Сшитые кристаллы липазы, композиция на их основе и способ их получения

Сшитые кристаллы липазы, композиция на их основе и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к сшитым кристаллам протеина, которые характеризуются способностью переходить из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму при изменении среды, окружающей указанные кристаллы, причем указанное изменение включает: изменение температуры, изменение величины рН, изменение химического состава, переход из концентрата в разбавленную форму, изменение окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменение падающей радиации, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фтора, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации металлических хелатирующих агентов, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. В соответствии с одним из вариантов изобретения такие сшитые кристаллы протеина способны выделять свою протеиновую активность с контролируемой скоростью. В настоящем изобретении предложены способы получения таких сшитых кристаллов протеина, способы использования их для доставки протеина и способы использования их в очищающих агентах, включая детергенты, в терапевтических композициях, в фармацевтических композициях, вакцинах, композициях личной гигиены, включая косметику, композициях для ветеринарии, пищевых продуктах, кормах, диагностических агентах и композициях для удаления загрязнений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Протеины используют в широком спектре применений в областях промышленной химии, в фармацевтических препаратах, в продуктах для ветеринарии, в косметике и в других потребительских товарах, в продуктах питания, в кормах, в диагностических агентах и агентах для дегазации. Иногда такие применения бывают ограничены в связи с затруднениями, которые присущи самим протеинам или создаются окружением или средой, в которой их используют. Такие затруднения могут привести к плохой растворимости протеинов, изменчивости характеристик или высокой стоимости. Для того чтобы протеины могли полностью реализовать свой потенциал в областях их использования, их функции не должны чрезмерно зависеть от окружающей их среды. В прошлом элементы окружающей среды часто создавали препятствия широкому использованию протеинов.

Для преодоления таких барьеров были использованы различные подходы. Однако эти подходы приводили либо к потере протеиновой активности, либо приводили к дополнительным расходам на стабилизирующие протеины носители или композиции.

Одним уникальным подходом к преодолению препятствий для широкого использования протеинов является технология сшитых кристаллов фермента («CLEG™») [N.L.Clair and M.A. Navia, J. Am. Chem. Soc., 114, pp 4314-16 (1992)]. Сшитые кристаллы фермента сохраняют свою активность в условиях окружения, которое обычно не совместимо с функционированием фермента. Такие условия окружения включают длительное экспонирование протеазам и другим агентам, расщепляющим протеин, высокие температуры или экстремальные значения рН. В таких условиях окружающей среды сшитые кристаллы протеина остаются нерастворимыми и стабильными.

Растворимость протеинов, приводящая к контролируемому высвобождению или растворению протеина, играет важную роль во многих областях промышленности и медицины. Такие области включают те, которые касаются очищающих агентов, включая детергенты, фармацевтических агентов, включая терапевтические агенты и вакцины, потребительских продуктов и предметов личной гигиены, продуктов ветеринарии, пищевых продуктов, кормов, диагностических агентов и дегазирующих агентов. Были предложены различные подходы к достижению контролируемого выделения. Они включают инкапсулирование, такое как раскрыто в патентах США № 4579779 и 5500223. Другие подходы включают использование механических или электрических приспособлений и осмотические насосы.

Контролируемое выделение (высвобождение) в области фармацевтики достигалось различными средствами. В патенте США 5569467 раскрыто использование микрочастиц с длительным высвобождением, включающих биосовместимый полимер и фармацевтический агент, который выделяется по мере разложения полимера. Патент США 5603956 относится к твердой фармацевтической дозированной форме с замедленным высвобождением, включающей сшитую амилазу, альфа-амилазу и фармацевтический агент. Патент США 4606909 относится к пероральным, с контролируемым выделением фармацевтическим препаратам сложной рецептуры, в которых гомогенное ядро, содержащее частицы слаборастворимых активных ингредиентов, покрыто рН-чувствительным эродируемым покрытием. Патент США 5593697 относится к фармацевтическим или ветеринарным имплантатам, включающим, по крайней мере, один водорастворимый материал и, по крайней мере, один водонерастворимый материал и пленку полимерного покрытия, которое создано так, что разрушается за определенный промежуток времени после имплантации.

