Специфичные в отношении прионов пептидные реагенты

Специфичные в отношении прионов пептидные реагенты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к пептидным реагентам, которые взаимодействуют с прионными белками, к полинуклеотидам, кодирующим эти пептидные реагенты, к способам получения антител с использованием таких пептидных реагентов и полинуклеотидов, и к антителам, полученным с использованием этих способов. Изобретение также относится к способам применения этих пептидных реагентов для обнаружения патогенных прионов в образце и к способам применения этих пептидных реагентов в качестве компонентов терапевтической или профилактической композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Заболевания, связанные с конформацией белка, охватывают различные неродственные заболевания, включая инфекционные губчатые энцефалопатии, происходящие вследствие аномального конформационного изменения белка (белка конформационного заболевания), которое, в свою очередь, приводит к самопроизвольной ассоциации аномальных форм белка, с последующим замещением и повреждением ткани. Такие заболевания также имеют замечательное сходство в клинических проявлениях, обычно быстрое прогрессирование от диагностики до смерти после различной длительности инкубационного периода.

Одна из групп конформационных заболеваний называется «прионные заболевания» или «инфекционные губчатые энцефалопатии (TSE)». У людей такие заболевания включают болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герштманна-Штрауслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу и куру (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al., eds., McGraw-Hill, Inc. New York, (1994); Medori et al. (1992) N.Engl. J. Med. 326: 444-9). У животных TSE включают скрэпи овец, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), инфекционную энцефалопатию норок и болезнь хронической усталости рожденного в неволе гибрида оленя и лося (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. Pp. 2289-2324 In: Virology, Fields, ed. New York: Raven Press, Ltd.). Инфекционные губчатые энцефалопатии характеризуются следующими отличительными признаками: наличием аномальной (богатой бета-структурой, устойчивой к протеиназе K) конформации прионного белка, которая переносит заболевание при экспериментальной инокуляции лабораторным животным, включая приматов, грызунов и трансгенных мышей.

Недавнее быстрое распространение губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота и его корреляция с повышенной частотой губчатых энцефалопатий у людей привело к значимому повышению интереса к обнаружению инфекционных губчатых энцефалопатий у неотносящихся к человеку млекопитающих. Трагические последствия случайной передачи этих заболеваний (см., например, Gajdusek, Infectious Amyloids, и Prusiner, Prions In Fields Virology. Fields, et al., eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown et al. (1992) Lancet, 340: 24-27), трудности в дезинфекции (Asher et al. (1986) pages 59-71 In: Laboratory Safety: Principles and Practices, Miller ed. Am. Soc.Micro.), и недавний интерес к губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) поддерживают срочную потребность в диагностическом тесте, который мог бы идентифицировать людей и животных с инфекционными губчатыми энцефалопатиями, и в способах лечения инфицированных индивидуумов.

Прионы представляют собой инфекционный патоген, который вызывает губчатые энцефалопатии (прионные заболевания). Прионы значимо отличаются от бактерий, вирусов и вироидов. Основной гипотезой является то, что в отличие от других инфекционных патогенов инфекция вызвана аномальной конформацией прионного белка, которая действует как шаблон и преобразует нормальные конформации приона в аномальные конформации. Прионный белок впервые был охарактеризован в начале 1980-х. (См., например, Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner, Bolton et al. (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton et al. (1983) Cell 35: 57-62). Гены, кодирующие полный прионный белок, были затем клонированы, секвенированы и экспрессированы в трансгенных животных. См., например, Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417-428.

Ключевой характеристикой прионных заболеваний является образование белка аномальной формы (PrP^Sc), также называемого белком скрэпи, из нормальной (клеточной или непатогенной) формы прионного белка (PrP^C). См., например, Zhang et al. (1997) Biochem. 36 (12): 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol Chem 268: 20276-20284. Оптическая спектроскопия и кристаллографические исследования выявили, что связанные с заболеванием формы прионов существенно обогащены бета-структурой по сравнению с преимущественно обладающими альфа-спиральным скручиванием, не связанными с заболеванием формами. См., например, Wille et al. (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 614-622; Cohen & Prusiner, Chapter 5: Structural Studies of Prion Proteins in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 191-228). За структурными изменениями, оказывается, следуют изменения биохимических свойств: PrP^C растворим в неденатурирующих детергентах, PrP^Sc нерастворим; PrP^C легко расщепляется протеазами, тогда как PrP^Sc частично устойчив, что приводит к образованию укороченного по N-концу фрагмента, известного как «PrPres» (Baldwin et al. (1995); Cohen & Prusiner (1995)),"PrP 27-30" (27-30 kDa) или «PK-устойчивая» (устойчивая к протеиназе K) форма. Кроме того, PrP^Sc может преобразовывать PrP^C в патогенную конформацию. См., например, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92: 11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109-20.

