых одна или несколько аминокислот инсертированы, делетированы или заменены другой аминокислотой (другими аминокислотами). Слитые конструкции СЕА-DOM по изобретению при введении млекопитающему, например, человеку, могут стимулировать иммунный ответ посредством хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток или могут стимулировать продукцию антител по меньшей мере так же хорошо, как и последовательность СЕА «дикого типа». В предпочтительных вариантах осуществления изобретения слитая конструкция СЕА-DOM может усиливать иммунный ответ по сравнению с СЕА дикого типа.

Аббревиатура «AD» обозначает якорный домен гена или белка СЕА. Якорный домен СЕА дикого типа человека расположен от приблизительно аминокислоты 679 до приблизительно аминокислоты 702 последовательности SEQ ID NO:20.

Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Индивидуумы, нуждающиеся в лечении, включают в себя как индивидуумов с уже имеющимися нарушениями, так и индивидуумов, которые предрасположены к возникновению этого нарушения, или индивидуумов, у которых должно быть предотвращено это нарушение.

«Нарушение» является любым состоянием, которое бы имело пользу от лечения молекулами по изобретению, в том числе молекулами нуклеиновых кислот, описанных здесь, и слитыми белками, которые кодируются указанными молекулами нуклеиновых кислот. Термин «нарушение» включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, которые делают млекопитающее предрасположенным к рассматриваемому нарушению. Предполагается применение молекул изобретения для лечения нарушений или состояний, отличающихся патологической пролиферацией, включающих в себя, но ими не ограничивающихся, рак молочной железы, колоректальный рак и рак легкого.

Термин «эффективное количество» обозначает количество вакцинной композиции, достаточное при его введении для получения адекватных уровней полипептида, так что индуцируется иммунный ответ. Специалисту в данной области будет понятно, что этот уровень может изменяться.

«Консервативная замена аминокислот» обозначает замену одного аминокислотного остатка другим химически сходным аминокислотным остатком. Примерами таких консервативных замен являются замена одного гидрофобного остатка (изолейцина, лейцина, валина или метионина) другим; замена одного полярного остатка другим полярным остатком с таким же зарядом (например, замена лизина на аргинин; аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту).

«hCEA» и «hCEAopt» обозначают карциноэмбриональный антиген человека и оптимизированный в отношении кодонов карциноэмбриональный антиген человека, соответственно.

«rhCEA» и «rhCEAopt» обозначают карциноэмбриональный антиген макака-резуса и оптимизированный в отношении кодонов карциноэмбриональный антиген макака-резуса, соответственно.

«По существу сходные» обозначает, что конкретная последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 75%, предпочтительно, на 85%, более предпочтительно, на 90% и, еще более предпочтительно, на 95% ссылочной последовательности. В изобретении ссылочной последовательностью могут быть релевантные части нуклеотидной или аминокислотной последовательности дикого типа СЕА человека или нуклеотидная или аминокислотая последовательность дикого типа бактериального токсина или его субъединицы, например, субъединиц LTB или LTA термолабильного энтеротоксина E. coli, как указывается в описании. Ссылочной последовательностью может быть, например, последовательность СЕА дикого типа макака-резуса. Таким образом, последовательность белка СЕА, которая является «по существу сходной» с белком СЕА дикого типа человека или его фрагментом, будет идентична по меньшей мере на 75% релевантному фрагменту СЕА дикого типа человека по длине этого фрагмента, идентична, предпочтительно, на 85%, более предпочтительно, на 90% и, еще более предпочтительно, на 95%. Является ли конкретная последовательность белка или нуклеотидная последовательность СЕА, LTB или LTA «по существу сходной» со ссылочной последовательностью, может быть определено, например, сравнением последовательности с использованием программы для анализа последовательности, такой как компьютерная программа GAP, версия 6.0, доступная из University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Программа GAP использует способ сопоставления Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), проверенный Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981).

«Существенная часть» гена, его варианта, фрагмента или субъединицы обозначает часть по меньшей мере 50%, предпочтительно, 75%, более предпочтительно, 90% или, еще более предпочтительно, 95%, ссылочной последовательности.

«Ген» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой кодирует молекулу полипептида. Гены могут быть непрерывными последовательностями нуклеотидов или они могут включать в себя такие встроенные сегменты, как интроны, промоторные районы, сайты сплайсинга и повторяющиеся последовательности. Геном может быть либо РНК, либо ДНК. Предпочтительным геном является ген, который кодирует пептид по изобретению.

Термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» обозначает рибонуклеиновую кислоту (РНК) или дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), зонды, олигонуклеотиды, их фрагмент или их части и праймеры. ДНК может быть либо комплементарной ДНК (кДНК), либо геномной ДНК, например, геном, кодирующим слитый белок СЕА.

«СЕА дикого типа», или «белок дикого типа», или «wt-белок» обозначает белок, содержащий природную последовательность аминокислот, или его вариант. Аминокислотная последовательность СЕА дикого типа человека показана на фигуре 7Е (SEQ ID NO:20). Аминокислотная последовательность СЕА дикого типа макака-резуса была описана ранее (WO 2004/072287, см. фигуры 7А-7В).

«Ген СЕА дикого типа» обозначает ген, содержащий последовательность нуклеотидов, которая кодирует природный белок СЕА, в том числе белки, полученные у человека, или белки, полученные из другого организма, в том числе, но не только, других млекопитающих, таких как крыса, мышь и макак-резус. Нуклеотидная последовательность гена СЕА человека является доступной в этой области (supra). См. также Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol. 7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:920-924 (1987); Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(9):2965-69 (1987). Нуклеотидная последовательность гена дикого типа макака-резуса показана на фигурах 7С-7D.

Термин «млекопитающее» относится к любому млекопитающему, в том числе и человеку.

Аббревиатура «Ag» обозначает антиген.

Аббревиатуры «Ab» и «mAb» обозначают антитело и моноклональное антитело, соответственно.

Аббревиатура «ORF» обозначает открытую рамку считывания гена.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 схематически представлены векторы, разработанные в этом исследовании. Показаны основные признаки плазмидных векторов и Ad-векторов, кодирующих слитые конструкции СЕА-LTA и СЕА-LTB. Показаны также инвертированные концевые повторы (ITR) генома Ad5.

На фигуре 2 показаны нуклеотидная (SEQ ID NO:7, панель А) и аминокислотная (SEQ ID NO:8, панель В) последовательности слитой конструкции hCEA-LTA, приведенной в качестве примера. Нуклеотидная последовательность LTA показана жирным шрифтом.

На фигуре 3 показаны нуклеотидная (SEQ ID NO:9, панель А) и аминокислотная (SEQ ID NO:10, панель В) последовательности слитой конструкции hCEA-LTВ, приведенной в качестве примера. Нуклеотидная последовательность LTВ показана жирным шрифтом.

На фигуре 4 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) слитой конструкции hCEAopt-LTB, приведенной в качестве примера. Нуклеотидная последовательность LTB показана жирным шрифтом.

На фигуре 5 показаны нуклеотидная (SEQ ID NO:12, панель А) и аминокислотная (SEQ ID NO:13, панель В) последовательности полностью оптимизированной слитой конструкции hCEA-LTB, обозначенной здесь hCEAopt-LTBopt, приведенной в качестве примера. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности LTB показаны жирным шрифтом. Последовательности мест соединений, созданные стратегией клонирования, используемой для слитой конструкции последовательностей СЕА и LTB, подчеркнуты.

На фигуре 6 показаны нуклеотидная (SEQ ID NO:14, панель А) и аминокислотная (SEQ ID NO:15, панель В) последовательности полностью оптимизированной слитой конструкции CEA-LTB макака-резуса, обозначенной здесь rhCEAoptLTBopt, приведенной в качестве примера. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности LTB показаны жирным шрифтом. Последовательности мест соединений, созданные стратегией клонирования, используемой для слитой конструкции последовательностей СЕА и LTB, подчеркнуты.

На фигуре 7 показаны нуклеотидные последовательности генов дикого типа, кодирующих СЕА макака-резуса (панели А и В, SEQ ID NO:16 и 17) и аминокислотные последовательности соответствующих белков (панели С и D, SEQ ID NO:18 и 19), описанных ранее (U.S.S.N. 60/447203). Панель Е показывает аминокислотную последовательность СЕА дикого типа человека (SEQ ID NO:20), которая была описана ранее (см., например, патент США № 5274087).