Необходимое контролируемое выделение протеинов, однако, должно быть согласовано с тем фактом, что сам протеин может оказаться нестабильным в условиях хранения. На стабильность протеина могут также оказать вредное воздействие другие компоненты композиции, в которую он включен. Например, агрессивные жидкие детергенты представляют враждебную среду для входящих в их состав ферментов. Решение таких проблем пытались найти за счет использования мутантных субтилизиновых протеаз, которые, как утверждают, обладают повышенной устойчивостью к окислению. См. патент США 4760025 и патентную заявку РСТ W089/06279. Протеины, ферменты, которые наиболее широко используют в детергентах, катализируют их собственное разложение. Использование подхода, который включает добавление ингибиторов протеаз (например, бората с гликолями) или снижение водной активности, оказывается лишь частично эффективным.

Другой подход, раскрытый в патенте США 5385959, состоит в инкапсулировании детергентных компонентов, чувствительных к разложению, в капсулы композитной эмульсии полимеров, что позволяет им высвобождаться при растворении. Патент США 5286404 относится к жидкой детергентной композиции, которая, как указано, обладает улучшенной растворимостью фермента при сохранении ферментной активности. Такое усовершенствование связано с химической модификацией свободных первичных аминогрупп в ферментном растворе в результате альдегидной обработки, ацилирования или алкилирования.

Несмотря на такой прогресс в технологии протеинов вообще, все еще сохраняется необходимость в протеинах, которые были бы стабильны в условиях хранения и были бы активны в условиях их использования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к сшитым протеиновым кристаллам, которые отличаются способностью превращаться из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму при изменении среды, окружающей указанные кристаллы, причем указанное изменение включает: изменение температуры, изменение величины рН, изменение химического состава, перехода из концентрата в разбавленную форму, изменение окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменение падающей радиации, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фтора, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации металлических хелатирующих агентов, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения такие сшитые кристаллы протеина способны выделять активность своих протеинов с контролируемой скоростью.

Выгодно, чтобы сшитые протеиновые кристаллы настоящего изобретения были бы нерастворимы и стабильны в условиях хранения и были бы растворимыми и активными в условиях их использования.

В настоящем изобретении предложены также очищающие агенты, включая детергенты, терапевтические протеинсодержащие фармацевтические композиции, вакцины, предметы личной гигиены, включая косметику, композиции для использования в ветеринарии, пищевые продукты, корма, диагностические агенты и композиции для удаления загрязнений. Кроме того, настоящее изобретение включает способы получения таких сшитых протеиновых кристаллов и способы доставки протеинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет график стабильности различных ферментов в детергенте Ciba #16 при 40°С.

Фиг.2 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.3 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30°С в отношении ткани, загрязненной какао.

Фиг.4 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 40°С в отношении ткани, загрязненной какао.

Фиг.5 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30°С в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.6 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 40°С в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.7 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30°С в отношении ткани, загрязненной кровью.

Фиг.8 представляет график растворимости сшитых кристаллов субтилизина настоящего изобретения при 30°С.

Фиг.9 представляет график растворимости сшитых кристаллов субтилизина настоящего изобретения при 37°С.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для более полного понимания настоящего изобретения приводится далее подробное его описание. В этом описании использованы следующие термины.

Смесь водно-органического растворителя - смесь, содержащая n% органического растворителя, где n принимает значения от 1 до 99, и m% водного растворителя, где m принимает значения 100-n.

Двухфазный субстрат - раствор субстрата, содержащий две фазы, либо фазы жидкость/твердое вещество, либо фазы жидкость/жидкость, одна из которых содержит субстрат для реакции, катализируемой протеиновой составляющей сшитых кристаллов протеина. Эмульсия оливкового масла в водном растворе, содержащем дискретные водную и органическую фазы, служит примером субстрата для сшитых кристаллов липазы.