Обнаружение патогенных изоформ белков конформационных заболеваний в живых индивидуумах и образцах, полученных из живых индивидуумов, оказалось сложным. Таким образом, окончательный диагноз и паллиативные способы лечения данных инфекционных и содержащих амилоид состояний до гибели индивидуума остаются, по существу, нерешенной задачей. Гистопатологическая оценка биопсий мозга рискованна для индивидуума, и повреждения и отложения амилоида могут быть потеряны в зависимости от того, откуда взят биопсийный образец. Однако еще имеется риск, связанный с биопсиями, для животных, пациентов и медицинского персонала. Далее результаты тестов головного мозга животных обычно не успевают получить до того, как животное пойдет в пищу. Кроме того, антитела, полученные против прионных пептидов, распознают как денатурированный PrP^Sc, так и PrP^C, но не способны избирательно распознавать инфекционный (неденатурированный) PrPres. (См., например, Matsunaga et al. (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44: 110-118).

Таким образом, сохраняется потребность в композиции и способах обнаружения патогенных прионных белков в различных образцах, например в образцах, полученных от живых индивидуумов, в продуктах крови, в сельскохозяйственных животных и в других источниках питания человека и животных. Кроме того, остается необходимость в способах и композициях для диагностики и лечения, связанных с прионами заболеваний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение частично относится к пептидным реагентам, которые взаимодейествуют с прионными белками. Более конкретно, описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют преимущественно с патогенными изоформами прионных белков. Эти пептидные реагенты могут использоваться в различных применениях, включая средства для обнаружения патогенных прионов или для обнаружения патогенных прионов в образце, в качестве компонентов терапевтической или профилактической композиции и/или для образования специфичных в отношении прионов антител.

Например, пептидные реагенты, которые взаимодействуют предпочтительно с PrP^Sc по сравнению с PrP^C, могут использоваться для прямого обнаружения патогенных форм в образцах, полученных из живых индивидуумов, например, для диагностики заболевания или для скрининга образцов донорской крови или скрининга донорских органов для трансплантации.

В более широком аспекте изобретение относится к пептидному реагенту, который преимущественно взаимодействует с патогенными формами белка конформационного заболевания. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют предпочтительно с патогенными формами прионного белка по сравнению с непатогенными формами прионного белка. Описанные здесь пептидные реагенты могут быть полностью или частично синтетическими, например, могут включать в себя одну или несколько следующих групп: циклизованные остатки или пептиды, мультимеры пептидов, метки, и/или другие химические радикалы. Примеры подходящих пептидных реагентов включают в себя те, что получают из пептидов SEQ ID NO: 12-132, например, пептидов, таких как те, что обозначены на SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, или 84, и их аналогов и производных. Описанные здесь пептидные реагенты могут взаимодействовать с любыми белками конформационных заболеваний, например, прионные белки (например, патогенный белок PrP^Sc, и непатогенную форму PrP^C). В некоторых вариантах осуществления пептидные реагенты взаимодействуют предпочтительно с PrP^Sc по сравнению с PrP^C. Пептидные реагенты, в основном, являются специфичными в отношении PrP^Sc более из одного вида, но могут быть специфичны в отношении PrP^Sc из одного вида.

В другом варианте осуществления пептидные реагенты, полученные из пептидов, показанных в любой из описанных здесь последовательностей. В некоторых вариантах осуществления использованы пептидные реагенты, полученные из областей прионного белка, например из тех областей, которые соответствуют остаткам 23-43 или 85-156 (например, 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113-135, и 136-156, пронумерованными согласно последовательности мышиного приона, показанной в SEQ ID NO: 2). Для удобства номера аминокислотных остатков, приведенные выше, соответствуют последовательности мышиного прионного белка SEQ ID NO: 2; обычный специалист в данной области может легко идентифицировать соответствующие области в прионных белках других видов, основываясь на последовательностях, известных в данной области и на предоставленных здесь сведениях. Типовые пептидные реагенты включают в себя те, что получают из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, или 127; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132 или 128; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82 или 84.