На фигуре 8 показано сравнение эффективности экспрессии в клетках, трансфицированных различными конструкциями СЕА. Панель А изображает эффективности экспрессии клеток HeLa, трансфицированных 3 мкг плазмид, несущих последовательности дикого типа hCEA, hCEA-LTA и hCEA-LTB, вместе с 0,2 мкг плазмиды pV1J/mEPO в качестве индикатора. Панель В показывает результаты из сходного эксперимента по трансфекции с использованием pV1J/hCEAopt и pV1J/hCEAopt-LTB. Эффективность экспрессии определяли через 3 дня после трансфекции измерением количества белка СЕА, присутствующего в клеточных экстрактах и нормализацией этой величины в отношении экспрессии ЕРО. Показанные результаты относятся к средним величинам экспрессии СЕА двух независимых трансфекций.

На фигуре 9 показано сравнение эффективности экспрессии различных аденовирусных рекомбинантных векторов, экспрессирующих СЕА. Клетки HeLa инфицировали при множественности заражения (moi) 100 и 1000 Ad/hCEAopt и Ad/hCEAopt-LTB. Эффективность экспрессии определяли измерением через 3 дня после инфицирования эффективного количества белка СЕА, высвобождаемого в клеточные экстракты. Показанные результаты отражают средние величины экспрессии СЕА двух независимых инфицирований.

На фигуре 10 показан анализ клеточно-опосредованного иммунного ответа, индуцированного различными плазмидными векторами, кодирующими СЕА человека. Трем группам мышей С57BL/6 внутримышечно электроинъецировали 50 мкг указанной плазмиды (СЕА, слитая конструкция СЕА-LTA или слитая конструкция СЕА-LTB) при 0-3 неделях. Четвертую группу мышей иммунизировали смесью 25 мкг pV1J/hCEA-LTA и 25 мкг pV1J/hCEA-LTB. Панель А. Через две недели после стимуляции количество IFNγ-секретирующих Т-клеток, специфических в отношении СЕА, определяли анализом ELISPOT на спленоцитах индивидуальных мышей (белые кружки) с использованием пулов пептидов, которые включают в себя весь этот белок. Указаны также геометрические средние величины (черные ромбы). Панель В изображает внутриклеточное окрашивание IFNγ объединенных спленоцитов из иммунизированных мышей с использованием пула пептидов D. Для каждой группы показано неспецифическое продуцирование IFNγ (ДМСО).

На фигуре 11 показаны титры антител мышей, иммунизированных плазмидными ДНК-векторами, кодирующими СЕА. Индивидуальные титры против очищенного белка СЕА человека измеряли при помощи ELISA на сыворотке из индивидуальных мышей, иммунизированных плазмидами pV1J/hCEA, pV1J/hCEA-LTА и pV1J/hCEA-LTВ. Показаны также средние величины (черные ромбы).

На фигуре 12 показан анализ клеточно-опосредованного иммунного ответа, индуцированного различными плазмидными векторами, кодирующими СЕА. Группы из 4 мышей BALB/c электроинъецировали указанной плазмидой, как описано выше (фигура 4). Через две недели после последней инъекции количество IFNγ-секретирующих Т-клеток, специфических в отношении СЕА, определяли анализом ELISPOT на спленоцитах из индивидуальных мышей (белые кружки) с использованием пулов пептидов, которые включают в себя весь этот белок. Указаны также средние величины (черные ромбы).

На фигуре 13 показан анализ реакции СЕА-специфических CD8⁺ Т-клеток, индуцированной различными плазмидными векторами, кодирующими СЕА. Мышей С57/DR4 электроинъецировали указанной плазмидой, как описано выше (см. фигуру 4). Через две недели после последней инъекции IFNγ-секретирующие Т-клетки окрашивали с использованием пула пептидов D. Для каждой группы показано неспецифическое продуцирование IFNγ (ДМСО).

На фигуре 14 показан анализ реакции СЕА-специфических CD8⁺ Т-клеток, индуцированной различными плазмидными векторами, кодирующими СЕА. Мышей HHD электроинъецировали указанной плазмидой, как описано выше (см. фигуру 4). Через две недели после последней инъекции выполняли внутриклеточное окрашивание IFNγ с использованием пулов пептидов В и D. Для каждой группы показана неспецифическая продуция IFNγ (ДМСО).

