Способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами

Способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, в частности к способам выявления и идентификации антител к полисахаридным антигенам, и может быть использовано для определения уровней антител в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (ELISA) при диагностике заболеваний, вызываемых капсульными формами таких возбудителей, как Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, а также для определения уровня поствакцинального иммунитета при вакцинировании вакцинами, содержащими полисахаридные антигены.

Для диагностики инфекционных заболеваний используют различные способы, например микроскопическое исследование мазков, культуральные, определение уровня антител к антигенам возбудителя методом ТИФА. Однако культуральные и микроскопические методы трудоемки, дорогостоящи и непригодны для массового применения. Известные диагностические системы для твердофазного иммуноферментного определения антител к полисахаридным антигенам сложны в изготовлении и дорогостоящи, поскольку отрицательно заряженные или нейтральные полисахариды слабо адсорбируются на поверхности пластика. Для надежной фиксации полисахаридов на планшете используют сэндвич-метод, когда полисахарид связывается с иммобилизованными на поверхности планшета специфическими антителами. Для изготовления сенсибилизированного планшета его обрабатывают цельной гипериммунной сывороткой, либо очищенными цельными антителами, либо Fab - фрагментами специфических антител (Barbara A. and all; Journal Of Clinical Microbiology, July 1982, p.63-69) [1]. Однако для использования известного способа требуется получение специфических гипериммунных сывороток, что является сложным и длительным процессом, кроме того, получение таких сывороток сложно стандартизовать, в результате чего серии сенсибилизированных планшетов могут значительно различаться по количеству связавшегося антигена, что снижает достоверность анализа.

Известен способ сенсибилизации пластикового планшета, в котором для повышения сорбции полисахаридов осуществляют предварительную конъюгацию полисахарида с белком-носителем, что обеспечивает надежную фиксацию его на пластике (Massimo Mariani and all. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Sept. 1998, p.667-674) [2]. При этом конъюгацию полисахарида осуществляют известным способом, с последующей гель-хроматографией для выделения конъюгата. Однако, ввиду малого объема получаемого препарата и потерь, неизбежных при гель-хроматографии, для массового изготовления сенсибилизированных планшетов этот способ не используется. Кроме того, при хроматографии невозможно достичь полной очистки конъюгата от несвязавшегося полисахарида и белка-носителя, что приводит к отклонениям от расчетных значений связавшегося антигена при сенсибилизации планшета. Эта проблема весьма актуальна, и ее решению посвящен патент (US 6284250, НКИ 424/193, МПК А61К 47/48, 04.02.1999) [3], в котором представлен способ разделения конъюгата и свободного белка с помощью пористых гранул "StrataClean", которые при добавлении в раствор поглощают несвязавшийся белок. Однако этот способ требует проведения дополнительных операций, связанных с перемешиванием раствора с гранулами, инкубацией, с последующим разделением раствора и гранул, что усложняет изготовление сенсибилизированного планшета.

Известен способ фиксации полисахарида на поверхности планшета с помощью реакционных групп, внедряемых в молекулу полисахарида по карбоксильной или альдегидной группе (US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005) [4]. Внедрение посторонних групп в молекулу полисахарида при связывании антител с данной группой может привести к искажению результатов ТИФА. В патенте (US 6218195, НКИ 436/518, МПК G01N 33/569, 17.04.2001) [5] приведен способ фиксации полисахаридного антигена на поверхности пластика при помощи раствора для разведения коньюгата пероксидазы хрена (Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, Calif. 9203C, USA, catalogue #516534). Однако механизм действия не приведен, что затрудняет оценку способа и возможность его применения с иными полисахаридными антигенами.