В другом аспекте изобретение относится к комплексу, содержащему один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, и прионный белок.

В другом аспекте - способ получения антител, которые распознают прионные белки, причем данный способ включает в себя стадию введения любого из пептидных реагентов, описанных здесь (или полинуклеотидов, кодирующих пептидные реагенты) индивидууму (например, животному). В некоторых вариантах осуществления способ далее включает в себя стадию выделения антител из животного. Связанный аспект изобретения относится к антителам, полученным данным способом. Предпочтительные антитела специфичны в отношении патогенных форм.

Еще в одном аспекте изобретение относится к комплексу, содержащему любое из описанных здесь антител и прионный белок. В некоторых вариантах осуществления прионный белок представляет собой непатогенную изоформу, в то время как в других вариантах осуществления она представляет собой патогенную изоформу.

Любой из описанных здесь пептидных реагентов и/или антител может кодироваться, полностью или частично, одним или несколькими полинуклеотидами, которые также образуют часть настоящего изобретения.

Еще в одном аспекте предоставляются способы для обнаружения прионных белков. Способы обнаружения могут использоваться, среди прочих, в связи со способами диагностики связанного с прионами заболевания (например, у людей или у индивидуумов-животных, не относящихся к людям), при обеспечении поставки крови, продуктов крови, или поставки пищевых продуктов, по существу, лишенных PrP^Sc, при анализе образцов органов или тканей для трансплантации, при мониторинге отсутствия контаминации хирургических инструментов и оборудования, а также любой другой ситуации, в которой важно знание наличия или отсутствия патогенного приона.

Способы обнаружения основываются на преимущественном взаимодействии пептидных реагентов по изобретению с патогенной изоформой приона. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в биологическом образце.

В одном из вариантов осуществления способ включает в себя контакт образца, подозреваемого в наличии в нем патогенного приона, с одним или несколькими описанными здесь пептидными реагентами, в условиях, которые обеспечивают взаимодействие пептидного(-ых) реагента(-ов) и патогенного приона, если он присутствует; и обнаружение наличия или отсутствия патогенного приона в образце за счет его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами). Взаимодействие пептидного(-ых) реагента(-ов) и патогенного приона может осуществляться в растворе, или один или несколько реагентов могут предоставляться в твердой фазе или на ней. Могут проводиться анализы сэндвич-типа, в которых пептидные реагенты по изобретению могут использоваться в качестве реагентов для захвата, реагентов для обнаружения или обоих. Другие связывающие прион реагенты (например, антитела и другие связывающие молекулы, которые связываются с денатурированным прионным белком), могут применяться в данном аспекте в комбинации с пептидными реагентами по изобретению.

В одном из аспектов данного изобретения один или несколько пептидных реагентов по настоящему изобретению получаются на твердой основе и контактируют с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, с пептидным реагентом. Несвязанные материалы образца, включая любой непатогенный прион, могут удаляться, и патогенный прион может обнаруживаться, оставаясь связанным с пептидным реагентом, или после диссоциации от пептидного реагента. Патогенный прион может обнаруживаться с использованием меченого и способного к визуализации пептидного реагента (того же пептида, который использовали для «захвата» патогенного приона или второго пептидного реагента по изобретению) или меченого и способного к визуализации антитела против приона или другого связывающего прион реагента. Это антитело или связывающий прион реагент не обязательно специфичен к патогенной форме приона.

В другом аспекте данного варианта осуществления связывающий прион реагент предоставляется на твердой основе и контактирует с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, со связывающим прион реагентом. Несвязанные материалы образца могут удаляться, и патогенный прион может обнаруживаться, оставаясь связанным с пептидным реагентом, или после диссоциации от пептидного реагента. Патогенный прион может выявляться с использованием одного или нескольких меченых и способных к визуализации пептидных реагентов по изобретению.