На фигуре 15 показан клеточно-опосредованный и гуморальный иммунный ответ СЕА-трансгенных мышей (N=9), иммунизированных 5 электроинъекциями один раз в неделю указанных плазмид. Общее количество 50 мкг плазмидной ДНК инъецировали внутримышечно при каждой вакцинации. Панель А. Через две недели после последней инъекции количество IFNγ-секретирующих Т-клеток, специфических в отношении СЕА, определяли внутриклеточным окрашиванием на спленоцитах из индивидуальных мышей (кружки) с использованием пула пептидов D. Показаны также величины геометрического среднего (треугольники). Панель В. Индивидуальные титры против очищенного белка СЕА человека измеряли при помощи ELISA на каждой сыворотке из мышей, иммунизированных плазмидами pV1J/hCEAopt и pV1J/hCEA-LTВ. Показаны также величины геометрического среднего (черные ромбы). Эти результаты указывают на то, что слитая конструкция СЕА-LTB разрушает толерантность к СЕА в трансгенных мышах.

На фигуре 16 показан анализ реакции СЕА-специфических CD8⁺ Т-клеток, индуцированной различными аденовирусными векторами, кодирующими СЕА. СЕА-трансгенных мышей иммунизировали различными дозами Ad/hCEAopt и Ad/hCEAopt-LTB при 0 и 2 неделях. Через две недели после последней инъекции выполняли внутриклеточное окрашивание IFNγ PBMC из каждой индивидуальной мыши с использованием пула пептидов D (черные кружки). Показаны также величины геометрического среднего (черные ромбы). Неспецифическое продуцирование IFNγ (ДМСО) каждой инъецированной группы было меньше или равно 0,01%.

На фигуре 17 показаны результаты исследований по защите от опухолей иммунизированных СЕА-трансгенных мышей, провоцированных клетками МС38-СЕА. Группы из 10 СЕА-трансгенных мышей иммунизировали 5 еженедельными электроинъекциями указанной плазмидной ДНК (50 мкг/инъекция). Через две недели после последней инъекции мышей повторно иммунизировали единственной инъекцией 1·10¹⁰ вч (вирусных частиц) соответствующего Ad-вектора. Через 14 дней после повторной иммунизации аденовирусом мышей иммунизировали подкожной инъекцией 5·10⁵ клеток МС38-СЕА. Панель А показывает процент не имеющих опухолей мышей в указанной временной точке. Панель В показывает средние объемы опухолей каждой иммунизированной группы. Эти результаты показывают, что иммунизация СЕА-трансгенных мышей СЕА-LTB защищает мышей от развития опухолей.

Фигура 18. На панели А схематически представлены репрезентативные слитые белки СЕА, использованные в данном исследовании. Векторы, экспрессирующие слитые белки СЕА, были получены из плазмиды pV1Jns, как описано в примере 2. Эти конструкции содержат нуклеотидную последовательность СЕА нуклеотид (nt) 1 - нуклеотид (nt) 2037 с общей делецией 64 аминокислот (аа), соответствующих GPI-якорной последовательности, и экспрессируют СЕА аминокислота (аа) 1 - аминокислота (аа) 679. Указаны также координаты последовательности каждого белка, слитого с СЕА. Панель В показывает экспрессию pV1J-производных конструкций в трансфицированных клетках. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами pV1J/CEA-VSV-G, pV1J/CEA-FcIgG, pV1J/CEA-DOM, pV1J/CEA-HSP70, pV1J/CEA-LAMP или pV1J/СЕА и обрабатывали для Вестерн-блот-анализа, как описано в примере 5. Указана специфичность антитела, используемого для Вестерн-блота. Показан белок СЕА (черная стрелка). Показаны также положения стандартов молекулярных масс (в килодальтонах).

На фигуре 19 показано сравнение эффективности экспрессии слитых конструкций СЕА. Клетки HeLa трансфицировали указанными плазмидами и произведенный из СЕА белок, присутствующий в клеточных лизатах (А) и супернатантах (В), измеряли при помощи ELISA, как описано в примере 8. Полученные результаты являются репрезентативными результатами двух независимых экспериментов.

На фигуре 20 показано сравнение иммуногенности различных конструкций, кодирующих слитые белки СЕА. Мышей С57BL/6 электропорировали внутримышечно с использованием 5 или 50 мкг на дозу указанных плазмид. Инъекции проводили в дни 0 и 14. Количество IFNγ-секретирующих Т-клеток в PBMC в каждой индивидуальной мыши определяли с использованием пула пептидов, охватывающего аминокислоты 497-703 (пул D), как описано в примерах 6 и 15. Показано также среднее количество IFNγ-секретирующих Т-клеток (черные кру