Известен быстрый, опосредованный нагреванием способ выполнения сорбционного иммуноферментного анализа (RU 2309407 С2, G01N 33/544, 33/543, 33/53, 10.05.2006) [6]. Согласно способу анализ проводят на активированной поверхности, способной образовывать ковалентную связь с биомолекулой, при этом все стадии ТИФА, такие как связывание антигена, блокирование, связывание антитела и конъюгата, проводят путем термальной активации в термоциклере и только реакцию фермент-субстрат проводят вне термоциклера при комнатной температуре. Инертную твердую поверхность, такую как поликарбонатный планшет для ПЦР(обычно применяемые для полимеразной цепной реакции) и 96-луночный полистирольный планшет для ТИФА, активировали путем фотохимической реакции, проводимой в сухих условиях с использованием 1-фтор-2-нитро-4-азидобензола (FNAB). В известном способе планшет сенсибилизируют антителами или белковыми антигенами. Однако неизвестно о применимости упомянутого способа для сенсибилизации полисахаридными антигенами, которые, как известно, являются одними из основных антигенов грамотрицательных микроорганизмов, таких как Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas.

Наиболее близким по выполнению и достигаемому результату к заявляемому изобретению является Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces (US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005) [7], принимаемый за прототип.

Согласно способу-прототипу получают конъюгат капсульного полисахарида грамотрицательных бактерий с репортерной группой молекул. Для получения наилучших результатов в иммобилизации полисахаридных антигенов для диагностических или для иного применения необходимо иммобилизовывать антиген в правильной ориентации к твердой фазе. Для обеспечения этого необходимо регионспецифичное формирование устойчивых химических связей между репортерной молекулой и полисахаридным антигеном. Изобретение включает шаги для формирования ковалентной связи между карбоксильной группой полисахарида и репортерной молекулой, с образованием конъюгата полисахарида с репортерной молекулой, которая содержит участок связывания с субстратом. В раствор полисахарида, выделенного из бактериальной массы и содержащего карбоксильные группы, добавляют активирующее вещество, представляющее собой реакционную группу, способную к фотореакционному, термореакционному либо аффинному связыванию с поверхностью планшета. При этом в растворе полисахарида происходит образование конъюгата полисахарида с упомянутой репортерной группой посредством ковалентной связи. При нанесении раствора конъюгата полисахарида с репортерной группой на планшет происходит связывание реакционной группы непосредственно с поверхностью планшета, и обеспечивается фиксация полисахаридного антигена. В результате получают иммуносорбент, который способен присоединять антитела к полисахаридным антигенам при проведении ТИФА.

Внедрение в состав полисахарида групп молекул, обеспечивающих ковалентное связывание полисахарида с пластиком, влияет на результат анализа при связывании антител с этими группами молекул и, следовательно, приводит к снижению достоверности анализа. Кроме того, использование фотореактивных и термореактивных или аффинных групп усложняет способ сенсибилизации планшета, так как требует дополнительного оборудования.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, пригодного к массовому использованию и обеспечивающего достоверность результатов ТИФА способа сенсибилизации планшета полисахаридными анитигенами.

Поставленная задача решена с достижением нового технического результата - упрощения способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа за счет исключения использования при активации полисахаридных антигенов химических фотореактивных, термореактивных и аффинных групп, включаемых в состав иммуносорбента и способных оказать влияние на результаты анализа, при сохранении достоверности ТИФА.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами грамотрицательных микроорганизмов, обладающих полисахаридной капсулой, заключающемся в активации и конъюгации полисахаридных антигенов с фиксацией их на поверхности планшета, согласно изобретению поверхность планшета предварительно покрывают раствором белка, содержащего реакционно-способные аминогруппы (NH₃), а фиксацию полисахаридных антигенов осуществляют путем ковалентного связывания активированных полисахаридов с иммобилизованным на поверхности планшета упомянутым белком.

Новизна настоящего изобретения состоит также в том, что активацию полисахаридного антигена осуществляют окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия (NaIO₄) при соотношении 1:1.

Новизна настоящего изобретения состоит также в том, что активацию полисахаридного антигена осуществляют добавлением бромциана (BrCN) в соотношении 1:10 к раствору полисахарида концентрацией 10-100 мг/мл.