В другом аспекте данного изобретения патогенный прион в образце может неспецифично связываться с твердой основой (например, с планшетом ELISA) и выявляться путем связывания одного или нескольких меченых и способных к визуализации пептидных реагентов по изобретению, которые взаимодействуют предпочтительно с патогенной изоформой приона.

В дополнительном варианте осуществления способ предусматривает контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с одним или несколькими пептидными реагентами, выбранными из группы, включающей пептиды, с последовательностями SEQ ID NO: 12-132, и их аналогами и производными, в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного(-ых) реагента(-ов) с патогенным прионом, если он присутствует; и обнаружение наличия или отсутствия патогенного приона в образце путем его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами). В предпочтительных вариантах осуществления образец контактирует с одним или несколькими пептидными реагентами, выбранными из группы, включающей пептиды, с последовательностями SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 или 84, и из аналогов и производных.

В других вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, причем данный способ предусматривает: получение твердой основы, содержащей первый пептид, где первый пептид включает в себя один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, которые предпочтительно взаимодействуют с PrP; контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые позволяют патогенным прионам, присутствующим в образце, связываться с первым пептидом; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидом, где второй пептид включает в себя один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, которые взаимодействуют преимущественно с белками PrP^Sc, в условиях, которые позволяют второму пептиду связываться с патогенными прионами, связанными с первым пептидом; и обнаружение комплексов, образованных между первым пептидом, патогенным прионом из образца и вторым пептидом, с обнаружением таким образом наличия в образце патогенного приона.

В других вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающий: получение твердой основы, содержащей связывающий прион реагент, где связывающий прион реагент связывается с прионными белками; контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые позволяют прионным белкам, если они присутствуют в образце, связываться со связывающим прион реагентом; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации пептидным реагентом по изобретению, где пептидный реагент преимущественно взаимодействует с патогенным прионным белком; и обнаружение комплексов, образованных между связывающим прион реагентом, патогенным прионом из образца и пептидным реагентом.

В другом варианте осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, причем данный способ включает в себя стадии получения твердой основы, содержащей описанный здесь первый пептидный реагент, где указанный первый пептидный реагент преимущественно взаимодействует с патогенными формами; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации первым лигандом (например, плазминогеном, рецептором ламинина и гепаран-сульфатом), в условиях, которые обеспечивают образование комплекса меченый и способный к визуализации пептидный реагент-лиганд, где сродство связывания первого пептидного реагента в отношении меченого и способного к визуализации первого лиганда слабее, чем сродство связывания первого пептидного реагента в отношении патогенного приона; контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенных прионов с твердой основой в условиях, которые позволяют патогенному приону, если он присутствует в образце, связываться с первым пептидом и замещать первый лиганд; и обнаружение патогенного приона в образце путем снижения количества меченого и способного к визуализации лиганда на твердой основе.

Любые из указанных выше способов обнаружения патогенных прионов могут использоваться в способе диагностики связанных с прионами заболеваний.

Настоящее изобретение также относится к способу выделения патогенного приона, предусматривающему: получение твердой основы, содержащей один или несколько пептидных реагентов по изобретению, контактирование твердой основы с образцом, о котором известно, или в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, с пептидным реагентом; и удаление любых несвязавшихся материалов образца. Дополнительные варианты осуществления далее включают в себя стадию диссоциации связанного патогенного приона и пептидного реагента и, необязательно, получения диссоциированного патогенного приона.

Настоящее изобретение также относится к способу удаления патогенных прионов из образца, предусматривающему: получение твердой основы, содержащей один или несколько пептидных реагентов по изобретению, контактирование твердой основы с образцом, о котором известно или в котором предполагается наличие патогенных прионов, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионов, если они присутствует, с пептидным реагентом; и получение несвязавшихся материалов образца.

Во всех следующих вариантах осуществления, получения твердой основы, содержащей один или несколько реагентов по изобретению, рассматриваются альтернативные варианты осуществления, когда пептидный реагент контактирует с образцом перед тем, как пептидный реагент присоединяют к твердой основе. В данных вариантах осуществления пептидный реагент включает в себя одного из представителей связывающейся пары, и твердая основа включает в себя второго представителя связывающейся пары. Например, пептидный реагент по изобретению может содержать биотин или модифицироваться так, что он содержит биотин. Биотинилированный пептидный реагент контактирует с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, обеспечивающих связывание пептидного реагента с патогенным прионом. Твердая основа, содержащая авидин или стрептавидин, затем контактирует с биотинилированным пептидным реагентом. Здесь описаны другие подходящие связывающие пары.