Каталитически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения, которое эффективно для обработки, защиты, восстановления или детоксификации участка, на который их наносят, в течение некоторого промежутка времени.

Изменение химического состава - любое изменение химических компонентов среды, окружающей сшитые кристаллы протеина, которое влияет на среду или сшивающий агент, включая добавление химических реагентов, химические изменения, вызываемые привнесением в эту среду энергии в форме света, микроволнового излучения или радиации, химические реакции, которые влияют на сшивающий агент, или их сочетания.

Изменения силы сдвига, действующей на кристалл - любое изменение факторов среды, окружающей сшитые кристаллы протеина в условиях использования, такие как изменения механического давления, как положительные так и отрицательные, перемешивание за счет вращения, центрифугирование, переворачивание, механическое перемешивание и фильтрование под давлением.

Контролируемое растворение - растворение сшитых кристаллов протеина или переход протеиновых составляющих из кристаллического состояния в растворимое состояние, который

(1) вызывается изменением среды, окружающей кристаллы, причем указанное изменение выбирают из группы, состоящей из изменения температуры, изменения величины рН, изменения химического состава, изменения концентрированной формы в разбавленную форму, изменения окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменения падающей радиации, изменения концентрации переходного металла, изменения концентрации фтора, изменения концентрации свободных радикалов, изменения концентрации металлических хелатирующих агентов, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетаний, и

(2) контролируется фактором, выбираемом из группы, состоящей из следующего: степени сшивки указанных сшитых кристаллов протеина, аминокислотных остатков, участвующих в процессе сшивки, независимо от того, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, длительности экспонирования кристаллов протеина действию сшивающего агента, скорости добавления сшивающего агента к указанным кристаллам протеина, природы сшивающего агента, размера указанных сшитых кристаллов протеина, формы указанных сшитых кристаллов протеина и их сочетаний. В том смысле, как здесь использована, фраза «контролируемое растворение» не включает выщелачивание.

Контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина - сшитые кристаллы протеинов, которые медленно растворяются после воздействия конкретного триггера (импульс побуждающий цепную реакцию) и высвобождают растворимую форму протеина в раствор. Активность контролируемого растворения сшитых кристаллов протеина определяется главным образом растворимой формой протеина, выделяемого из кристаллов.

Сшитая кристаллическая форма протеина - сшитые кристаллы протеина, которые остаются нерастворимыми и сохраняются в твердом состоянии при добавлении в раствор.

Повышенная активность протеинов - активность сшитой кристаллической формы протеинов, которая повышена по сравнению с растворимой формой протеинов. В соответствии с различными вариантами настоящего изобретения повышенная активность протеинов демонстрируется любой из следующих: сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 200-300 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 100-200 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 10-100 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 20-50 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 10-20 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 20-30 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 5-10 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 2-3 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, в 3 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, в 2 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 25-99% выше активности растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 25-30% выше активности растворимой формы протеина или сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 20% выше активности растворимой формы протеина.

Композиции для очистки от загрязнений - композиции, выбранные из группы, состоящей из: композиций для удаления загрязнений химическими отходами, гербицидами, инсектицидами, пестицидами, агентами, представляющими опасность для окружающей среды, и химическим оружием.

Нерастворимая и стабильная форма протеина - форма протеина, которая остается нерастворимой в водных растворителях, органических растворителях или водно/органических смесях растворителей и которая демонстрирует более высокую стабильность, нежели растворимая форма протеина. В соответствии с альтернативным вариантом настоящего изобретения фраза «нерастворимая и стабильная форма протеина» может обозначать протеин, который нерастворим в сухих композициях, но растворим во влажных композициях. В любом из вариантов сшитые кристаллы протеина могут быть активны в нерастворимой форме. И в одном из вариантов сшитые кристаллы протеина могут быть активными в нерастворимой форме, затем могут быть растворены, или удалены, или расщеплены после завершения их функции.

