Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента С3 альтернативного пути комплемента человека [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин А, иммуноглобулин G, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С3, участвующего в образовании С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Единственным недостатком этого способа является относительно трудная доступность и плохая длительная сохраняемость активирующей способности индивидуальных, высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, сорбируемых на микропанели, а в случае липополисахаридов, кроме того, трудности в их сорбции на полистироловых микропанелях, обычно используемых в иммуноферментном анализе.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 альтернативного пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора альтернативного пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата лизоцима, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С3, осуществляющего активацию компонента С3 в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент R3 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С3), конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С3.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования труднодоступных высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, плохо сохраняющих свою активирующую способность, какими являются иммуноглобулины G и А, компонент С3 и липополисахарид.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С3. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоцима в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl₂ (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента R3 (R3 - сыворотка крови человека, обработанная полунасыщенным раствором КВr в течение 18 ч на холоду [2]) и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата компонента С3 рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента С3. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент R3 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С3), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С3 с коэффициентом корреляции R²=0,984, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С3 описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С. В., Дьяков В.Л., Лахтин В.М. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент РФ №223992, 20.07.2004.

2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №5. С.652-659.

1. Способ определения функциональной активности компонента С3 в альтернативном пути комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора альтернативного пути комплемента, внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент R3, и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, инкубирование в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺, выливание содержимого лунок, а затем последовательное внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора альтернативного пути комплемента используют лизоцим.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент R3, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С3.