В любом из описанных здесь способов с использованием твердой подложки она может представлять собой, например, нитроцеллюлозу, полистирол, полипропилен, латекс, поливинилфторид, диазотированную бумагу, нейлоновые мембраны, активированные гранулы, и/или отвечающие на магнитное поле гранулы, поливинилхлорид; полипропилен, полистирольный латекс, поликарбонат, нейлон, декстран, хитин, песок, силикагель, пемзу, агарозу, целлюлозу, стекло, металл, полиакриламид, силикон, резину, полисахариды; диазотированную бумагу; активированные гранулы, отвечающие на магнитное поле гранулы, и любые материалы, обычно используемые для твердофазного синтеза, аффинного разделения, реакций гибридизации, иммунных анализов и других таких применений. Основа может представлять собой дисперсные частицы или находиться в виде непрерывной поверхности, и включает в себя мембраны, сита, планшеты, шарики, слайды, диски, капилляры, полые волокна, иглы, пины, чипы, твердые волокна, гели (например, силикагели) и гранулы (например, гранулы пористого стекла, силикагели, полистирольные гранулы, необязательно перекрестно связанные с дивинилбензолом, гранулы с привитыми сополимерами, полиакриламидные гранулы, латексные гранулы, гранулы диметилакриламида, необязательно перекрестно связанные с N-N'-бис-акрилилэтилендиамином, магнитные гранулы с оксидом железа, и стеклянные частицы, покрытые гидрофобным полимером.

Кроме того, в любом из описанных здесь способов образец может представлять собой биологический образец, то есть образец, полученный или происходящий из живого или когда-либо жившего организма, например органы, цельная кровь, фракции крови, компоненты крови, плазма, тромбоциты, сыворотка, цереброспинальная жидкость (ЦСЖ), ткань головного мозга, ткань нервной системы, мышечная ткань, костный мозг, моча, слезы, не относящаяся к нервной системе ткань, органы и/или биопсии или некропсии. В предпочтительном осуществлении биологический образец включал в себя кровь, фракции крови или компоненты крови. Образец может представлять собой небиологический образец.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики связанного с прионом заболевания у индивидуума путем обнаружения наличия или отсутствия приона в биологическом образце от данного индивидуума любыми описанными здесь способами обнаружения.

В другом аспекте изобретение относится к способам получения источника крови, который, по существу, лишен патогенных прионов, причем данный способ предусматривает стадии скрининга аликвот крови (например, цельной крови, плазмы, тромбоцитов и сыворотки) из собранных образцов крови любым из описанных здесь способов; элиминации любого образца, в котором обнаружен патогенный прион; и комбинации образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для обеспечения источника крови, по существу, лишенного патогенных прионов.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способам получения продуктов питания, в частности мясных продуктов (например, говядины, баранины, или свинины, используемых для потребления людьми или животными), который, по существу, лишен патогенных прионов, причем данный способ включает в себя стадии скрининга любым из описанных здесь способов образцов, взятых от живых или мертвых организмов, которые будут служить продуктами питания, или образцов, взятых из пищи, предназначенной для продуктов питания; идентификации образцов, в которых обнаружен патогенный прион; и удаления из продуктов питания любого живого или мертвого организма, предназначенного для получения продуктов питания, в образцах которых обнаружены патогенные прионы; с обеспечением таким образом продукта питания, по существу, лишенного патогенных прионов.

В другом аспекте изобретение относится к твердой основе, включающей в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов. Твердая основа может, среди прочих, использоваться в способах по изобретению для обнаружения патогенного прионного белка в образце, для выделения прионного белка из образца, и для элиминации из образца патогенных прионных белков. Твердая основа может соответствовать описанной выше.

В другом аспекте изобретение относится к различным наборам для обнаружения патогенного приона в образце, для выделения патогенного приона из образца, для элиминации из образца патогенного приона, причем набор включает в себя: один или несколько описанных здесь пептидных реагентов; и/или любую из твердых основ, включающих в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов и другие необходимые реагенты, и, необязательно, положительные и отрицательные контроли. Пептидный(-е) реагент(-ы) могут быть мечеными и способными к визуализации.