Макромолекулярный субстрат - крупные биомолекулы, такие как протеины или углеводы с молекулярным весом, по крайней мере, 600-700 Дальтон, которые также являются субстратом для реакций, катализируемых протеиновыми составляющими сшитых кристаллов протеина.

Органический растворитель - любой растворитель не водного происхождения.

Фармацевтически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина, которое эффективно для лечения состояния индивидуума, которому их вводят в течение некоторого периода времени.

Профилактически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина, которое эффективно для профилактики состояния индивидуума, которому их вводят в течение некоторого периода времени.

Протеин - протеин, или в другом варианте гликопротеин, или в другом варианте любой пептид с третичной структурой.

Протеиновые составляющие композиций, содержащих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут быть природно или синтетически модифицированы. Они могут быть гликопротеинами, фосфопротеинами, сульфопротеинами, иодопротеинами, метилированными протеинами, немодифицированными протеинами или могут содержать другие модификации.

Протеиновой составляющей композиций, содержащих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут быть любые протеины, включая, например, гормоны, такие как паратироидный гормон, ферменты, антитела, рецепторы вирусов, гликопротеины поверхностного вируса, гликопротеины паразитов, рецепторы паразитов, рецепторы Т-клеток, МНС молекулы, модификаторы иммунитета, опухолевые антигены, муцины, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоины, гормоны роста нервов, факторы образования сгустков крови, адгезионные молекулы, протеины устойчивости ко многим лекарствам, аденилатциклазы, костные морфогенные протеины и лектины.

В протеины включены также гликопротеиновые гормоны и цитокины. Примеры гормонов включают гормон стимуляции фолликул, человеческий хорионический гонадотропин, лютеинизирующий гормон, тиротрофин и овечьи, бычьи, свиные, мышиные и крысиные аллели этих гормонов. Примеры гликопротеинов цитокинов включают α-интерферон, лимфотоксин и интерлейкин-2. Они включают также гликопротеиновые антигены, связанные с опухолями, например карциноэмбрионный антиген (СЕА), человеческие муцины, her-2/neu и простато-специфицеский антиген (PSA) [R.A. Henderson and O.J. Finn, Advanced in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996)].

Активность протеина - активность, выбранная из группы, состоящей из активности в отношении связывания, катализа или активностей, которые вызывают функциональные реакции в среде, окружающей используемый протеин, таких как индуцирование иммунной реакции и иммуногеничности, или гидролиз липидов у индивидуумов с дефицитом липаз, или их сочетаний.

Скорость выделения активности протеина - количество протеина, растворенного в единицу времени.

Растворимая форма протеина - отдельные молекулы протеина в растворе и диссоциированная форма кристаллической решетки.

Субстрат, состоящий из небольших молекул - молекулы с молекулярным весом обычно менее 600 Дальтон, которые также являются субстратом для реакций, катализируемых протеиновыми составляющими сшитых кристаллов протеина.

Терапевтический протеин - протеин, который вводят пациенту в виде фармацевтической композиции и фармацевтически приемлемым способом. Терапевтические протеины включают, например, гормоны, ферменты, включая липазы, антитела, рецепторы вирусов, рецепторы Т-клеток, хемокины, рецепторы хемокинов, МНС молекулы, опухолевые антигены, муцины, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоиды, гормоны роста нервов, факторы свертываемости крови, адгезионные молекулы, протеины устойчивости ко многим лекарствам, аденилатциклазы и протеины костной морфогеничности.

Вакцинный антиген - протеин, полученный из инфекционного агента, такого как вирус, паразит или опухолевый антиген. Активность протеина таких вакцинных антигенов состоит в индуцировании защитного иммунитета против инфицирующего агента.

Сшитые кристаллы протеинов настоящего изобретения особенно выгодны благодаря их стабильности в опасном окружении, создаваемом формами или композициями, в которых они используются, или условиями их хранения. В то же самое время эти сшитые кристаллы протеинов способны к регулируемому растворению или высвобождению их активности при воздействии одного или более триггеров их окружения. Такие триггеры могут быть выбраны из группы, состоящей из изменения температуры, изменения величины рН, изменения химического состава, перехода из концентрированной формы в разбавленную форму, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, и их сочетаний.