В заявляемом способе твердая фаза представлена иммобилизованным на поверхности планшета белком, в то время как у прототипа связывание конъюгированного и активированного полисахарида происходит непосредственно с поверхностью планшета. Ковалентное связывание полисахарида к предварительно иммобилизованному на поверхности планшета белку обеспечивает надежную и более простую, по сравнению с прототипом, фиксацию антигенов, исключающую влияние сторонних химических групп на результаты анализа, что приводит к упрощению способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа при обеспечении достоверности ТИФА. Известно нанесение белка на поверхность планшета после фиксации антигена для исключения неспецифического связывания при проведении ТИФА («Теория и практика иммуноферментного анализа», Егоров A.M. и др. М.: Высш. Шк., 1991, с.214) [8]. В отличие от известной функции белка, в настоящем изобретении белок наносят на поверхность планшета до фиксации антигена и полисахаридные антигены фиксируют путем конъюгации полисахарида с иммобилизованным на поверхности планшета белком.

Изобретение поясняется чертежом и таблицей.

На чертеже приведена последовательность определения специфических антител в ТИФА. В таблице представлены результаты испытаний двух типов планшетов, полученных заявляемым способом при определении антител класса G мыши к полисахаридному антигену-декстрану в опытных и контрольной группах.

Способ сенсибилизации планшета полисахаридными антигенами осуществляется следующим образом (см. чертеж). Поверхность лунки планшета 1 покрывают раствором белка 2, белок иммобилизуется на поверхности лунки. Активированный капсульный полисахарид 3 ковалентно связывается с иммобилизованным белком 4. Полученный иммуносорбент используют в ТИФА известным способом («Иммуноферментный анализ», Нго Т. М.: Мир 1988 - 196 с.) [9]. Для этого в лунку вносят исследуемую сыворотку крови, инкубируют и отмывают от не связавшихся с иммуносорбентом антител. Затем вносят конъюгат фермента со специфическим антителом 6, инкубируют, отмывают и добавляют раствор субстрата фермента 7, в результате ферментативной реакции образуется окрашенный продукт 8. Реакцию останавливают добавлением кислоты и измеряют оптическую плотность планшетным фотометром. По величине оптической плотности определяют количество антител в исследуемой сыворотке крови.

Способ сенсибилизации планшета представлен подготовкой планшета, активацией и фиксацией полисахаридных антигенов.

Подготовка планшета

Раствор белка, имеющий свободные реакционно-способные NH₃ и СООН группы, например, бычьего сывороточного альбумина (БСА), концентрацией 2%, в изотоническом фосфатно-солевом буфере (ЗФР), рН 7,5, содержащем 0,01% мертиолята натрия, вносят по 300 мкл в каждую лунку иммунологического планшета и оставляют при 37°С на 12 часов. Затем планшет пятикратно отмывают от несвязавшегося белка раствором Твин-20 концентрации 0,05% в изотоническом фосфатно-солевом буфере рН 7,5. После этого планшет готов к нанесению активированного полисахарида.

Активация полисахаридных антигенов

К раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл добавляют NaIO₄ в весовом отношении 1:1 к полисахаридному антигену, раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте и перемешивании в течение 0,5-5 часов. Для завершения реакции добавляют ¹/₂ Ѕ объема 0,2М раствора этиленгликоля. Перемешивают в течение 30 минут и затем диализуют против дистиллированной воды либо обессоливают методом ультрафильтрации. Фильтрат удаляют, а концентрат используют для сенсибилизации планшета. Перед нанесением на планшет в раствор окисленного полисахарида добавляют NaBH₄ в весовом соотношении 1/3 к полисахариду и устанавливают рН 5,0 с помощью 0,1М ацетатного буфера. Полученный раствор разводят 0,05М ацетатным буфером рН 5,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл.

В другом частном случае в раствор содержащий 10-100 мг/мл полисахаридного антигена добавляют BrCN в весовом соотношении 1/10 к полисахаридному антигену, рН раствора доводят до 10 с помощью 0,1М NaOH, перемешивают в течение 5 минут, затем рН доводят до 8,0 с помощью 0,1М HCl и разводят ЗФР рН 8,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл.

Фиксация полисахаридных антигенов

Полученные растворы активированных полисахаридов вносят по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного планшета и оставляют при комнатной температуре на 3 часа. Полисахаридный антиген ковалентно связывается с белком, иммобилизованным на поверхности планшета, взаимодействием альдегидных групп окисленного полисахарида с белком по NH₃ группе.

Способ был реализован в эксперименте по созданию и применению иммуносорбента на основе полисахарида декстрана.

Проведение ТИФА. Реагенты и расходные материалы, которые были использованы при проведении ТИФА.