В других аспектах здесь предоставлены композиции, включающие в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов, полинуклеотидов и/или антител.

В дальнейшем аспекте предоставлены способы лечения или профилактики прионного заболевания, например способы, включающие в себя введение животному (например, не относящееся к человеку или относящееся к человеку млекопитающее) одного или нескольких описанных здесь композиций. В других вариантах осуществления способы предусматривают введение первой композиции, содержащей любую описанную здесь композицию в качестве стадии первичной стимуляции, и введение второй композиции, содержащей любые из описанных здесь композиций, в качестве вторичной стимуляции, например, в количестве, достаточном для индукции у индивидуума иммунного ответа. Композиция(-и) может(-гут) вводиться внутримышечно, через слизистые, интраназально, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, интравагинально, интраректально, перорально и/или внутривенно.

Эти и другие варианты осуществления изобретения легко реализуются специалистами в данной области в свете приведенного здесь описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 изображена аминокислотная последовательность человеческих (SEQ ID NO: 1) и мышиных (SEQ ID NO: 2) прионных белков.

На фиг.2 изображено выравнивание прионных белков из людей (SEQ ID NO: 3), сирийского хомячка (хомячка) (SEQ ID NO: 4), крупного рогатого скота (SEQ ID NO: 5), овцы (SEQ ID NO: 6), мыши (SEQ ID NO: 7), лося (SEQ ID NO: 8), лани (SEQ ID NO: 9), гибридного оленя (SEQ ID NO: 10) и белохвостого оленя (SEQ ID NO: 11). Лось, лань, гибридный олень отличаются один от другого только на два остатка S/N128 и Q/E226 (показаны жирным шрифтом).

На фиг.3, панелях A-F, показаны типовые пептоидные замены, которые могут быть сделаны для получения любого из описанных здесь пептидных реагентов. Пептоиды показаны кружками на каждой панели и показаны в типовом пептидном реагенте, описанном здесь (SEQ ID NO: 14, QWNKPSKPKTNG), в котором пролиновый остаток (остаток 8 в SEQ ID NO: 14) замещен N-замещенным глициновым (пептоидным) остатком. На панели A показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(S)-(1-фенилэтил)глицином; на панели B показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(4-гидроксифенил)глицином; на панели C показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(циклопропилметил)глицином; на панели D показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(изопропил)глицином; на панели Е показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(3,5-диметоксибензил)глицином; и на панели F показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-бутилглицином.

На фиг.4 показаны результаты экспериментов по вестерн-блоттингу, описанных в примере 2. На дорожках 1 и 2 показано наличие прионных белков в гомогенатах головного мозга нормальных мышей (дорожка 1, помечена «С») и в денатурированных гомогенатах инфицированных мышей (дорожка 2, помечена «Sc»). Дорожки 3, 4 и 5 показывают специфичное связывание описанного здесь пептидного реагента (SEQ ID NO: 68) с патогенными формами приона в присутствии человеческой плазмы. В частности, дорожка 3 представляет собой контроль человеческой плазмы, и дорожка 4 представляет собой образец гомогената головного мозга нормальной мыши. На дорожке 5 показано сильное связывание пептидного реагента PrP^Sc в образцах гомогената инфицированной мыши.

На фиг.5 показаны структуры типовых связанных с ПЭГ пептидных реагентов, как описано выше.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Изобретение относится к удивительному и неожиданному открытию, что относительно малые пептиды (менее 50-100 аминокислот в длину, предпочтительно, менее чем примерно 50 аминокислот в длину и даже более предпочтительно, менее чем примерно 30 аминокислот в длину) могут использоваться для дискриминации между непатогенными и патогенными прионными белками. Таким образом, настоящее описание относится к неожиданному открытию, что данные пептиды и их производные (вместе называемые «пептидными реагентами») могут связываться с патогенными и непатогенными белковыми формами с разной специфичностью и/или сродством и, в соответствии с этим, могут использоваться в реагентах для диагностики/обнаружения или в качестве них, или в качестве компонентов терапевтических композиций. До настоящего описания полагали, что только более крупные молекулы (например, антитела, PrP^C, α-форма rPrP и плазминоген) могут использоваться для различения патогенной и непатогенной форм. Как таковые, ранее описанные антигенные пептиды использовали для получения антител, которые оценивали на предмет их способности различать патогенную и непатогенную формы. Однако вследствие относительно неиммуногенной природы прионных белков оказалось сложной задачей генерировать антитела, специфичные в отношении патогенных форм. См., например, R.A.Williamson et al. "Antibodies as Tools to Probe Prion Protein Biology" in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 717-741.