Регулируемое растворение или высвобождение активности сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения может также изменяться с течением времени.

Конкретные примеры таких триггеров включают возрастание или понижение температуры, например повышение температуры с низкой (между около 0°С и около 20°С) до высокой температуры (между около 20°С и около 70°С). Другие триггеры включают изменение величины рН с кислотных значений на основные значения и изменение с основных значений на кислотные. Примеры триггеров перехода из концентрированного состояния в разбавленное включают, например, изменение концентрации в растворе, изменение концентрации всех растворенных веществ примерно с 2-кратного до около 10000-кратного, изменение концентрации всех растворенных веществ с примерно 2-кратного до около 700-кратного, увеличение или уменьшение концентрации соли, увеличение или уменьшение концентрации воды, увеличение или уменьшение концентрации органического растворителя, уменьшение концентрации протеина или уменьшение концентрации детергента.

Дополнительные триггеры включают изменения химического состава среды, окружающей сшитые кристаллы протеинов, что влияет на среду или изменения сшивающего агента. Такие изменения включают, например, добавление химических реагентов, увеличение или уменьшение концентрации органического растворителя, химические акты, которые влияют на сшивающий агент, химические изменения, вызываемые подачей энергии, включая свет, микроволновое излучение или радиацию. Как разъяснялось выше, любые из этих триггеров могут действовать в сочетании или последовательно с одним или более из других триггеров.

На контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения можно также влиять, изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 0,1% в день до около 100% в день, изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 0,01% в час до около 100% в час, и изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 1% в минуту до около 50% в минуту.

Поэтому сшитые кристаллы протеинов настоящего изобретения включают такие, которые способны высвобождать свою протеиновую активность с контролируемой скоростью при воздействии изменения их окружения, причем указанное изменение выбирают из группы, состоящей из изменения величины рН, изменения концентрации растворенных веществ, изменения температуры, изменения химического состава, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетаний. Указанная контролируемая скорость выделения активности протеинов может определяться фактором, выбранным из группы, состоящей из следующего: степени сшивки сшитых кристаллов протеина, длительности времени экспонирования кристаллов протеина сшивающему агенту, скорости добавления сшивающего агента к кристаллам протеина, природы сшивающего агента, длины цепи сшивающего агента, аминокислотных остатков, участвующих в сшивках, такого факта, как является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, площади поверхности сшитых кристаллов протеина, размера сшитых кристаллов протеина, формы сшитых кристаллов протеина и их сочетаний.

Как результат кристаллической природы, сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения обладают однородностью по всему объему сшитого кристалла. Такая однородность поддерживается за счет внутримолекулярных контактов и химических сшивок между молекулами, составляющими кристаллическую решетку. Молекулы протеина сохраняют одинаковое расстояние друг от друга, образуя точно определенные стабильные поры внутри сшитых кристаллов протеина, что облегчает доступ субстрата в протеин, а также удаление продукта. В этих сшитых кристаллах протеина внутренние взаимодействия в решетке при фиксировании химическими связями особенно важны для обеспечения стабильности и предотвращения денатурации, особенно при хранении в условиях, которые включают вредные условия окружающей среды, создаваемые компонентами композиции, в которой эти кристаллы используют. В то же самое время кристаллы протеина сшиты таким образом, что они растворяются или высвобождают свою протеиновую активность при воздействии триггера (импульса) в окружающей их среде в условиях использования. Так, они могут быть практически не растворимы и стабильны в композиции в условиях хранения и практически растворимы и активны в условиях использования указанной композиции.

Факторы, которые вносят вклад в скорость высвобождения протеиновой активности сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения, включают степень сшивки кристаллов протеина, длительность воздействия на кристаллы протеина сшивающего агента, скорость добавления сшивающего агента к кристаллам протеина, природу сшивающего агента, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, тот факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности сшитых кристаллов протеина, размер сшитых кристаллов протеина, форму сшитых кристаллов протеина и их сочетания.