Планшет для проведения иммуноферментной реакции с нанесенным антигеном, приготовление которого описано выше. Стандартный раствор для промывки планшета, который готовят добавлением к ЗФР твин-20 до конечной концентрации 0,05%. В качестве иммуноферментного коньюгата используют антитела, меченные пероксидазой хрена, со специфичностью к иммуноглобулинам мыши класса G. Рабочий раствор конъюгата готовят согласно рекомендации изготовителя. Дилюент - растворитель для сывороток, готовят путем добавления стерильной сыворотки лошади до конечной концентрации 1% к ЗФР, содержащему 0,05% твин-20. Субстрат - химический субстрат для проявления ферментативной реакции, например раствор тетра-метил-бензидина (ТМБ). Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед применением смешиванием раствора ТМБ с раствором перекиси водорода в пропорции, рекомендованной производителем. В качестве стоп-реагента для остановки ферментативной реакции используют 0,5М раствор серной кислоты.

Постановка анализа

1. В лунку планшета А1 вносят 100 мкл сыворотки крови, содержащей IgG к ВСА в качестве положительного контроля, в лунки В1 и С1 вносят по 100 мкл сыворотки крови мыши, не содержащей антител к ВСА и полисахариду, инактивированной прогреванием в течение 3 ч при температуре 56°С. В остальные лунки планшета вносят по 90 мкл раствора для разведения сывороток и по 10 мкл исследуемых сывороток. Содержимое лунок перемешивают с помощью пипетки. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С.

2. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок и промывают планшет пять раз рабочим фосфатно-солевым буфером, содержащим твин. Для этого вносят в каждую лунку планшета от 200 до 250 мкл раствора, а затем удаляют содержимое лунок в емкость с дезраствором. По окончании промывки остатки раствора удаляют, активно постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.

3. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата пероксидазы. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С.

4. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок и промывают планшет, как описано в п.2.

5. Вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и помещают на 20 мин в защищенное от света место при температуре от 20°С до 27°С.

6. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента и проводят измерение оптической плотности на планшетном фотометре ЭФОС 9305 при длине волны 450 нм.

Пример 1

Активацию полисахаридного антигена осуществляли окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия NaIO₄ при соотношении концентраций 1:1. Указанные концентрации позволяют получить гарантированное ковалентное связывание активированного полисахарида к иммобилизованному на поверхности планшета белку (табл.). В конкретном примере выполнения навеску 50 мг декстрана Т-500 производства Pharmacia растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 50 мг NaIO₄, перемешивали в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре. Затем добавляли 5 мл 0,2М раствора этиленгликоля. Раствор диализовали 24 часа против 0,05М ацетатного буфера рН 5,0. Перед нанесением на планшет добавляли 0,025 г NaBH₄, разводили 0,05М ацетатным буфером рН 5,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл и вносили по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного заявляемым способом планшета.

Пример 2

Активацию полисахаридного антигена осуществляли добавлением бромциана BrCN в соотношении 1:10 к раствору полисахарида концентрацией 10-100 мг/мл. Указанные концентрации позволяют получить гарантированное ковалентное связывание активированного полисахарида к иммобилизованному на поверхности планшета белку (табл.). В конкретном примере выполнения навеску 50 мг декстрана Т-500 производства Pharmacia растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 1 мг BrCN. Доводили рН до 10,5 0,1М NaOH, перемешивали в течение 5 минут при температуре 4-5°С. Затем устанавливали рН 8,0 с помощью 0,1М HCl, разводили (ЗФР) рН 8,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл и вносили по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного заявленным способом планшета.