Открытие того, что некоторые пептиды, описанные здесь, взаимодействуют предпочтительно с патогенными (PrP^Sc) прионными белками, обеспечивает разработку новых реагентов для диагностики, анализов для обнаружения и терапевтических средств, среди прочих. Таким образом, изобретение относится к пептидным реагентам и, кроме того, относится к анализам для обнаружения и диагностическим анализам, использующим данные пептидные реагенты, к способам очистки и выделения, использующим данные пептидные реагенты, и к терапевтическим композициям, содержащим данные пептидные реагенты. Также предоставлены полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты, и антитела, генерированные с использованием данных пептидных реагентов. Пептидные реагенты, полинуклеотиды и/или антитела, описанные здесь, используются в композициях и способах обнаружения патогенного приона, например, в биологическом образце. Кроме того, изобретение далее относится к способам применения таких пептидных реагентов, антител и/или полинуклеотидов в качестве компонента в терапевтической или профилактической композиции.

Пептидные реагенты (и полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты), применяемые по изобретению, включают в себя пептид, который взаимодействует преимущественно с патогенными изоформами, по сравнению с непатогенными изоформами. Например, в некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты специфично связываются с патогенными белковыми формами конформационных заболеваний и не связываются (или связываются в меньшей степени) с непатогенными формами. Пептидные реагенты, описанные здесь (и кодирующие их полинуклеотиды) могут использоваться, например, для получения антител. Данные антитела могут распознавать патогенные формы, непатогенные формы, или оба варианта. Данные молекулы могут использоваться, отдельно или в различных комбинациях, в диагностических анализах и/или в профилактических и терапевтических композициях.

В практике настоящего изобретения, кроме указанных иначе случаев, будут использованы общепринятые способы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, в пределах знания специалиста в данной области. Такие способы полностью объясняются в литературе. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); и Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters and Dalrymple, Fields Virology (2ded), Fields et al. (eds.), B. N. Raven Press, New York, NY.

Понятно, что пептидные реагенты, антитела и способы по данному изобретению не ограничены конкретными препаратами или параметрами способа, поскольку таковые, конечно, могут изменяться. Также следует понимать, что применяемая здесь терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления изобретения, но не для ограничения.

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки включены сюда полностью в качестве ссылки.

I. Определения

Для облегчения понимания изобретения избранные термины, применяемые в заявке, будут обсуждаться ниже.

Термины «прион», «прионный белок», «белок PrP» и «PrP» используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на патогенную форму белка (различно обозначаемую как скрэпи-белок, патогенная форма белка, патогенный прион и PrP^Sc) и непатогенную форму (различно обозначаемую как клеточная форма белка, клеточная изоформа, непатогенная изоформа, непатогенный прионный белок, и PrP^с), а также денатурированная форма и различные рекомбинантные формы прионного белка, которые могут не иметь патогенную конформацию или нормальную клеточную конформацию.

Патогенная форма белка ассоциирована с состоянием заболевания (губчатые энцефалопатии) у людей и животных; непатогенная форма обычно присутствует в животных клетках и может в подходящих условиях преобразовываться в патогенную конформацию PrP^Sc. Прионы продуцируются в природе в различных видах млекопитающих, включая человека, овец, крупный рогатый скот, и мышей. Репрезентативная аминокислотная последовательность человеческого прионного белка приведена в SEQ ID NO: 1. Репрезентативная аминокислотная последовательность мышиного прионного белка SEQ ID NO: 2. Другие репрезентативные последовательности показаны на фиг.2.

Используемый здесь термин «патогенный» означает, что данный белок действительно вызывает заболевание, или он может просто означать, что белок ассоциирован с заболеванием, и поэтому присутствует при наличии заболевания. Таким образом, патогенный белок при использовании термина в связи с данным описанием не обязательно представляет собой белок, котор