В дополнении к их активности сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения особенно стабильны и нерастворимы в условиях хранения, которые включают сопутствующую температуру хранения, величину рН при хранении, время хранения, форму хранящегося концентрата, хранение в условиях отсутствия или небольшой силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. Выгодно, чтобы эти сшитые кристаллы протеина были бы растворимы и активны в условиях использования, которые включают изменение температуры, изменение химического состава, переход из концентрированной формы в разбавленную форму, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, и их сочетания. Такие свойства делают сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения особенно подходящими для доставки очищающих агентов, включая детергенты, терапевтических протеинов, фармацевтических композиций, агентов личной гигиены или композиций, включая косметику, вакцину, композиций для использования в ветеринарии, продуктов питания, кормов, диагностических агентов и композиций для очистки от загрязнений.

В соответствии с одним из вариантов сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения характеризуются таким сроком полураспада активности в условиях хранения, который, по крайней мере, в два раза превышает эту величину для растворимой формы протеина, который кристаллизуется для получения сшитых кристаллов, и активностью, которая аналогична активности растворимой формы в условиях использования.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения сшитые кристаллы протеина характеризуются активностью, которая аналогична активности их растворимых или не сшитых кристаллизованных составляющих в условиях использования. Однако важно, что сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения демонстрируют повышенную стабильность в условиях хранения по сравнению с их растворимыми или не сшитыми кристаллизованными составляющими протеина.

Одним из преимуществ контролируемого растворения сшитых кристаллов протеина является то, что для выделения растворимой формы протеина из кристаллической решетки необходим триггер (импульс). Поэтому можно обеспечить контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина, которые существуют как сшитые кристаллы протеина с протеиновой активностью в твердом кристаллическом состоянии до тех пор, пока не подвергнутся воздействию триггера. После воздействия триггера растворимый протеин высвобождается, и протеиновая активность функционирует как из сшитой кристаллической формы, так и из растворимой формы протеина.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения выгодные свойства достигаются за счет сшитых кристаллов протеина, которые получают как сшитые кристаллы протеина с контролируемым растворением, но которые затем не подвергаются воздействию триггера. В частности, в отсутствие соответствующего триггера для инициирования растворения такие сшитые кристаллы протеина могут демонстрировать повышенную активность протеина в отношении макромолекулярных субстратов, бифазных субстратов или субстратов из небольших молекул по сравнению с их растворимыми составляющими. Так, например, кристаллы липазы, сшитые в сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноатом (Sulfo-LC-SMPT), которые затем не подвергают воздействию триггера для разрушения -S-S-связей сшивок, демонстрируют повышенную активность гидролиза в отношении бифазного субстрата оливкового масла.

Более конкретно, кристаллы липазы, сшитые с Sulfo-LC-SMPT, отличаются активностью протеина примерно в 5-10 раз более высокой в отношении гидролиза субстрата оливкового масла, нежели активность растворимой формы протеина, который кристаллизуют для получения сшитых кристаллов. Кроме того, кристаллы липазы, сшитые 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлоридом (EDC), отличаются примерно в два раза более высокой активностью в отношении гидролиза субстрата оливкового масла по сравнению с растворимой формой протеина, который кристаллизуют для получения сшитых кристаллов.

Протеиновой составляющей сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения может быть любой протеин, включая, например, терапевтические протеины, профилактические протеины, включая антитела, протеины очищающих агентов, включая протеины детергентов, протеины агентов личной гигиены, включая косметические протеины, протеины для использования в ветеринарии, протеины пищевых продуктов, кормов, диагностические протеины и протеины агентов, удаляющих загрязнения. Среди других протеинов включены также такие протеины, как ферменты, такие как, например, гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы. Примеры гидролаз включают термолизин, эластазу, эстеразу, липазу, нитрилазу, амилазу, пектиназу, субтилиназу, гидантоиназу, аспарагиназу, уреазу, субтилизин и другие протеазы и лизоцим. Примеры лиаз включают альдодазы и гидроксинитриллиазу. Примеры оксидоредуктаз включают пероксидазу, лакказу, глюкозооксидазу, алкоголь-дегидрогеназу и другие дегидрогеназы. Другие ферменты, которые можно кристаллизовать и сшивать, включают целлюлазы и оксидазы.