Пример 3

Для проверки заявляемого способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа был проведен эксперимент по иммунизации мышей конъюгатом столбнячного анатоксина с декстраном и последующему определению титров антиполисахаридных антител в сыворотке крови. В нативном (немодифицированном) виде декстран обладает низкой иммуногенностью. Ковалентная сшивка декстрана с иммуногенным белком приводит к образованию антител к полисахариду у привитых конъюгатом экспериментальных животных. Конъюгацию декстрана с анатоксином проводили окислением декстрана периодатом натрия и связыванием альдегидных групп окисленного полисахарида с белком по NH₃ группе. 25 самцов беспородных мышей массой 15-20 г были иммунизированы конъюгатом декстрана и столбнячного анатоксина. Иммунизацию проводили двукратно с 10-дневным интервалом в иммунизирующей дозе 0,3 мг декстрана. Через 7 дней после повторной иммунизации исследовали сыворотку крови мышей методом ТИФА на наличие антиполисахаридных антител класса G с применением планшетов, сенсибилизированных заявляемым способом на наличие антиполисахаридных антител. В качестве контроля использовали сыворотку крови мышей, которым вместо конъюгата вводили изотонический раствор. Как следует из таблицы, интенсивность окраски в лунках с сыворотками крови мышей опытной группы более чем в четыре раза превосходит значения для сывороток неиммунизированных мышей контрольной группы. Так как статистический критерий Стьюдента, t для экспериментальных и контрольных групп ниже 0,005 (Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю.Реброва. - М.: Медиа-Сфера, 2003. - 312 с.) [10], что свидетельствует о достоверности различий между контролем и опытом. Следовательно, у опытной группы развился иммунный ответ на полисахарид, и иммуносорбент, построенный заявляемым способом, позволяет диагностировать произошедшее нарастание количества специфических антиполисахаридных антител. Исключение использования при активации полисахаридных антигенов химических фотореактивных, термореактивных и аффинных групп, включаемых в состав иммуносорбента и способных оказать влияние на результаты анализа, обеспечивает достоверность ТИФА и упрощает способ сенсибилизации планшета полисахаридными антигенами.

Источники информации

1. Barbara A. and all; Journal Of Clinical Microbiology, July 1982, p.63-69.

2. Massimo Mariani and all. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Sept. 1998, p.667-674.

3. US 6284250, НКИ 424/193, МПК А61К 47/48, 04.02.1999.

4. US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04. 2005.

5. US 6218195, НКИ 436/518, МПК G01N 33/569, 17.04.2001.

6. RU 2309407 C2, G01N 33/544, 33/543, 33/53, 10.05.2006.

7. US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005.

8. Теория и практика иммуноферментного анализа /Егоров A.M. и др. М.: Высш. Шк.,1991, 214 с.

9. Иммуноферментный анализ / Нго Т. М.: Мир, 1988. 197 с.

10. Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю.Реброва. - М.: Медиа-Сфера, 2003. - 312 с.

Таблица 1
Результаты испытаний двух типов планшетов, полученных заявляемым способом при определении антител класса G мыши к полисахаридному антигену (декстрану) в опытных и контрольной группах
	Способ активации полисахарида
Концентрация полисахарида при активации, в мг/мл	Периодатное окисление	Активация бромцианом
Опытная группа	Контрольная	Опытная группа	Контрольная
Оптическая плотность при D 450nm в О.Е.	Оптическая плотность при D 450 nm в О.Е.	Оптическая плотность при D 450nm в О.Е.	Оптическая плотность при D 450 nm в О.Е.
10	0,711±0,069	0,157±0,027	0,735±0,060	0,142±0,018
50	0,728±0,075	0,160±0,024	0,752±0,067	0,123±0,022
100	0,719±0,086	0,171±0,031	0,756±0,051	0,122±0,023

1. Способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами грамотрицательных микроорганизмов, обладающих полисахаридной капсулой, заключающийся в активации и конъюгации полисахаридных антигенов с фиксацией их на поверхности планшета, отличающийся тем, что поверхность планшета предварительно покрывают раствором белка, содержащего реакционно-способные аминогруппы (-NH₂), а фиксацию полисахаридных антигенов осуществляют путем ковалентного связывания активированных полисахаридов с иммобилизованным на поверхности планшета упомянутым белком.

2. Способ сенсибилизации планшета по п.1, отличающийся тем, что активацию полисахаридного антигена осуществляют окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия NalO₄ при соотношении концентраций 1:1 к полисахаридному антигену.

3. Способ сенсибилизации планшета по п.1, отличающийся тем, что активацию полисахаридного антигена осуществляют добавлением к раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл бромциана BrCN в соотношении 1:10 к полисахаридному антигену.