Примеры терапевтических или профилактических протеинов включают гормоны, ферменты, включая липазу, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоиды, эритропротеины, Фактор VIII, инсулин, глюкагоноподобный пептид-I (инсулинотропин), амилин, ТРА, дорназ-α, α-1-антитрипсин, человеческие гормоны роста, горомоны роста нервов, паратироидный гормон, костные морфогенные протеины, уреазу, токсоиды, гормоны фертильности, FSH, LSH, postridical гормоны, токсоид столбняка, токсоид дифтерии.

Сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать в любом из многочисленных химических процессов. Такие процессы включают процессы, проводимые как в промышленных, так и в лабораторных масштабах, таких как органические синтезы специальных химических веществ и лекарств. Процессы ферментных превращений включают окисление, восстановление, присоединение, включая эстерификации и трансэстерификации, гидролизы, элиминирование, перегруппировки и ассиметричные превращения, включая стереоселективные, стереоспецифические и региоселективные реакции.

Так, сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно с успехом использовать вместо обычных растворимых или иммобилизованных протеинов в очищающих агентах, включая детергенты, фармацевтические агенты, терапевтические агенты, соединения для ветеринарии, композиции личной гигиены, включая косметические препараты, пищу, корма, вакцины, обработку целлюлозы, бумаг и текстиля, диагностические агенты и композиции для дегазации (очистки от загрязнений).

Сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно также использовать в различных применениях в отношении окружающей среды. Их можно использовать вместо обычных растворимых или иммобилизованных протеинов для решения задач, связанных с окружающей средой, таких как дегазация обширных площадей или источников опасности для окружающей среды.

В другом варианте сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать в очищающих агентах, выбранных из группы, состоящей из детергентов, таких как порошковые детергенты и жидкие детергенты, отбеливатели, очистители для дома, очистители для твердых поверхностей, промышленные очистители, шампуни для очистки ковров и мебельных тканей.

Очищающие агенты, содержащие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут также включать соединения, которые обычно бывают включены в такие агенты. См., например, Soaps and Detergents, A Theoretical and Practical Review, Louis Spitz (Ed.), AOCS Press (Champlain, Illinopis) (1996). Такие соединения включают анионные, неионные, катионные или цвиттерионные поверхностно-активные агенты или их смеси.

Примеры анионных поверхностно-активных агентов включают алкилсульфаты, алкиловые эфиры сульфатов, алкилсульфонаты, алкиларилсульфонаты, олефиновые сульфонаты, алкиловые эфиры фосфатов, соли жирных кислот, мыла, изотионаты и сульфонированные ненасыщенные сложные эфиры и кислоты.

Примеры неионных поверхностно-активных агентов включают продукты конденсации органических алифатических или алкилароматических гидрофобных соединений с алкиленоксидом, алкилполиглюкозами и сложными эфирами сахаров.

Примеры катионных поверхностно-активных агентов включают четвертичные аммониевые соли или третичные алкиламины, аминоамиды, сложные аминоэфиры или имидазолины, содержащие, по крайней мере, одну длинноцепочечную (С₈-С₂₂) алифатическую группу или алкиларильную группу, в которой алкил содержит от около 4 до около 12 атомов углерода, а арилом является предпочтительно группа фенилена.

Примеры цвиттерионных поверхностно-активных агентов включают производные четвертичных аммониевых, четвертичных фосфониевых или третичных сульфониевых соединений, производные вторичных или третичных аминов и производные гетероциклических вт